Abstract
Mange studier har vist at mengden og dynamikk av sirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod av pasienter plaget med solide tumorer har stor relevans i terapeutisk effekt og prognose. Ulike metoder basert på ulike strategier har blitt utviklet for å isolere og identifisere CTCs, men deres effekt må forbedres på grunn av sjeldenhet og kompleksiteten av CTCs. Denne studien ble utformet for å undersøke muligheten for å bruke en SELEX aptamer (BC-15) som en probe for å identifisere sjeldne CTCs ut fra bakgrunnskjerneinneholdende celler. Aptamer BC-15 ble valgt fra et tilfeldig oligonukleotid-bibliotek screenet mot human brystkreft vev. Fluorescens farging viste at BC-15 hadde en høy affinitet for kjerner av humane kreftcellelinjer av forskjellig opprinnelse, så vel som CTCs isolert fra bukspyttkjertelcancerpasienter, mens dens bindingsevne til ikke-tumor bryst epitelceller og leukocytter var nesten umulig å oppdage. BC-15
+ /CD45
– celler i kreftpasientblod ble også funnet å være cytokeratins 18-positive og aneuploide ved immunofluorescens farging og fluorescens in situ hybridisering, respektivt. Til slutt ble aptamer-metoden sammenlignet med det veletablerte anti-cytokeratin metode med 15 kreft i bukspyttkjertelen pasientens blodprøver, og telling viste ingen forskjell mellom disse to metodene. Vår studie etablerer en ny måte å identifisere CTCs ved hjelp av en syntetisk aptamer sonde. Denne nye tilnærmingen er sammenlignbar med den anti-cytokeratin baserte CTC identifiseringsmetode
Citation. Zhang J, Li S, Liu F, Zhou L, Shao N, Zhao X (2015) SELEX Aptamer Brukes som en Probe å oppdage Sirkulasjonstumorceller i perifert blod av bukspyttkjertelkreft pasienter. PLoS ONE 10 (3): e0121920. doi: 10,1371 /journal.pone.0121920
Academic Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 07.11.2014; Godkjent: 05.02.2015; Publisert: 23 mars 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av High-tech R D Program (No. 2012AA020206 og 2012AA02A503), State sentrale prosjekter til grunnforskning (2011CB910703) og NSFC (30700992, 81372591, 81321091) i Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sirkulerende tumorceller (CTCs) er blitt funnet i det perifere blod hos pasienter rammet av alle de store faste karsinomer [1], og deres antall og variasjon i kreftpasientblod korrelert med tumorutvikling, terapeutisk effekt, tumorresidiv, og langsiktig prognose [2-4]. I tillegg CTC deteksjon gir også en mulig måte for å overvåke pasientrespons på visse anti-cancer-terapier [5, 6]. Mange teknikker har blitt utviklet for å identifisere CTCs hos pasienter med forskjellige typer kreft [7]. Den dominerende strategien utnytter epitelisk opprinnelse CTCs for å fange opp og å identifisere dem ved hjelp av antistoffer som er rettet mot epitel-markører slik som epitelisk celle adhesjonsmolekyl (EpCAM) og cytokeratin (CK) [2]. Imidlertid kan noen CTCs miste sine epitelceller egenskaper på grunn av epitel-mesenchymale overgang (EMT), og dermed kan ikke bli oppdaget av disse antistoffene [8]. Videre disse metodene har problemer med å skille maligne celler fra godartede celler som uttrykker epitelceller markører. Utvikling av nye og mer effektive metoder for CTCs deteksjon er stort behov for.
aptamerer representerer en gruppe av enkelt-nukleinsyre fragmenter som ble screenet mot spesifikke mål fra en tilfeldig syntetisk nukleinsyre bibliotek ved metoden for systematisk utviklingen av ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX) [9, 10]. Man kan også få aptamerer, som spesifikt binder til et molekyl uten å vite dens egenskaper. Aptamerer kan binde seg til mål med høy affinitet via spesifikke strukturelle regioner som er indusert av sekvensavhengig folder [11]. Denne teknikken har blitt anvendt for mange formål, blant annet protein inhibitor utforming, molekylær deteksjon, og terapeutisk legemiddel og antistoff erstatning [7]. I tidligere studie [12], har vi identifisert en svulst bestemt aptamer BC-15 ved hjelp av en ny
in situ
vev slide-baserte SELEX strategi. Aptamer BC-15 har også vist seg å binde seg til flere kreftceller av forskjellig opprinnelse med høy spesifisitet. Gjennom streptavidin magnetiske kuler mediert affinitet rensing analysefulgt av massespektrometri identifikasjon og western blot bekreftelse, ble målet for BC-15 karakteriseres å være heterogene kjernefysiske ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1). De hnRNP familie proteiner spiller viktige roller i biogenesis og transport av messenger RNA. Oppregulering av hnRNPs vanligvis forut morfologisk differensiering og er ansett som en god biomarkør i de tidlige stadier av kreftutvikling [13]. Forbedrede mengder hnRNP A1 har blitt rapportert i mange kreft vev inkludert bryst, og småcellet lungekreft, eggstokkreft, kolorektal karsinom, og kreft i bukspyttkjertelen med en beliggenhet som er hovedsakelig atom [13-16]. Høye nivåer av hnRNP A1 ekspresjon ble også påvist i pankreatiske tumorcellelinjer, mens det i normale primære celler i bukspyttkjertelen hnRNP ekspresjon var umulig å oppdage. Disse resultatene antyder sterkt at hnRNP kan være en god kandidat for diagnose av kreft i bukspyttkjertelen [13]. Derfor aptamer BC-15 kan også benyttes som diagnose biomarkør for flere typer kreft, inkludert pankreatisk kreft på grunn av sin høye spesifikke affinitet til hnRNA A1. Her rapporterte vi muligheten for å bruke en aptamer BC-15 som en probe for å identifisere CTCs i perifert blod hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Materiale og metode
Blood prøvetaking
Denne studien ble godkjent av etiske komiteer av Cancer Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, og informerte skriftlig samtykke ble innhentet fra alle bukspyttkjertelen kreftpasienter og friske donorer. I alt 30 blodprøver ble samlet, inkludert 15 prøver tatt fra bukspyttkjertelcancerpasienter og 15 prøver fra friske donorer. For hver pasient eller frisk donor, perifert blod (7,5 ml) ble trukket fra medianen cubital vein inn syresitratdekstrose vakuumrør (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ) etter forkaste den første 3 ml blod for å unngå epitelcelledifferensiering forurensning under venepunksjon . Alle prøver ble holdt ved romtemperatur og behandlet i løpet av 12 timer etter innsamling. For å unngå skjevhet ble prøver blindt behandlet av forskjellige personer.
SELEX prosedyre
En ny
in situ
vev slide-baserte SELEX strategi ble ansatt for å velge høy affinitet aptamerer . Formalinfiksert, ble parafin-embedded bryst infiltrere duktale karsinomer og tilstøtende normalt vev fra samme pasient brukt som SELEX målet og kontroll hhv. Etter 12 runder med screening, ble BC-15 er valgt for sin høye affinitet for svulstvev spesifikt, noe som også ble bekreftet ved hjelp av cellelinjer. Hele SELEX screening-fremgangsmåte er beskrevet i vår tidligere studie [12]. Den aptamer sonde BC-15 (5′-GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3 «) ble syntetisert og merket med fluorescein-isotiocyanat (FITC) på 5»-enden (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), og en blanding av tilfeldige sekvenser merket samme måte fungerte som en kontroll sonde.
Cell kultur
Menneske kreft PL-45 (ATCC CRL-2558, bukspyttkjertelen adenokarsinom), MCF-7 (ATCC HTB22, bryst adenokarsinom), A549 ( ATCC CCL185, lungekreft), MDA-MB-231 (ATCC HTB-26, metastatisk brystkreft adenokarsinom), HT-29 (ATCC HTB-38, tykktarms adenokarsinom) og MCF10A (ATCC CRL10317, bryst fibrocystic sykdom) cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Alle celler unntatt MCF10A ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Grand Island, NY, USA). MCF10A ble dyrket i DMEM supplementert med 20% føtalt bovint serum, 20 ng /ml human epidermal vekstfaktor (EGF), 10 ug /ml insulin, og 0,5 ug /ml hydrokortison. Alle celler ble inkubert i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C. For fluorescens farging ble over natten dyrkede cellene fiksert i metanol ved -20 ° C i 2 timer og vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4), og deretter ble cellene farget med aptamer, som beskrevet i det følgende avsnitt.
berikelse og identifisering av CTCs
CTCs berikelse metoden var lik de tidligere publiserte metoder [17]. I korte trekk ble 7,5 ml perifert blod som er samlet i en vakutainer rør vasket med PBS en gang, og deretter røde blodceller ble lysert med lyseringsbuffer (150 mM NH
4Cl, 10 mM NaHCO
3, og 0,1 mM EDTA). Reaksjonsblandingen ble spunnet ned ved 300 x
g
i 5 minutter ved romtemperatur. Den resulterende cellepellet ble resuspendert i PBS og deretter inkubert med 0,1 ml anti-CD45- antistoff-belagte magnetiske kuler (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av separering ved hjelp av et magnetisk stativ (Promega, Madison , WI, USA). Supernatanter ble overført til et sentrifugerør, etterfulgt ved spinning ved 500 x
g
i 3 minutter ved romtemperatur. Hver celle pellet ble resuspendert i PBS og droppet likt på to lysbilder (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), air tørket, og deretter utsatt for flekker.
CTCs var identifisering av BC-15 aptamer eller anti -CK farging. For BC-15, ble objektglass fiksert med metanol i 30 minutter ved -20 ° C, etterfulgt av penetrering med 0,1% (w /v) Tween 20 i PBS ved romtemperatur i 15 min. Etter blokkering med buffer (0,1 mg /ml tRNA, 0,1 mg /ml laksesperm DNA, 1% BSA og 0,02% (w /v) Tween-20 i PBS) ved 37 ° C i 20 min, ble objektglassene inkubert med 10ug /ml FITC-merket BC-15 i blokkeringsbuffer ved 37 ° C i 1 time. Anti-CK CTC identifikasjon ble utført som beskrevet i mange studier [2, 7, 18]. I korthet objektglass ble fiksert med paraformaldehyd i 40 minutter, etterfulgt av 0,1% (w /v) Triton X-100 penetrasjon og 2% BSA blokkering, og deretter inkubert med FITC-merket anti-CK (Miltenyi Biotec, 1: 1000 fortynning i PBS ), som gjenkjenner CKs 8, 18, og 19, ved romtemperatur i 1 time. Alexa 594 merket anti-CD45 (Miltenyi Biotec, 1: 1 000 fortynning i PBS) ble anvendt til co-fargingseksperimenter med BC-15 eller anti-CK som en negativ seleksjonssignal. Etter inkubering ble objektglass vasket med PBS og deretter montert med 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) -inneholdende monteringsmedium (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Da objektglass ble underkastet analyse med et Nikon Eclipse 80i fluorescens mikroskop. Celler som møtte følgende kriterier ble vurdert som CTCs: cellestørrelse 4 um i diameter, intakte med rund-til-oval morfologi med en DAPI-farget kjerne, og positive for CK eller BC-15 farging og negativ for CD45 [18] .
Aneuploid kromosomanalyse ved hjelp av fluorescens
in situ
hybridisering (FISH)
kromosom oppregning sonder (CEP) 8 (Vysis, Des Plaines, IL, USA) ble denaturert i hybridiseringsbuffer (0,15 M natriumklorid, 0,015 M natriumcitrat, 70% formamid) ved 73 ° C i 5 min. Proben ble deretter inkubert med et lysbilde i et fuktet kammer ved 42 ° C over natten, etterfulgt av vasking med 0,3% (vekt /volum) NP-40 i 0,4x saltvann-natriumcitrat (SSC, 1 x SSC inneholdende 150 mM NaCl og 15 mM na
3Citrate) ved 73 ° C i 2 minutter og med 2 x SSC /0,1% NP-40 ved romtemperatur i 30 sek. Etter kort tørking ble lysbilder analysert etter montering med DAPI montering medium (Vector Labs) under fluorescens mikroskop.
Statistisk analyse
Forskjellen mellom disse to identifiseringsmetoder ble evaluert av SPSS 19 (IBM, Armonk , NY, USA) programvare med Wilcoxon Signed rangeringen test og korrelasjonen mellom BC-15 og anti-cytokeratin resultatene ble vurdert ved den ikke-parametriske Spearmans rho verdi. En
P
-verdi av. 0,05 ble sett som det statistisk signifikans
Resultater
BC-15 binder seg til kjernen av humane tumorceller spesielt
Vår tidligere studie viser at BC-15 kan binde seg til brystkreft celler og vev med høy affinitet, mens dens bindingsevne for ikke-tumorigene celler og normale bryst vev er mye lavere; i tillegg til fluorescens farging, bekreftet strømningscytometrisk at BC-15 har høy affinitet for tumorceller [12]. For å validere bindingen av BC-15 på andre steder enn brystcancer-celler tumorceller, ble et sett av humane kreftceller farget med BC-15 (fig. 1). BC-15 signaler akkumulert hovedsakelig i kjernen av kreftceller, men var mye lavere i udødeliggjorte epitelceller bryst MCF10A celler. Ingen positive signaler ble observert i noen celler når farging med en tilfeldig kontroll aptamer probe. Dette observasjoner foreslått at BC-15 bindes utelukkende til kjernen av kreftceller.
Celler ble farget med FITC-merket BC-15 aptamer (Øvre rad) eller FITC-merket tilfeldig kontroll aptamer (Middle rad, grønn). Alle cellene ble telleren farget med 0,25% Evans blue i 10 minutter for å avsløre hel-celle-morfologi (rød). Nedre rad viser CK immunfluorescens farging av ulike typer kreftceller. Disse dyrkede celler ble trypsinert, slippes på de belagte glassplater, etterfulgt av farging med Alexa 594 merket anti-CK18 antistoff, og teller farget med DAPI. PL45, bukspyttkjertelen adenokarsinom celle; MCF-7, brystkreft celle; A549, lungekreft celle; MDA-MB-231, brystkreft celle; HT-29, colon adenokarsinom celle; MCF10A, ikke-tumorer immortaliserte mammary epitelceller. Scale bar, 20 pm.
BC-15
+ celler i pasienten perifert blod er også CK-positive
Gitt at BC-15 har en høy og spesifikk affinitet til CK -positive cancerceller av ulik opprinnelse (fig. 1 og 2A fig.), farget vi pasientprøver med BC-15. Morfologien av BC-15
+ celler er vist i fig. 2B. BC-15-signaler ble observert utelukkende i cellekjernene, som er lik den tidligere beskrevne mønstre i humane kreftceller og vev. Videre, de aller fleste av BC-15
+ celler var CD45
– og BC-15 binding til leukocytter (CD45
+) ble ikke påvist (Fig 2B og 2C.). Kreft i bukspyttkjertelen PL-45 celler og noen bukspyttkjertelkreft pasientprøver, som farget positivt med anti-CK, ble deretter re-farget av BC-15. Som vist på fig. 2B, BC-15 og CK signaler falt godt i både PL-45 celler (øverste rad) og CTCs fra bukspyttkjertelkreft pasientprøver (nedre rad). Deretter var fisk eksperimenter med CEP8 utføres for å verifisere aneuploid karakter av BC-15
+ celler. Som vist på fig. 2D, BC-15
+ /CD45
– celler var unormal i kromosom 8 opplisting, mens de hvite blodcellene (CD45
+) i bakgrunnen var diploid for kromosom 8. Foruten single og doublet CTCs, tumorcelle-lymfocytt blandede grupper ble også påvist med BC-15 (fig 2C.); slike grupper har vist seg å være en mer nøyaktig prognostisk faktor for metastaser sammenlignet med tilstedeværelsen av enkelt sirkulerende tumorceller [17].
(A) BC-15
+ (grønn) og CK18
+ (rød) signaler falt sammen i både PL-45 celler (øverste rad) og CTCs fra bukspyttkjertelen kreftpasienter (nederste rad). (B) Morfologi av spredt CTCs fra bukspyttkjertelen kreftpasienter som er identifisert ved immunfluorescens farging. CTCs ble demonstrert som CD45
-cellene med BC-15
+ kjerner (grønn) og pilene i bunnen bilder av panel A .indikatorer de hvite blodcellene (CD45
+, rød). (C) Gruppert CTCs anerkjent av BC-15 i blodprøver fra bukspyttkjertelen kreftpasienter. Hvite piler indikerer leukocytter (CD45
+). (D) Immunofluorescensanalyse av en BC-15
+ celler (bemerket av gul pil) ble slukket og det samme lysbildet ble utsatt for fiske med CEP8 sonde. BC-15
+ celle hadde en kromosom 8 avvik (7 eksemplarer), mens bakgrunnen leukocytt var diploide for kromosom 8 (hvit pil). Cellen indikert med grønn pil ble ikke klassifisert som CTC på grunn av sin positivitet for både BC-15 og CD45. Skala barer, 10 um.
BC-15 har den samme effektivitet som anti-CK8 /18/19 for å identifisere CTCs
anti-CK-baserte immunfarging er en etablert metode for å detektere CTCs i mange systemer og viser relativ tilfredsstillende konsistens og repeterbarhet i ulike typer kreft typer [19]. De ondartede karakteristikker av CK
+ celler har også blitt påvist av fisk med ulike CEP sonder. For å sammenligne CTC identifikasjon kapasitet av BC-15 med det anti-CK metoder, 15 perifere blodprøver fra bukspyttkjertelcancerpasienter (tabell 1) og 15 fra friske donorer ble samlet. Cellene anriket fra disse prøvene ble delt likt og farget ved siden av hverandre ved hjelp av disse to metodene. Hverken fremgangsmåten detekteres positive celler i prøvene fra friske donorer. Av de 15 pasientene prøvene, 12 (80,0%) hadde positive celler i henhold til den anti-CK-metoden, mens den positive hastigheten var 73,3% (11/15) ved hjelp av BC-15 farging. Det gjennomsnittlige antall positive celler detektert ved hjelp av anti-CK eller BC-15-farging var henholdsvis 25,7 og 19,1 per prøve. Ingen statistikk forskjell ble funnet mellom CTC oppregning resultatene av de to metodene ved Wilcoxon Signed Ranks test (
P
= 0,699), og det var signifikant korrelasjon mellom resultatene av disse to forskjellige CTC deteksjonsmetoder med Spearmans rank korrelasjon test (Spearmans rho = 0,810,
P
0,01)
Diskusjoner
Som et surrogat for primær eller metastatiske svulster, CTCs viser stadig større betydning både i. kreftforskning og klinisk praksis, og CTC deteksjon har fått forsterket interesse innenfor kreftforskning samfunnet. I denne studien, opprettet vi et CTC detection system som kombinerer en leukocytt uttømming berikelse strategi og BC-15 aptamer identifikasjon. Dette påstand støttes av følgende observasjoner: (1) BC-15 gjenkjent av ulike typer tumorceller spesifikt, og ikke-tumorigene epitelceller og leukocytter var negative for BC-15 fuktighet; (2) BC-15 hadde den samme fargingsmønster i BC-15
+ /CD45
– celler anriket fra bukspyttkjertelkreft pasientblod som i kreftceller og tumorvev; (3) BC-15
+ celler i kreftpasienter blod var CK
+ [20]; (4) BC-15
+ /CD45
– celler i blod fra kreftpasienter viste Aneuploidy, en cytogenetisk abnormitet typisk av ondartede celler; og (5) CTC identifikasjon effekten av BC-15 var tilsvarende som for anti-CK metoder.
På grunn av deres heterogeneic egenskaper og mesenchymale-epitel overgang i omløp, CTCs kan ikke være fullt nummerert av antistoffer som målrette epiteliale markører (f.eks anti- CK) [21]. Imidlertid aptamerer kunne utvikles for å gjenkjenne subtile egenskaper og /eller lav-immunogene molekyler av maligne celler. Våre foreløpige resultater presentert her viser at det er mulig å bruke en aptamer som en CTC deteksjon sonde og også gi perspektiver som ville gjøre CTC deteksjon mer tilpasset og personlig. Selv om våre forsøksresultater viser ingen forbedring på effekten av CTC identifikasjon sammenlignet med antistoffbaserte metoder, holder aptamer sonden store løftet for CTCs deteksjon (både isolasjon og identifikasjon) på grunn av dets evne til å binde til ulike typer molekylære mål, høy affinitet veldefinert syntese /modifikasjonsprosessen, stabilitet og ensartethet. Videre, basert på den velutviklede celle /vev-SELEX teknikk, er det mulig å generere spesielle aptamerer med høy stabilitet ved å bruke tumorceller eller tumorvev fra en gitt pasient som valg av mål [22]. Disse personlige aptamerer kan delvis overvinne svakheten oppdratt av ensartede antistoffer [23] og kan brukes som veiledning molekylære målretting terapi eller brukes til å overvåke behandlingsrespons og forutse langsiktige prognosen [22].
Takk
forfatterne ønsker å takke Nathan Ungerleider som hjalp i det engelske språket redigering av dette manuskriptet.
