Abstract
Exosomes proteiner og microRNAs har fått mye oppmerksomhet som diagnostiske verktøy og biomarkør potensial i forskjellige maligniteter inkludert prostatakreft (PCA). Imidlertid er rollen til exosomes og membran-assosierte reseptorer, spesielt epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) som mediatorer av celleproliferasjon og invasjon i PCa progresjon forblir uoppdaget. EGFR er ofte overuttrykt, og har vært forbundet med aggressive former for PCa. Mens PCA celler og vev uttrykker EGFR, er det ukjent om exosomes avledet fra PCA celler eller PCa pasientserum inneholder EGFR. Målet med denne studien var å påvise og karakterisere EGFR i exosomes avledet fra PCA celler, LNCaP xenograft og PCa pasientserum. Exosomes ble isolert fra kondisjonert medium forskjellige PCA cellelinjer; LNCaP xenograft serum, så vel som pasientens plasma /serum ved differensiell sentrifugering og ultrasentrifugering i en sukrose-tetthetsgradient. Exosomes ble bekreftet ved elektronmikroskopi, uttrykk for exosomal markører og NanoSight
™ analyse. EGFR-ekspresjon ble bestemt ved western blot analyse og ELISA. Denne studien viser at exosomes kan lett bli avledet fra PCA-cellelinjer, serum erholdt fra PCa xenograft bærende mus og kliniske prøver avledet fra PCA pasienter. Tilstedeværelse av exosomal EGFR i PCA pasient exosomes kan presentere en ny tilnærming for måling av sykdomstilstanden. Vårt arbeid vil tillate å bygge videre på dette funnet for fremtidig forståelse av PCA exosomes og deres potensielle rolle ved PCA progresjon og som minimale invasive biomarkører for PCa
Citation. Kharmate G, Hosseini-Beheshti E, Caradec J, Chin MY, Tomlinson Guns ES (2016) epidermal vekstfaktor reseptor i prostatakreft Avledet Exosomes. PLoS ONE 11 (5): e0154967. doi: 10,1371 /journal.pone.0154967
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 9. januar 2015. Godkjent: 21 april 2016; Publisert: 06.05.2016
Copyright: © 2016 Kharmate et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. EG mottatt støtte fra Terry Fox Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest største dødsårsaken blant vestlige menn. Bevart aktivitet av androgen reseptoren er den viktigste driveren for PCa progresjon og metastase [1, 2]. Tidlig stadium PCa er herdbart imidlertid en tredjedel av tilfellene utvikle seg til en mer aggressiv PCa med dårlig pasientoverlevelse [3]. Til tross for tilgjengeligheten av flere terapeutiske strategier, rettet mot metastaser og administrere sykdom tilbakefall er fortsatt en utfordring. Derfor er vellykket tidlig deteksjon av PCa av stor betydning. Bortsett fra de mest brukte diagnostiske prosedyrer /tester som prostataspesifikt antigen (PSA) testing og digital rektal undersøkelse [4], er fortsatt et kritisk behov for oss å oppdage nye biomarkører og utvikle en mer følsom ennå minimalt invasive tester for bedre og tidlig diagnose av PCa.
Det er økende bevis som tyder på at kreftcellene slipper mikrovesikler av 30-100 nm i diameter kjent som «
exosomes «
, og at exosomes er lett finnes i biologiske væsker, inkludert plasma, serum, ondartede ascites, urin og morsmelk [5, 6]. Exosomes stammer fra slutten endosomes kjent som muitivesikulære organer (MVBs) og er utgitt på fusjon av MVBs med plasmamembranen [7]. Exosomes inneholde unikt protein og RNA last som blir sluppet inn i det cellulære mikromiljø og kan således fremme celle-celle-kommunikasjon i tillegg til andre mekanismer [8, 9]. Nylig har vår lab og andre vist at godartet samt PCA celler med eller uten androgen reseptor (AR) slipper exosomes [9, 10]. I tillegg er en omfattende lipid og proteomikk analyse viste tydelige forskjeller i protein profiler av exosomes avledet fra godartet sammenlignet med ondartede cellelinjer PCA [9, 11, 12]. Studier har vist at exosomes inneholde membranassosierte proteiner som virker som mediatorer for cellevekst og egnet til å gi celle fenotypisk endring via celle-celle-kommunikasjon [13-15]. Imidlertid er rollen til komponent membran-assosiert vekstfaktorreseptorer av exosomes som mediatorer av celleproliferasjon og invasjon forblir uoppdaget.
I tillegg til androgener, er prostata vekst og funksjon in-part regulert av flere vekstfaktorer og deres beslektede reseptorer, er en av de som epidermal vekstfaktor og dens reseptor (EGFR) [16, 17]. EGFR er et 170 kDa proto-onkogen og transmembrane reseptor som typisk er over-uttrykt i forskjellige maligniteter, inkludert PCa [18]. Ligand-binding til EGFR induserer dimerisering, fosforylering og internalisering av EGFR, som deretter utløser et nettverk av intracellulære signalveier, noe som resulterer i DNA-syntese, celleformering, migrering og adhesjon [18]. Det har vist seg at nesten 30% av tilfellene PCA overuttrykke EGFR, og at deregulering av EGFR-medierte signalbaner som er forbundet med dårlige kliniske resultater [19, 20]. Selv om EGFR er identifisert som et viktig antitumormålet, har terapier mot EGFR ved hjelp av små tyrosinkinase-inhibitorer så som Gefitinib, Lapatinib og erlotinib vist seg å ha begrenset effektivitet i PCa [21-23]. Mens den intracellulære menneskehandel, resirkulering og nedbrytning av EGFR har blitt grundig undersøkt, er svært lite kjent om hvorvidt EGFR rømming lysosomal degradering og blir i stedet selektivt utgitt ekstracellulært via exosomes.
In vitro
studier har nå vist at exosomes isolert fra immune celler og kreftceller inneholder EGFR, EGFR-ligander og oppløselige isoformer av EGFR. I tillegg tumorceller frigjør exosomes og /eller exosomal last inn i blodsirkulasjonen til kreftpasienter [24-29]. Disse observasjonene har ført oss til hypoteser som EGFR kan selektivt frigitt via exosomes og kan godt spille en rolle ved PCA progresjon. Videre kan muligheten for at den selektive opptaket av EFGR inn i exosomes kan være, i det minste delvis, ansvarlig for svikt i klinisk resultat ikke oppheves, har imidlertid ingen komparativ analyse mellom exosomal innholdet og tumorcelle blitt gjort i dette manuskriptet. For å avgjøre om PCa avledet exosomes inneholde EGFR, vi isolert og karakterisert exosomes fra et panel av PCA celler samt serum fra LNCaP xenopodet mus og serum /plasma fra PCA pasienter. Dette er en første rapport som viser at EGFR er inneholdt i exosomes avledet fra PCA-cellelinjer, både LNCaP xenograft og PCa pasientserum. Disse observasjonene er oppmuntrende å ytterligere undersøke hvilken rolle EGFR-holdige exosomes i pro-overlevelse og behandlingsresistensmekanismer samt potensielle biomarkører ved PCA diagnose og progresjon.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Frozen PCa pasient plasma /serum ble kjøpt fra en privat blod og vev depot, Bioserve Global Biorepository, 9000 Virginia Manor Road, Suite 207 Beltsville, MD 20705 USA (https://www.bioserve.com/human-samples /global-biorepository-overview.cfm). Kontrollen serum ble hentet fra 31 år gammel frisk mann frivillig med et muntlig samtykke godkjent av Etisk Råd (sertifikat # H09-01010). The University of British Columbia Klinisk forskningsetiske Board (sertifikat # H09-01010) godkjent bruken av kommersielt kjøpt human serum som skal brukes til formålet med denne forskningen.
godkjenning for dyr arbeidet ble innhentet fra universitetet of British Columbia Institutional Animal Care komité (IACC, # A11-0337). I løpet av studien omsorg, bolig og bruk av dyr ble utført i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care retningslinjer og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cell Culture
Menneskelig prostatakreft celler, LnCap [30] og c4-2-celler ble holdt i RPMI 1640 medium, mens DU145 og PC3 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 5% FBS (Invitrogen) og antibiotikum, ved 37 ° C i 5% CO2. Godartede RWPE-1 celler ble også dyrket i keratinocyte-SFM (KSFM) med vekst supplement (GIBCO) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen). Celler ble dyrket til 60-70% konfluens og serum-sultet i 48-72 timer før exosomes isolasjon. Alle cellelinjer ble erholdt fra ATCC.
Serumprøver
Mus som bærer LnCap xenotransplantater ble fremstilt som tidligere beskrevet [31, 32]. Kort sagt ble atymiske mus inokulert med 2 x 10
6 LNCaP-celler. Svulster ble dyrket i 28 dager etter som serum ble avledet fra blod trukket av hjertestans punktering på euthanisation. Serumprøver ble samlet av fra tre nakne kontroll mus og tre mus med ulike størrelser av svulster: liten ( 400mm
3); medium (400-1000mm
3) og stor (mer enn 1000 mm
3). Frozen PCa pasient plasma /serum ble kjøpt fra en privat blod og vev depot, Bioserve (Beltsville, MD, USA). Fire humane plasma og tre serumprøver oppnådd fra PCA-pasienter (tabell 1) ble analysert i denne studien. Kontrollserum ble oppnådd fra to 31 år gamle friske mannlige forsøkspersoner. Godkjenning ble innhentet fra The University of British Columbia Klinisk forskningsetiske Board for human serum som skal brukes til formålet med denne forskningen
Antistoffer
Antistoffene som ble brukt var:. Mus anti- CD-9 (C-4, # sc-13118), mus anti-Alix (1A12, # sc-53540) og geit anti-EGFR (N-20, # sc-31155) fra Santa Cruz Biotechnology Inc, (Santa Cruz , CA); kanin anti-LAMP2 (# ab37024) fra Abcam (Toronto, ON) og kanin anti-GRP94 (# 2104) fra Cell Signaling Technology (Whitby, ON). Alle primære antistoffer ble anvendt ved en konsentrasjon på 1: 1000 for western blot analyser. De sekundære antistoffer som brukes for deteksjon var Alexa Mel 680 esel anti-kanin (# A10043, 1: 10000), esel anti-mus (# A10038, 1: 10000) og esel anti-geit (# A21084, 1: 10000) fra Life Technologies (Invitrogen), Burlington videre.
Utarbeidelse av exosomes fraksjoner
exosomes fra PCA-celler ble isolert ved hjelp av seriesentrifugeringsmetoden som tidligere beskrevet [9]. Frosset plasma /serum eller LNCaP xenograft pasientserumprøver ble fortynnet med fosfatbuffer saltvann (PBS) i et 1: 1 forhold [33]. Plasma /serumprøver ble deretter forbehandlet med anti-IgG-antistoff (1: 500 fortynning) koblet til A /G sefarose perler (25 ul) for å utfelle overdreven ikke-spesifikke immunglobuliner. Etter en inkubering over natten ved 4 ° C, ble de for-behandlede prøver ble sentrifugert ved 5000X
g
i 15 minutter og den pre-erte serum ble anvendt for exosomes isolering ved anvendelse av en standard ultrasentrifugemetoden tidligere rapportert [9, 33 ]. I korthet, den pre-erte serumprøver gjennomgikk en serie av sentrifugeringstrinn (2000x
g
i 20 minutter og 20,000x
g
i 45 minutter) og deretter overført til 30% sukroseløsning, etterfulgt av ultrasentrifugering ved 110,000x
g
i 2 timer. Isolerte exosomes ble gjenvunnet fra sukrose løsning og lagret ved -80 ° C inntil videre analyser.
Transmission elektronmikroskopi (TEM)
Exosomes isolert fra LNCaP xenograft serum og PCa pasient plasma /serum var absorbert på gløden utladet 300 mesh formvar /karbon-belagt TEM nett (Ted Pella, Redding California, USA) i 5 min. Prøvene ble negativt farget med 2% vandig uranylacetat i 5 minutter og observert med et Hitachi H7600 TEM drevet ved 80kV (Hitachi Høy Technologies Corp., Tokyo, Japan). Bilder ble tatt med en sidemontert 1K AMT Advantage digitalkamera (Avansert mikroskopi teknikker, Corp. Woburn, MA, USA) [9].
NanoSight
™ partikkel sporing analyse
størrelse og konsentrasjon av de isolerte exosomes ble analysert ved hjelp av NanoSight
™ LM10-HS10-system (NanoSight Amesbury, UK) som nylig beskrevet [34]. Hver exosomes prøven ble fortynnet i exosomes frie pre-filtrert PBS for å oppnå målbare konsentrasjon mellom 0,5 × 10 8
og 5 × 10
9 partikler /ml. For analyse ble en monokromatisk laserstråle (405nm) brukes på de fortynnede plasma exosomes som ble injisert i en LM12 visning enheten med en kontrollert sprøyte system laser. NanoSight
™ sporing analyse (NTA) programvareversjon 2.3 analyserte prøvene ved en konstant temperatur (25 ° C) med kameraet lukkertid på 60 millisekunder og gevinst satt til 1400. NTA programvare produsert seks videoer av 60 sekunders varighet, med en 5 sekunders forsinkelse mellom de opptakene som skaper seks replikate histogrammer som ble gjennomsnitt av for å gi det endelige estimat av partikkelstørrelse og konsentrasjon av exosomes. NTA innstillinger var pre-optimalisert og holdes konstant mellom prøvene.
Western blot analyse
Exosome prøver ble behandlet i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer for å frigjøre exosomal innhold. Proteinkonsentrasjonen ble deretter målt ved hjelp av BCA Protein Assay kit i henhold til produsentens instruksjoner (Thermo Scientific Pierce). Lik mengde protein (30μg) ble applisert for hver prøve på en 10% SDS-PAGE-gel. Exosomal markørene ble identifisert ved hjelp av primære antistoffer som er spesifikke for lysosomal-assosiert membranprotein-2 (lampe-2) (1: 1000), CD-9 (1: 1000) og Alix (1: 1000). Uttrykket av EGFR i exosomes avledet fra PCA cellelinjer så vel xenograft eller humant plasma /serum ble oppdaget ved hjelp av geit anti-EGFR antistoff som gjenkjenner EGFR av menneskelig og mus opprinnelse.
ELISA for EGFR deteksjon
EGFR-nivåer i exosomes isolert fra LNCaP xenograft og pasientens plasma /serum ble bestemt ved anvendelse av EGFR ELISA-sett (Sigma Aldrich, # RAB0160) i henhold til produsentens protokoll. Frysetørket humant EGFR-protein standard, hel plasma /serum og exosomes prøver ble tilsatt til 96-brønns plate som var forbelagt med anti-humant EGFR-antistoff i 2,5 timer ved RT. RWPE-1 cellelysat ble anvendt som positiv kontroll. Biotinylert EGFR-antistoff ble tilsatt i 1 time ved RT følgende vaskinger. HRP-streptavidin ble så inkubert i 45 min. ELISA Colorimetric 3,3 «, 5,5-tetra-methylbenzidine (TMB) ble tilsatt i 30 minutter i mørket og 0,2 M svovelsyre (stopp-løsning) ble tilsatt umiddelbart for å stoppe reaksjonen på hvilken gulfarvet produkt ble målt ved 450 nm ved hjelp av en automatisert ELISA-leser (Rayto, RT-1904C Chemistry Analyzer, Atlanta GA, USA) ved 450 nm. Resultatene representerer mengden av EGFR i ubehandlet plasma og renset exosomes som ng /ml. Analysen ble gjentatt to ganger, og med hver prøve in triplo.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism 6,0. Forskjellen mellom exosomal EGFR i PCA pasienter og kontrollpersoner ble analysert ved å anvende studentens t-test. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
Resultater
Tre ganger berikelse av exosomes ved PCA pasientserum enn friske kontroller
Karakterisering av exosomes isolert fra LNCaP xenopodet museserum og PCa pasient plasma /serum ble utført ved hjelp av TEM, NanoSight
™ og Western blot analyser, kollektivt. TEM analyser avslørte et flertall av vesikler i 100 nm størrelsesområde som var karakteristisk for exosomes, i henhold til deres klassiske koppformet morfologi, i representative c4-2 PCA-celler, LNCaP xenograft serum, så vel som PCa pasientserum (figur 1). Tilstedeværelsen av exosomes ble ytterligere bekreftet ved hjelp NanoSight
™ -teknologi som nylig beskrevet [34]. Figurene 2 og 3 viser profiler av NTA exosomes med en enkelt topp som representerer modus størrelse på exosomes (85-150nm), i henhold til størrelsen av exosomes rapportert rutinemessig i litteraturen. Det ble observert at den totale konsentrasjon av exosomes avledet fra kontrollmusene serum var 1,98 x 10
11 partikler /ml (figur 2A). Interessant antall partikler økte i serum avledet fra mus med små (2,2 x 10
11, figur 2B), middels (3,98 x 10
11 Fig 2C) og store (6,66 x 10
11 Fig 2D) svulster som tyder på at exosomes er mer rikelig i tumorbærende mus enn de normale mus. Videre har vi målt antall exosomes fra serum avledet fra kontroll human og PCA pasienter. Fig 3A viste at kontroll humant serum inneholdt 4,15 x 10
11 partikler /ml, mens PCa pasient plasma (13,3 x 10
11) og serum (9,9 x 10
11) viste to-fold økning i antall av partikler som indikerer at svulstcellene produsere flere exosomes enn de normale celler (figur 3B og 3C). Den NanoSight analysert mellom 3000-4000 partikler og derav SEM var lav mellom ± 0,12 til 0,35.
Representant TEM bilder av exosomes avledet fra a) C42 PCa cellelinje b) LNCaP xenograft serum og c) pasient plasma etter ultracentrifugation metode. Exosomes ble negativt farget med 2% uracyl acetat etter fjerning av fuktighet. Pilene viser koppformede strukturer som er identifisert som exosomes (30-100 nm i diameter).
Analysen viste det at størrelsen på exosomes isolert fra kontroll mus var 126 nm (a) mens LNCaP xenopodet mus med liten svulst var 81nm (b), 137 nm fra medium (c) og 67 nm fra store svulster (d). Konsentrasjonen av exosomes utskilt øker med økende størrelse av tumoren.
NTA profiler av exosomes viser en enkelt topp som representerer midlere partikkelstørrelse og konsentrasjon av exosomes fra normal gjenstand (a) og pasient plasma ( b) og serum (c). Den midlere partikkelstørrelse ~ 120nm nm bekreftet tilstedeværelsen av exosomes. Exosomes avledet fra PCa pasient var betydelig høyere enn kontrollen humant serum.
Identifikasjon av markører bekrefte exosomes isolert fra serum
Western blot analyser ble utført for å bestemme ekspresjon av exosome-spesifikk markører. Som vist i figur 4A, CD-9 (tetraspanin), en vanlig brukt membranbundet exosomal markør var høyere i serum fra små LnCap xenotransplantater, sammenlignet med den i exosomes fra kontroll naken mus. Interessant, vi fikk ikke se en signifikant høyere uttrykk i de store svulster. Disse data også korrelert med NanoSight data (Fig 2) som viser høyere antall exosomes i serum fra tumorbærende mus enn kontrollmuseserum. For ytterligere å bekrefte renheten av exosome fraksjoner oppnådd, har vi fastslått at tilstedeværelsen av en kjent endoplasmatiske retikulum markør GRP94 i exosomes isolert fra xenograft serumprøver. Våre data viste mangel på GRP94 i exosome fraksjoner, som indikerer vellykket berikelse og isolering av exosomes fra serumprøver via sukrose-assistert ultrasentrifugering. Ekspresjonen av lysosomal-assosiert membranprotein-2 (lampe-2) og Alix ble også undersøkt som en alternativ exosome markør. Fig 4B og 4C viste at LAMP-2 og Alix ble oppdaget ved PCA serum /plasma avledet exosome fraksjoner og var konsentrasjonsavhengig. Mens hele plasma var blottet for LAMP-2, igjen indikerer kvaliteten på exosomes beriket for under isolasjon.
a) CD9 var til stede i exosomes avledet fra LNCaP xenograft mus med små, mellomstore og store LNCaP svulster mens kontroll musserum manglet CD9. GRP94, en kjent endoplasmatiske retikulum-protein som blir brukt som en negativ kontroll var fraværende i exosomes tyder anrikning b) LAMP2 var til stede i exosomes avledet fra PCa pasientplasma, mens fravær av LAMP2 i hel plasma angitt vellykket anrikning. c) Alix var til stede i exosomes avledet fra pasient plasma ved ulike exosomal proteinkonsentrasjoner.
PCa avledet exosomes inneholde EGFR
EGFR er en potent celle regulator forbundet med avansert PCa progresjon. Vi neste fastslått om PCA celler og serum avledet exosomes inneholde EGFR. Fig 5A viser en annerledes ekspresjon av full-lengde 170kDa EGFR i totale cellelysater samt exosomes fraksjoner avledet fra et panel av AR-positive (LNCaP, c4-2, RWPE-1) og AR-negative (DU145, PC3) cellelinjer . Totalt sett, tilstedeværelse av EGFR i totale cellelysater er høyere enn sine motstykker exosome, mens celle-stammer exosomes viser variabelt EGFR-innhold for forskjellige cellelinjer. Vi neste fastsatte tilstedeværelsen av EGFR i
in vivo
prøver. Exosomes fra kontrollmus serum viste ingen EGFR exosomes imidlertid isolert fra serum fra LNCaP xenotransplantater inneholdt EGFR uavhengig av tilstedeværelsen av tumor og tumorstørrelsen (figur 5B).
EGFR var til stede i exosomes avledet fra a) panel av AR -responsive og AR-ikke reagerer, så vel som godartet prostata epitelceller (RWPE-1) og sammenlignet med cellelysat, b) kontrollere naken mus og LNCaP xenograft serum. c) EGFR finnes i exosomes avledet fra fire forskjellige PCA pasientenes plasma (1-4), 3 serumprøver (5-7) og styrer faget og i ubehandlet plasma fra kontroll emne og pasient (1 og 2). d) Ekspresjon av EGFR ved 170kDa og 110kDa i serum og plasma øker med økende lasting proteinkonsentrasjon. Interessant er det en betydelig mengde av EGFR i ubehandlet plasma som er i tillegg til den exosomal fraksjon. Histogrammet (e) viser EGFR nivåer (ng /ml) målt ved ELISA i ubehandlet plasma fra kontroll emne og PCa pasient plasma /serum og exosomes avledet fra tilsvarende plasma /serum. Nivåene av serum EGFR er relativt like i kontroll- og PCA fag, mens exosomes isolert fra PCa pasientserum inneholdt signifikant høyere mengder av EGFR enn kontrollen faget. Dataene representert som gjennomsnitt ± SEM, * p. 0,05
For å validere den kliniske relevansen av exosomal EGFR, vi undersøkt om exosomes isolert fra PCa pasient plasma /serum inneholdt EGFR. Western blot analyser viste påvisbare nivåer av en full-lengde 170kDa EGFR i to av fire exosome fraksjoner av PCA pasientens plasma og alle tre serumprøver, mens exosomes fra kontrollprøvene var negative for EGFR (Fig 5C). Som vist i figur 5D, exosomes inneholdt EGFR på en konsentrasjonsavhengig måte. Mer interessant, de ubehandlede hele serum viste også betydelige nivåer av EGFR som tyder på nærvær av løselige formen EGFR sirkulerte i serum hos PCA pasienter som tidligere er rapportert for kreft i bukspyttkjertelen pasientserum i en studie utforske exosomes i serum fra denne pasientpopulasjonen [35] . Videre ble EGFR nivåer påvist i hele plasma /serum og exosomes avledet fra PCA pasienter og kontroll lagt ved hjelp av ELISA-analysen (figur 5E). ELISA måling viste at løselige EGFR nivåer i pasientens plasma eller serum var ikke bemerkelsesverdig annerledes enn kontrollserum; Men EGFR nivåene var signifikant høyere i exosomes avledet fra PCA pasienters plasma /serum sammenlignet med kontroll emnet.
Diskusjoner
Exosomes sirkulerer i blodet kan gi viktig informasjon som kan ofte neglisjert i prognostiske evalueringer. Vår lab nylig publisert en omfattende proteomikk og lipid analyse av exosomes avledet fra PCA celler
in vitro
med sikte på å gi innsikt i kandidat protein biomarkører som exosomes har potensial til å gi [9]. Vi har også etablert en reproduserbar metode for isolering og kvantifisering av exosomes fra humant serum [34]. Utgivelsen av exosomes i blod, urin og andre biologiske væsker gir dermed en mulighet til å utnytte ikke-invasive metoder for prognostisk og diagnostisk evaluering av PCa hos pasienter. Dette arbeidet, med fokus på relevansen av EGFR i PCA beskriver isolering og karakterisering av exosomes avledet fra
in vitro
,
in vivo Hotell og kliniske PCA prøver som en forlengelse av vårt tidligere arbeid ved PCA cellelinjer [9] [34].
Vårt studium viser nærværet av EGFR i exosomes renset fra PCA-celler dyrkes
in vitro
, serum fra LNCaP xenograft bærende mus og PCa pasientserum. Flere rapporter har indikert tilstedeværelse av EGFR i exosomes avledet fra glioblastom, bukspyttkjertelen, brystkreft og eggstokkreft cellelinjer
in vitro Hotell og i exosomes fra lungekreft pasienten serum, men begrenset er kjent av EGFR ved PCA avledet exosomes [ ,,,0],36-39]. EGFR er ofte over-uttrykt og er assosiert med avvikende signalisering fører til aggressive ondartede sykdommer og dårlig pasientoverlevelsesrate [40]. I PCA er hyperaktivitet av EGFR knyttet til androgen uavhengighet og metastasering av prostata kreft celler [41, 42]. Siden exosomes er involvert i celle-celle-kommunikasjon som endrer fenotypen av mottaker /target-celler [43-45], exosomal-EGFR uttrykkes ved hjelp av forskjellige tumortyper, inkludert PCa kan spille en viktig rolle i progresjon av kreft. Vi har observert at antall exosomes var signifikant høyere i PCa serum og xenograft enn kontrollen, noe som tyder på at exosomes kan utgjøre et redskap for å differensiere normale og sykdomstilstanden. Våre resultater er i samsvar med en fersk studie av Turay et al hvor de viser at exosome tall økte spesielt i serum fra PCA pasienter sammenlignet med sine kontroll kolleger [46]. Tumor-exosomes er tenkt å ha rolle i utviklingen av resistens mot anti-tumor terapi [47, 48]. Men mens pre-kliniske data indikerer at EGFR spiller en betydelig rolle ved PCA progresjon [21]; kliniske studier med EGFR-hemmere (Gefitinib, lapatinib eller Erlotinib) har vist begrenset nytte til PCA pasienter [22, 23, 49].
Løselig isoformer av EGFR (sEGFR) har også blitt identifisert i kondisjonert medium for brystkreft, ikke-småcellet lungekreft og kreft i bukspyttkjertelen celler samt sirkulerer i blodet [35, 50, 51]. Det er imidlertid begrenset informasjon om den mekanistiske rolle og biokjemiske egenskapene til disse isoformer. Det er dokumentert at full lengde EFGR gjennomgår proteolytisk spalting og romanen isoformer [52, 53]. Videre, en full-lengde reseptor og en 65kDa løselig isoform har blitt identifisert på exosomes frigjøres fra menneskelige keratinocyte cellelinjer [50]. På samme måte, observerte vi en full lengde 170kDa EGFR og et bånd ved 110kDa i pasientens plasma og serum-avledet exosomes som tyder på at oppløselige isoformer av EGFR kan være til stede i exosomes i tillegg til den 170kDa EGFR. Interessant, i PCA cellelinjer og LnCap xenograft bærende museserum slike bånd ikke ble observert. Vår observasjon er støttet av en lignende studie i brystkreftceller og pasientserum som spekulerer i nærvær av løselige vekstfaktorer som sirkulerer i pasientserum [54]. Vi har også oppdaget et band ved 110kDa i pasientens plasma /serum som kunne være fri løselig isoform av EGFR. Tidligere rapporter som viser løselig EGFR protein i serum hos pasienter med metastatisk brystkreft og lungekreft kunne støtte våre resultater [39, 54]. Selv i brystkreftpasienter, ble de løselige EGFR-isoformer assosiert med kort overlevelse, innebære noen økt sEGFR eller ingen forskjell mellom friske personer og pasienter [39]. Likevel kan estimering av sEGFR nivåer i exosomes og perifert blod gi klinisk relevans i metastatisk kreft. EGFR-isoformer som er tilstede i PCa pasientserum åpenbart ha en uidentifisert rolle i tumorigenese og ytterligere kvantitative analyser er nødvendig for evaluering av disse isoformer ved PCA-avledede exosomes. Oppsummert viser denne undersøkelsen exosomes er rikelig utskilles i serum hos mus som har svulster xenopodet og PCA-pasienter enn sine motstykker kontroll. Videre denne studien identifisert EGFR i skilles exosomes og gir overbevisende bevis for at sirkulerende EGFR kan være konstituerende i exosomes og videre evaluering av exosomes EGFR ved PCA pasientserum kan identifisere sin rolle i motstanden av EGFR målrettede terapier testet i klinikken mot PCa progresjon ( skjematisk representasjon av rollen til EGFR som vist i figur 6).
Ligand-binding induserer rask aktivering og internalisering av EGFR og endocytose. Enten EGFR rømming lysosomal degradering og er utgitt ekstracellulært via exosomes er ukjent. Overføringen av EGFR via exosomes kan betydelig endre svulsten mikromiljøet og kan være relevant for utviklingen av en aggressiv PCa.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Sjekkliste. NC3Rs ANKOMMER Retningslinjer Sjekkliste
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154967.s001 plakater (docx)
S1 Fig. Western blot analyse som viser CD9 uttrykk i exosomes avledet fra LNCaP xenograft mus med små, mellomstore og store LNCaP svulster mens kontrollgruppen museserum manglet CD9
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154967.s002 plakater (TIF)
S2 fig. . Western blot vise full uncropped gel av GRP94
Den exosomes manglet tilstedeværelsen av GRP94 bekrefter isolasjon vellykket
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154967.s003 plakater (JPG)
Takk til
Vi erkjenner støtte fra Terry Fox Foundation for lønn støtte som gjorde gjennomføringen av arbeidet rives.
