Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte menneskelig dødsfall. Utforskning av mekanismene bak metastasering av kreft stamceller lignende celler (CSLCs) vil åpne nye veier i lungekreft diagnose og terapi. Her viste vi at CSLCs-avledet fra lunge adenokarsinom (LAC) celler vises svært invasive og trekkmuligheter via uttrykker høye nivåer av POU5F1 og MMP-2. Vi fant ut at POU5F1 direkte regulert MMP-2 transkripsjon via interaksjon med arrangøren av MMP-2. POU5F1 knockdown i LACSLCs redusert MMP-2 protein overflod, som fører til hemming av celle invasjon, migrasjon og tumorigenesis potensialer av LAC celler. Klinisk, abnormt høye uttrykk for POU5F1 og MMP-2 ble omvendt korrelert med overlevelsen av LAC pasienter, og dobbel-positive POU5F1 og MMP-2 viste den verste prognose for pasientens dårlig overlevelse. Disse resultatene indikerer at POU5F1 kan binde til MMP-2 promoteren for nedbrytning av omgivende ekstracellulær matriks, og dermed fremme invasive og trekkende egenskapene til LACSLCs. Videre våre data implisere at patologisk påvisning av dobbel-positive uttrykk for POU5F1 og MMP-2 vil være nyttig som diagnostiske og prognostiske biomarkører i LAC å fremme anti-metastaser terapi
Citation. Xin Yh, Bian BSJ, Yang Xj, Cui W, Cui Hj, Cui Yh, et al. (2013) POU5F1 Forbedrer Invasivitet av kreft Stilk-lignende celler i Lung Adenocarcinoma ved oppregulering av MMP-2 Expression. PLoS ONE 8 (12): e83373. doi: 10,1371 /journal.pone.0083373
Redaktør: Persio Dello Sbarba, Università degli Studi di Firenze, Italia
mottatt: 15 juli 2013; Godkjent: 01.11.2013; Publisert: 30.12.2013
Copyright: © 2013 Xin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (973 Program, Grant No.2010CB529403), National Natural Science Foundations of China (Grant No.81272598) og Kina Postdoktor Science Foundation (Grant No.2012T50852). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er de viktigste årsakene til menneskelig dødsfall på verdensbasis [1]. Til tross for store fremskritt i lunge kreftbehandling, metastasering og behandlingssvikt ofte resultere i tilbakefall og høy dødelighet. En mulig årsak underliggende terapisvikt og menneskelig dødsfall er tilstedeværelsen av gjenværende ondartede celler som til slutt gir opphav til sekundære svulster og metastaser [2].
Opp til dato, samler bevis har blitt fremvoksende som en liten populasjon av celler besitter tumor initiere aktivitet i lungekreft og er betegnet som » kreft stilk-lignende celler (CSLCs) » [3], [4]. Tilstedeværelsen av en liten subpopulasjon av CSLCs kan forklare hvorfor så mange lungekreft gjenta seg etter behandling med kirurgi, kjemoterapi og radioterapi, selv om de fleste av de maligne cellene ser ut til å bli drept etter behandling [5], [6]. Derfor er det viktig å avdekke de biologiske egenskaper og molekylære mekanismer for initiering og progresjon av CSLCs for utviklingen av nye behandlingsformer. Tidligere opprettet vi en
in vitro
sfære kultur system for å isolere og berike «lunge adenokarsinom kreft stamceller-lignende celler» (LACSLCs) og avslørte at POU homeobox genet familie transkripsjonsfaktor POU5F1 (også kjent som Oct4) fungerer som en viktig regulator for oppbevaring av selvfornyelse og tumorigenicity av LACSLCs [7].
POU5F1 er nødvendig for å opprettholde selvfornyelse av embryonale stamceller (ES) celler, og bidrar til stemness, tumorigenesis og metastasering av CSLCs [8] – [10]. Det har nylig blitt rapportert at POU5F1 fremmer invasjon og metastasering av noen faste tumorer gjennom økt nedbrytning av omgivende ekstracellulær matriks, hvilket antyder at denne transkripsjonsfaktor kan være nyttig som et potensielt terapeutisk mål for kreft og en ny tumor biologisk og prognostisk markør [11], [12]. Men mekanismene for avvikende POU5F1 uttrykk i lungekreft underliggende invasjon og metastase forblir unnvikende.
I denne studien, viste vi at POU5F1 uttrykket var forbundet med invasjonen og migrasjon av LACSLCs og utforsket de underliggende molekylære mekanismene. Den kliniske betydningen av POU5F1 og matriksmetalloproteinase 2 (MMP-2) uttrykk i pasienter med lunge adenokarsinom (LAC) ble også undersøkt.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble strengt gjennomført i samsvar med anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Third Military Medical University. Humane primære LAC prøvene ble høstet med pasienten samtykke. Hver deltaker i denne studien ble informert skriftlig samtykke. Humane primære LAC prøver ble høstet og protokollen ble godkjent av Medical Ethics Committee of Southwest Hospital of the Third Military Medical University. Animal eksperimentelle protokoller ble utført i samsvar med National Institutes of Health Sciences og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Third Military Medical University.
Cell kultur
Menneskelig ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje A549 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) og dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin (Gibco, USA) i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO
2 atmosfære. Tumor sfære kultur ble utført som beskrevet tidligere [4], [13] – [15]
Lentiviral shRNA, siRNA konstruksjon og transfeksjon
Lentiviral konstruerer og primere rettet mot menneskelige Pou5f1 kort hårnål sekvenser. ble utformet og utarbeidet av Sunbio Medisinsk bioteknologi (Shanghai, Kina). De shRNA ekspresjonsvektorer lentivirus vektorer ble preparert ved transient transfeksjon av lentivirale konstruksjonene inn i 293T-celler til å produsere virus. Den resulterende lentiviral POU5F1-shRNA og kontroll-shRNA ble brukt til å infisere A549 celler. En kontroll-shRNA er designet av mutasjon av antisense nukleotider i POU5F1 shRNA sekvens. De plasmidkonstruksjoner som bærer et siRNA sekvens rettet mot MMP-2 ble utformet og konstruert som tidligere beskrevet [16]. Transfections ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
In vitro
sårtilheling analysen
Confluent celler ble såret ved hjelp av en 200- ul pipettespiss i seks-brønners kulturplater og inkuberes i DMEM med 5% eller 10% føtalt bovint serum i nærvær eller fravær av mitomycin C (10 ug /ml). Såret bredde ble fotografert på 0h, 16h og 24h post-scratch under et fasekontrastmikroskop. Migrasjons avstandene ble målt og kvantifisert som tidligere beskrevet [12]. Den dataassistert bilde programmet ble brukt til å kvantifisere celle migrasjon i forhold til nettet kantlinje.
In vitro
invasjonen assay
Celle invasiv kapasitet ble bestemt i en 24 -Vel format ved hjelp Transwell® setter inn med 8 mikrometer porestørrelse, belagt med Matrigel® (BD Biosciences, USA) som beskrevet tidligere [17]. Tumor sfærer ble trypsinert, resuspendert i serumfritt DMEM-medium, og som er lagt inn i de øvre kamrene i Transwell® innsatser (5 x 10
4 /brønn), og DMEM-medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt til de nedre kamre. Cellene ble tillatt å invadere gjennom membranen i 24 timer og deretter fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS. De ikke-invasive celler i forkamrene ble tørkes av med en bomullsdott og invasive celler ble farget med krystallfiolett løsning. Antallet av celler som hadde invadert til den nedre overflate av innsatsene ble tellet under et lysmikroskop.
tumorgenisitet analyse
in vivo
For muse xenotransplantater, tilhenger A549 monolag celler og kreftkuler ble dissosiert å få encellede suspensjoner. Et likt antall celler (5 × 10
5) ble fortynnet i serumfritt DMEM medium og injisert subkutant til fire ukers gammel mann naken mus (
n
= 5 hver, Center of forsøksdyr , Third Military Medical University, Kina). Mus ble overvåket ukentlig for utseendet av subkutane tumorer. Ved slutten av 7 uker ble alle musene avlivet og tumor engrafts ble fjernet og målt. Tumor volum (TV) ble beregnet ved hjelp av følgende formel: TV (mm
3) =
d
2 ×
D Twitter /2, der d og D representerer den korteste og de lengste diameter, henholdsvis. I tillegg ble tumorvevet fiksert i bufret formalin, og deretter utføres for å tumorhistologi og immunhistokjemisk analyse.
Kvantitativ Sanntids-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra kreftceller bruker Trizol Reagens (Invitrogen, USA). QRT-PCR ble utført ved anvendelse av SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara, Japan) på en Rotor-Gene 6000 sanntids genetisk analysator (Corbett Life Science, USA). Primerne anvendt for PCR-amplifikasjon av interne fragmenter av MMP-2 er oppført som følger: 5′-CCACTGCCTTCGATACAC-3 «(sense); 5»-GAGCCACTCTCTGGAATCTTAAA-3 «(anti-sense). Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble amplifisert som en intern kontroll. Hver prøve ble testet i hvert fall i tre paralleller.
Western blot analyse
Cellelysater av A549 monolagcellene og kreftkuler ble tilberedt med RIPA buffer med proteasehemmere og kvantifisert ved hjelp av BCA proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). Proteinprøver (20 ug) ble fylt på en 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, USA). Immunkomplekser ble dannet ved inkubasjon av mus monoklonalt antistoff MMP (1:400; Abcam, USA), kanin-polyklonalt antistoff POU5F1 (1:500; BD Biosciences, USA) og kanin-polyklonalt antistoff Actin (1:5000; Abcam, USA) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer mot mus eller kanin IgG (1:5000; Invitrogen, USA). Immunreaktivt protein ble visualisert ved hjelp SuperSignal West Femto Trial Kit (Pierce, Rockford, IL) med et forbedret kjemiluminescens deteksjon system.
Chromatin immunoprecipitation (chip)
ChIP analysen ble utført med en chip-IT sett i overensstemmelse med produsentens protokoll. Ultralyd skjærforhold resulterte i relativt uniformerte DNA fragment i størrelsen på ~300 bp. De resterende fremgangsmåter ble utført som beskrevet tidligere [7]. Genomisk DNA ble ekstrahert fra bunnfallet og amplifisert ved QRT-PCR. Primerene anvendt for PCR for å amplifisere MMP-2 promoter region inneholdende POU5F1 bindende element var:. 5′- CATGACAACAGGCTTTGGATTAG-3 «(sense) og 5′- AACAAACTCTTAGGCAACGAACC -3» (anti-sense)
Immunhistokjemi (IHC)
Immunhistokjemisk farging av tumorvev og xenografter ble utført på prøver ved hjelp av streptavidin-biotin peroksidase kompleks (SABC) -metoden. Kort sagt ble xenograft prøvene fiksert i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 72 timer og innstøpt i parafin. De parafinsnitt ble inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Glassene ble deretter omsatt med biotinylert geite-anti-mus /kanin-IgG og avidin-biotin kompleks (ABC) (Beyotime, Kina). For visualisering av antistoff-antigen-kompleks, ble kromogen reaksjon utført med diaminobenzidin (DAB) og objektglassene ble undersøkt under et lysmikroskop. For kvantifisering, IPP-programvare (bilde-pro pluss 6,0) ble brukt til å analysere optisk tetthet av bildene innen 5 tilfeldige felt på 400 × forstørrelse. Den gjennomsnittlige optiske tetthet (AOD), nemlig IOD /areal, ble beregnet.
Transfeksjon og luciferase reporter assay
Konstruksjon og forbigående transfeksjon av ildflue luciferase reporter plasmid ble utført som tidligere beskrevet [18] . Sekvensen til pGL3-MMP-2 promoteren konstruksjonen ble bekreftet (Sunbio Medical Biotechnology, Kina). Den shRNA-Control og shRNA-Pou5f1-infiserte A549 LACSLCs ble sådd i 24-brønners plater (1 × 10
5 i hver brønn). Etter 24 timer ble cellene ko-transfektert med pGL3-MMP-2-promoteren og Renilla vektor (PRL-TK: Promega, USA). Cellelysater ble oppsamlet ved 48 timer etter transfeksjon og den relative luciferase reporter-enzym-aktivitet ble målt ved bruk av dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, USA). Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferaseaktivitet for hver prøve.
Tissue microarray (TMA) analyse
I alt 55 pasienter med primær LAC som fikk kirurgisk reseksjon ble inkludert. Tumor karakterer ble definert i henhold til kriteriene for Verdens helseorganisasjon. Den Tumor-Node-metastaser (pTNM) status for alle Lacs ble vurdert i henhold til kriteriene i den sjette utgaven av TNM klassifisering av International Union Against Cancer [19]. De klinisk-patologiske karakteristika for pasientene ble sammenfattet i tabell 1. TMA ble konstruert som tidligere beskrevet [20].
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført minst tre ganger i tre paralleller. Resultatene ble angitt som middelverdi ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse SPSS13.0 programvare. Statistisk signifikant forskjell ble bedømt ved en-veis analyse av varians (ANOVA), fulgt av multiple sammenligninger ved midlere Student-Newman-Keul test. Statistisk forskjell ble betraktet som signifikant hvis
P
-verdi var mindre enn 0,05.
Resultater
LACSLCs vise vandrende og invasive evner
I vår studie, vi etablert et stabilt sfære kultur system for å isolere og berikende LACSLCs å belyse deres biologiske atferd. Som vist i figur 1, A549-celler som var dyrket i SFM med EGF og bFGF ble generert ikke-klebende, multi-cellulær sfære LACSLCs (figur 1A), og disse sfære LACSLCs vist meget inngripende og trekkende evner
in vitro
(Figur 1B og C) og
in vivo plakater (figur 1D). Resultatene av
in vitro
sårhelende analysen viste at kula LACSLCs migrert inn ripete området raskere enn A549 monolagcellene. Videre resultater fra en
in vitro
Matrigel invasjonen assay viste at A549 LACSLCs vises høyere invasiv kapasitet enn A549 monolagcellene (137,5 ± 17,7 versus 49,7 ± 9,2 invadere celler /felt). Videre A549 LACSLCs viste høyere tumorigenicity
in vivo
som førte til større tumorxenotransplantater med forbedret invasjon aktivitet (figur 1D). Samlet er disse resultatene indikerer at LACSLCs er svært trekkfugl og invasiv
in vitro Hotell og
in vivo
.
(A) Morfologi av kule-LACSLCs avledet fra lungekreft A549 celle linje. Representative bilder fra lysmikroskopi (monolagcellene 10 ×, LACSLCs 20 ×) er vist. (B) sårtilheling assay for celle migrasjon av A549 LACSLCs og A549 monolagcellene. Representative bilder av celle migrasjon inn i såret området på 0 og 16 timer etter skade (
venstre panel
) vises. Kvantitativ analyse viser sår reparasjon evne trekkende celler i 16 timer etter skade (
høyre panel
). (C) sammenligning av invasiv evne i A549 LACSLCs og monolagsceller detekteres av transwell-analyse. Representative bilder av invaderende celler visualisert ved krystallfiolett farging (20 ×) (
venstre panel
). Kvantitativ analyse av celle invadere kapasitet på 24 timer etter såing (
høyre panel
). (D) Histologiske bilder av H E flekker under lett mikroskopi. Svulster dannet av A549 LACSLCs var meget inngripende og kreftceller invadert nabomuskellaget (røde piler, 20 ×). Alle forsøk ble utført i det minste i tre paralleller, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Student
t
testen ble utført for å evaluere forskjellen.
POU5F1 og MMP-2 er abnormt høyt uttrykt i LACSLCs
For å belyse den underliggende mekanisme for de høye trekkende og invasive egenskapene til LACSLCs, undersøkte vi stamcelletranskripsjonsfaktor POU5F1 og sink protease for nedbrytning av ekstracellulær matrix MMP-2. Farging (figur 2A) og western blot (figur 2B) analyser viste at MMP-2 og POU5F1 ble abnormt høyt uttrykt i A549 LACSLCs. Dessuten immunhistokjemisk analyse viste at ekspresjonsnivået av MMP-2 i tumorvev, som er dannet av A549 LACSLCs var høyere enn for tumorer dannet av A549 monolagsceller (figur 2C). Sammen er disse resultatene tyder på at de abnormt høye uttrykk for POU5F1 og MMP-2 kan spille en viktig rolle i reguleringen av celle trekkende og invasive egenskapene til LACSLCs.
(A) Farging av POU5F1 og MMP-2 observert av konfokal scanning mikroskopi. (B) Uttrykk for stamcelletranskripsjonsfaktor POU5F1 ble oppdaget av Western blot. (C) Immunhistokjemisk analyse av MMP-2-protein i tumorvev, som er dannet av A549 LACSLCs og monolagsceller. Representative bilder av MMP-2 uttrykk ved IHC farging (20 ×) (
venstre panel
). Kvantitativ analyse av MMP-2 proteinnivåer i tumorvev, som er dannet av A549 LACSLCs og monolagsceller. Alle forsøk ble utført i det minste i tre paralleller, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Student
t
testen ble utført for å evaluere forskjellen.
POU5F1 knockdown forstyrrer celle invasjon, migrasjon og tumorigenesis potensialer av LACSLCs
For å bekrefte den hemmende effekten av POU5F1 downregulation på celle invasjon og migrasjon, undersøkte vi om knockdown av POU5F1 kunne redusere trekkende og invasive potensialene LACSLCs. Som vist i figur 3, inneholdende LACSLCs shRNA-Pou5f1 migrerte mye langsommere enn kontrollcellene (figur 3A og B). A549 LACSLCs med POU5F1 knockdown resulterte i betydelig redusert antall invaderer celler gjennom Matrigel til det nedre kammeret sammenlignet med shRNA-Control-infiserte A549 LACSLCs (Figur 3C og D). Videre svulstene dannet av A549 LACSLCs med POU5F1 knockdown var mye mindre enn kontrollcellene (figur 3E), og viste redusert invasjonen i muskellagene. Disse resultatene tyder på at høyere trekkende og invasive egenskapene til LACSLCs resultat av abnormt høy ekspresjon av POU5F1. Videre fant vi at celle invasjon og migrasjon evner ble betydelig hemmet etter MMP-2 knockdown i LACSLCs (figur 3F og G).
(A) Representative bilder av sårheling assay for celle migrasjon av shRNA-kontroll eller shRNA-Pou5f1 innført A549 LACSLCs. (B) Kvantitativ analyse av sår reparasjon evnen til A549 LACSLCs inneholder shRNA-kontroll eller shRNA-Pou5f1 på 24 timer etter seeding. (C) Representative bilder av invaderende celler som inneholder shRNA-kontroll eller shRNA-Pou5f1 visualisert ved krystallfiolett farging (20 ×). (D) Kvantitativ analyse av invasiv evne A549 LACSLCs inneholder shRNA-kontroll eller shRNA-Pou5f1. (E) Kvantitativ analyse av xenograft tumor volum dannet av A549 LACSLCs inneholder shRNA-Control eller shRNA-Pou5f1. (F) Kvantitativ analyse av sår-reparasjon evne til A549 LACSLCs innehold siRNA-kontroll eller siRNA-MMP-2 etter 24 timer etter såing. (G) Kvantitativ analyse av invasiv evne til A549 LACSLCs innehold siRNA-kontroll eller siRNA-MMP-2. Alle forsøkene ble utført i det minste i tre paralleller, og data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Student
t
testen ble utført for å evaluere forskjellen.
POU5F1 knockdown undertrykker uttrykk og aktivitet av MMP-2
Siden POU5F1 og MMP-2 er betydelig oppregulert i LACSLCs, ville det være av interesse å undersøke forholdet mellom disse to molekyler involvert i celle invasjon og migrasjon evner. Som vist på figur 4A og B, QRT-PCR og western blot analyse viste at mRNA og proteinnivåene til MMP-2 ble markert redusert i A549 LACSLCs innehold shRNA-Pou5f1. ChIP analyse viste at POU5F1 bundet til MMP-2 promoter, noe som tyder på at POU5F1 kan være ansvarlig for transkripsjonen aktivering av MMP-2 (figur 4C). Videre knockdown av POU5F1 redusert luciferaseaktiviteten av en reporter konstruksjon inneholdende MMP-2-promoteren (figur 4D) i betydelig grad. Våre resultater viser at POU5F1 i LACSLCs regulerer MMP-2 uttrykk ved direkte rettet mot MMP-2 transkripsjon.
(A) QRT-PCR analyse av MMP-2 mRNA uttrykk i A549 LACSLCs etter POU5F1 knockdown. (B) POU5F1 knockdown senker protein ekspresjon av MMP-2 i A549 LACSLCs påvist ved western blot-analyse. (C) ChIP analyse av transkripsjon faktor POU5F1 binding til MMP-2 promoter. (D) luciferase reporter forsøk viser inaktivering av MMP-2-promoteren etter POU5F1 knockdown i A549 LACSLCs. Cellene ble transient transfektert med et luciferase reporter-konstruksjonen ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens. Etter inkubering i 24 timer, ble cellene høstet i passiv lyseringsbuffer, og luciferase-aktivitet ble målt ved hjelp av et luminometer hjelp av luciferase analysesystemet. Alle forsøkene ble utført i det minste i tre paralleller, og data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Student
t
testen ble utført for å evaluere forskjellen.
POU5F1 og MMP-2 er korrelert med overlevelsen av LAC pasienter
clinicopathological korrelasjoner med uttrykkene både POU5F1 og MMP2 ble undersøkt på en TMA inneholder 55 lunge adenokarsinom prøver å belyse deres foreninger med overlevelsen av LAC pasienter (tab 1). Ved å bruke de betingelser som beskrevet tidligere, ble høye uttrykk for POU5F1 (figur 5A) og MMP-2 (figur 5B) observert i 26 (47,3%) og 39 (70,9%) av 55 lunge adenokarsinom prøvene hhv. Vi fant at høy uttrykk for POU5F1 korrelert med en stigende patologisk node (PN) scenen for lunge adenokarsinom (
P
= 0,042).
(A) og (B) Kaplan-Meier analyse av korrelasjonene av POU5F1 og MMP-2 med dårlig sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) i 55 LAC pasienter. (C) Den kombinerte ekspresjon av POU5F1 og MMP-2 indikerer dårlig DSS for LAC pasienter. Double positivt uttrykk for POU5F1 og MMP-2 viser dårligere prognose for pasientens dårlige overlevelsesraten (
P
0,001). Gp0: POU5F1 (lav uttrykk) og MMP-2 (lav uttrykk); Gp1: POU5F1 (høy uttrykk) eller MMP-2 (høy uttrykk); GP2: POU5F1 (høy uttrykk) og MMP-2 (høy uttrykk)
Etter univariat analyse, høye uttrykk for POU5F1 og MMP-2 ble korrelert med dårlig sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) av pasientene (.
P
= 0,001,
P
= 0,073), henholdsvis. Videre stratifisert vi pasientene inn i tre undergrupper i henhold til ovennevnte to ugunstige faktorer,
dvs., Etter Gp0, GP1 og GP2. Som vist i figur 5C, var median overlevelse var den lengste i Gp0 versus den korteste en på GP2 (dvs., 80.09 måneder for Gp0, 66,8 måneder for GP1, og 38,1 måneder for GP2, henholdsvis, (
P
.. 0.001) (figur 5C) Kaplan-Meier analyse viste en betydelig innvirkning på prognostiske parameter tumorstadium (
P
= 0,013) på DSS
Diskusjoner
CSLCs har tidligere blitt omtalt i de ulike kreftformer og viste seg å spille viktige roller i kreft initiering, utvikling og tilbakefall, samt kreft terapeutiske feil [21] – [24] til dags dato, er lite kjent om de invasive og trekk fenotyper og deres regulatoriske. mekanismen for CSLCs. i denne undersøkelsen, fant vi at transkripsjonsfaktor POU5F1 var nødvendig for LACSLCs invasjon og migrering, og det kan forbedre MMP-2-ekspresjon ved direkte rettet mot MMP-2 promoter for å initiere transkripsjon. Videre har abnormt høye uttrykk for både POU5F1 og MMP-2 er korrelert med overlevelse av pasienter med LAC.
det er velkjent at POU domenet transkripsjonsfaktor POU5F1 spiller en sentral rolle i reguleringen av pluripotency egenskaper i begge somatiske stamceller og CSLCs [8] [25]. Nylig har det blitt rapportert at POU5F1 induserer CSLCs egenskaper og bidrar til tumorgenese og metastase i LAC [9]. Men mekanismene bak de invasive og trekk potensialer av CSLCs gjenstår å bli belyst. Her fikk vi bekreftet at LACSLCs avledet fra A549 celler besitter svært invasive og trekkende evner, og disse cellene uttrykte høye nivåer av POU5F1 og MMP-2. MMP-2 og andre medlemmer av matriksmetalloproteinaser familien er kjent for å mekle invasjon under utvikling og metastasering, og regnes også som mulige tumormarkører for kliniske applikasjoner. [26] – [28]. MMP-2 degraderer ekstracellulære matriks og frigjør lagret pro-trekkende faktorer for å tillate bevegelse av cellene i vev [29]. Imidlertid har MMP-inhibitorer vist seg å være utilfredsstillende i kliniske studier på grunn av enten mangel på selektivitet overfor MMP eller utseende av alvorlige bivirkninger [16], [30]. Målet spesifikke genet Slå av MMP-2 uttrykk studie viser effekten av siRNA-MMP-2 i begrenser LACSLCs invasjon og migrasjon, noe som tyder på at MMP-2 kan fungere som en potent adjuvant for gen-rettet behandling i LAC.
de høye uttrykk nivåer av MMP har blitt observert i blæren kreftceller som overuttrykker POU5F1, noe som tyder på at overekspresjon av POU5F1 oppregulerer gener av MMP [11]. Våre data indikerer at både POU5F1 og MMP-2 kan bidra til startfasen og invasjon-metastasering fenotype av lungekreft. Vi viste at protein ekspresjon av MMP-2 ble signifikant redusert i LACSLCs etter POU5F1 knockdown etter shRNA-strategi. Videre Chip og luciferase-analysene viste for første gang at uttømming av POU5F1 med shRNA forårsaket transkripsjonen nedregulering av den endogene MMP-2-genet og en MMP-2 promoter-reporter, noe som tyder på at MMP-2 er en direkte transcriptional mål av POU5F1 i LACSLCs . Våre funn støtter ideen om at nødvendig og tilstrekkelig tiltak for POU5F1 i direkte aktivering uttrykket av spesifikke målgener for å fremme LACSLCs invasjon og migrasjon. Det er også mulighet for at POU5F1 kan undertrykke visse gener, særlig i tilfeller der det kan binde samarbeide med andre transkripsjonsfaktorer med undertrykkelse aktivitet for å forbedre celle invasjon og migrasjon, og dette kan forklare sin tilknytning corepressor komplekser.
Siden patogenesen og biologiske atferd i ulike undergrupper av lungekreft er ganske tydelig, det haster med å utforske de avanserte diagnostiske metoder og nye prognose markører for ulike undergrupper av lungekreft for å forbedre effekten av kreftbehandling. Våre funn som POU5F1 kan positivt regulerer MMP-2 uttrykk for å fremme tumorcelle invasjon og migrasjon av LACSLCs har viktige kliniske implikasjoner. Selv om vi ikke observere en positiv uttrykk kobling mellom POU5F1 og MMP-2 ble høyere uttrykk av hvert molekyl signifikant assosiert med dårlig prognose, som er konsistent med tidligere studier som POU5F1 og MMP-2 ble rapportert å bli uavhengige risikofaktorer for dårlig prognose i lungekreft [14], [31] – [33]. Enda viktigere, vi her bestemt for første gang at kombin overekspresjon av disse to molekyler som er presentert i verste dårlig prognose av LAC pasienter, noe som tyder på at ekspresjon av POU5F1 og MMP-2 gir en fordel for kreftceller for å opprettholde invasjon og migrering eiendom i LAC . Således kan den kombinerte patologisk undersøkelse av POU5F1 og MMP-2 av IHC bli brukt som et verktøy for å identifisere de LACS med høye nivåer av CSLCs for å tilveiebringe en sterk prediktiv biomarkør i klinisk behandling av LAC-pasienter.
i konklusjonen, viser vår studie at POU5F1 og MMP-2 bidrar til tumorinvasjon og migrasjon fenotype av LACSLCs, og abnormt høy uttrykk for POU5F1 kan forbedre MMP-2 uttrykk ved direkte rettet mot arrangøren av MMP-2. Videre viser vi at kombinert overekspresjon av POU5F1 og MMP-2 er korrelert med dårlig overlevelse av pasienter med LAC. Våre funn tyder på at POU5F1 er nødvendig for å kontrollere celle invasjon og migrasjon via direkte regulering av MMP-2 i lungekreft, og støtter ideen om at POU5F1 og MMP-2 vil være nyttig som potensielle biomarkører for prognose og nye mål for lunge Caner terapi.
takk
Vi takker Miss Wen-juan Fu og Miss Qing Liu (Institute of Pathology og Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, Kina) for deres teknisk assistanse.
