Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) har den tredje høyest dødelighet blant den amerikanske befolkningen. Ifølge den nyeste konseptet med kreftutvikling, er humane tumorer organisert hierarkisk, og toppen av det er okkupert av ondartede stamceller (kreftstamceller, cscs eller kreftfrem initiere celler, CICS), som besitter ubegrenset selvfornyelse og tumor -initiating kapasitet og høy motstand mot konvensjonell terapi. For å gjenspeile kompleksiteten og mangfoldet av menneskelige svulster og for å gi klinisk og fysiologisk relevant kreft modeller, store bredden av karakteriserte pasient avledet lav passasje cellelinjer, og spesielt CIC-beriket cellelinjer, er sterkt behov.
hovedfunnene
Her rapporterer vi etablering av en ny CIC-beriket, svært tumorigent og klonogene tykktarmskreft cellelinje, CR4, utvunnet av levermetastaser. Denne stabile cellelinjen ble etablert ved å kombinere 3D dyrking og 2D dyrking i stamcelle media, subkloning av celler med særlig morfologi, co-kultur med kreft assosiert fibroblaster (kafeer) og serie transplantasjon å nikke /SCID-mus. Ved hjelp av RNA-Seq fullstendig transkriptomet profilering av tumorgene fraksjon av CR4-celler i forhold til bulk-tumorceller, har vi identifisert omtrent 360 differensielt uttrykte transkripsjoner, mange av dem representerer stemness, pluripotency og resistens mot behandling. Flertallet av de etablerte CR4 celler uttrykker felles markører stemness, inkludert CD133, CD44, CD166, EpCAM, CD24 og Lgr5. Ved hjelp av immunocytokjemisk, FACS og western blot analyser, har vi vist at en betydelig forholdet av CR4-celler uttrykker viktige markører for pluripotency markører, inkludert Sox-2, Oct3 /4 og c-Myc. Konstituerende overaktivering av ABC transportører og NF-kB og fravær av tumor suppressors p53 og p21 kan delvis forklare eksepsjonell legemiddelresistens av CR4 cellene.
Konklusjoner
Den svært tumorigent og klonogene CIC-beriket CR4 cellelinje kan gi et viktig nytt verktøy for å støtte oppdagelsen av nye diagnostiske og /eller prognostiske biomarkører samt utvikling av mer effektive terapeutiske strategier
Citation. Rowehl RA, Burke S, Bialkowska AB, Pettet DW III, Rowehl L, Li E, et al. (2014) Etablering av Highly Svulst Menneskelig tykktarmskreft cellelinje (CR4) med egenskaper av mulige kreftstamceller. PLoS ONE 9 (6): e99091. doi: 10,1371 /journal.pone.0099091
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 10 januar 2014; Godkjent: 10 mai 2014; Publisert: 12 juni 2014
Copyright: © 2014 Rowehl et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Fusion TRO tilskuddet (PI Dr. Botchkina; 1104347-5-37298), SBU Cancer Center, og SBU visepresident for forskning (RSR 1111963-3-63845). Ifølge Fusion TRO forhold, Avdeling for patologi, Institutt for kjemisk biologi Drug Discovery (ICB DD) og Simons Foundation har også delvis bidratt til denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP har den tredje høyeste forekomsten og dødeligheten blant den amerikanske befolkningen [1]. Dagens mangel på kurativ kjemoterapi og høyeste slitasje rate av kreftmedisiner i forhold til andre sykdommer (kun 5% av agenter som har kreft aktivitet i preklinisk utvikling er lisensiert [2]) skaper et stort behov for mer fysiologisk og klinisk relevante kilder til kreftceller, så vel som for mer relevant
in vitro Hotell og
in vivo
modeller. Tradisjonell kreftforskning og preklinisk evaluering av kandidat cytostatika er basert på bruk av umerket langsiktig høy passering etablert kreftcellelinjer dyrket som et monolag kulturer. Men langsiktig
in vitro
vedlikehold fører uunngåelig til akkumulering av ytterligere genomisk og epigenomic endringer, samt valg av dominerende celle subpopulasjoner. Ja, det ble nylig vist at de mest brukte etablerte kreftcellelinjer har ingen sammenheng med originale kliniske prøver [3]. Dette tyder på at bruk av etablerte cellelinjer for studiet av genomiske forandringer, oppdagelse av klinisk relevante molekylære mål, og anticancerlegemiddelutvikling er tvilsom, ettersom bruken av disse cellelinjene tar ikke hensyn til kompleksiteten og patofysiologien til
i vivo
svulster.
det er i stor grad akseptert nå at menneske svulster er organisert hierarkisk, og toppen av dette hierarkiet er okkupert av ondartede stamceller, som besitter ubegrenset selvfornyelse og tumor-initiering kapasiteter. I henhold til den nyeste begrepet carcinogenese, som har revolusjonert forståelsen av tumorigenese og cancer behandling, bare bestemt fenotypiske undergruppe (r) av kreft stamceller (CIC) eller kreft-initiering celler (CIC) er ansvarlig for tumorutvikling, produksjon av hele spekteret av den differensierte avkom som skriver en tumormasse, metastase, og resistens mot anti-kreft terapier [4] – [6]. Slike celler ble nylig isolert fra alle de store menneskelige krefttyper, inkludert tykktarmskreft [7] – [9]. Tallrike studier har vist at spesifikke fenotyper av stammeliknende tumor initiere cancerceller er svært resistent og er i stand til selvfornyelse etter vanlige terapeutiske intervensjoner [10] – [17]. Alle de ovennevnte betraktninger markere avgjørende rolle CIC i oppdagelsen av klinisk relevante molekylære mål og kreft narkotika utvikling.
Identifisering og karakterisering av pasient avledet CIC, utvikling av optimale
in vivo
og
in vitro
prekliniske modeller, og CIC-målrettede analyser av narkotikainduserte endringer representerer kritiske trinn i vurderingen av nye anti-kreft terapi. Det er åpenbart også at for å opprettholde passende fidelity til de opprinnelige tumorer, de kreft initiere celler (CIC), så vel som andre celletyper som brukes for genomisk og proteomikk profilering, bør være isolert fra et stort spekter av primære og metastatiske tumorer , ikke fra de etablerte kreftcellelinjer. Det er imidlertid svært vanskelig å etablere primære cellelinjer og spesielt CIC linjer fra friske vevsprøver [18]. Først, det er objektive vanskeligheter i isolering av rene cellepopulasjoner fra heterogene tumorvev. Tumor urenhet (forskjellige nivåer av ikke-tumorcelle forurensning) og multiclonality er veldokumenterte problemer [19], [20]. På molekylnivå er det i dag ingen definitive markører for å bevise ondartet eller ondartet karakter av celler, samt å nøyaktig skille mellom normale og kreftstamceller. Økende bevis antyder også at CIC kan representere en heterogen undergruppe av tumor initiere celler [21] – [25]. Likevel kan en kombinasjon av flere fremgangsmåter og flere celleoverflatemarkører, etterfulgt av en grundig funksjonell karakterisering av de isolerte celle fenotyper muliggjøre rensing av de funksjonelt signifikant, dvs. tumor og metastase-initierende og de fleste medikamentresistente celler. Flere kolorektal cellelinjer med forskjellige cellulære, biokjemiske og molekylære karakteristika har blitt etablert i løpet av de siste to tiår [26] – [30]. Her rapporterer vi etablering av en ny CIC-beriket, svært tumorigent tykktarmskreft cellelinje isolert fra levermetastaser av en CRC pasient.
Resultater
pasientprøver og primærkulturer
Dissosierte cellesuspensjoner fra 13 ferskt resekterte kolorektale karsinomer av forskjellige karakterer histologiske og 3 levermetastaser ble testet for klonogene og karsinogent potensial
in vivo
og
in vitro
som beskrevet i metodedelen. To prøver ble alvorlig forurenset med bakterier, og til tross for gjentatte behandlinger med antibiotika, ble de primære koloniene også forurenset og derfor forkastet. To primære kulturer utviklet seg fra grunnskolen og metastatiske vevsprøver av pasienter som tidligere er behandlet med kjemoterapi gikk dyp celledød etter 1-2 dager i kultur og viste ingen levedyktige celler i løpet av neste uke for observasjon. De andre ni prøvene inneholdt en subpopulasjon av hurtig-heftende celler (FA) til type I kollagen, som til å begynne proliferert i serumfritt stamcelle medium og indusert flytende sfæroider, som er karakteristisk for CIC, samt løs flercellede aggregater i 3D kulturer. Imidlertid 6 av 9 primærkulturer mistet sine klonogene og kule-dannende kapasitet etter flere passasjer, som er på linje med en rekke observasjoner som primære kreftcellene har et begrenset (5-6 passeringer) levetid [31]. I motsetning til kreftceller isolert fra levermetastaser av mannlig pasient med stadium 4 tykktarmskreft fortsette langsiktig
in vivo Hotell og
in vitro
vekst (15 passasjer, for tiden) og representerer en etableres, CIC-anrikede koloncancercellelinje, CR4. Tre andre primærkulturer er for tiden under utvikling lik den CR4 cellelinje. Disse cellene er i ferd med funksjonelle, genomisk, cellulær og molekylær karakterisering.
Cellular og klonal heterogenitet CR4 tumorceller
Etter første isolering av fast tilhenger til type I kollagen primærtumorceller og deres forplantning
in vitro
i MSCB eller SPC media, flere forskjellige typer av celleformen og klon morfologi var tydelig: (i) tettpakket lange spindel-liknende celler som representerer karsinom-assosiert fibroblaster (kafeer) og normale fibroblaster, som var dominerende cellefenotype snart etter isolering og under flere tidlige passasjer med dyrking (figur 1A); (Ii) spredte store langstrakte celler med dychotomized prosesser (figur 1B); (Iii) sjelden mindre kloner inneholdende små, runde celler omtrent 7-10 pm i diameter med en meget tynn kant av cytoplasma, og store langstrakte kjerner (figur 1C, d); og blant dem, (iv) sjelden, meget store (≥100-200 mikrometer), ofte flerkjernede celler (MNCer, figur 1E). Vi observerer ofte slike celler i både etablerte og primære tykktarm og prostata kreft cellelinjer dyrket under stemness fremmende forhold. Disse flerkjernede kjempeceller var i stand til både langsom spredning, produsere enten ytterligere MNCs (figur 1F) eller store mononukleære celler.
(A) I første omgang dominerte bestanden av tettpakkede langstrakte fibroblast-lignende celler. (B) sparser langstrakte tumorceller med prosesser. (C) Utseende av små klaser av meget små celler (~ 7 um) som grenser til fibroblast-lignende celler. (D) Typisk holoclone indusert av små CR4 celler. (E) Giant multinucleated celle i CR4 holoclone av små celler. (F) Colony of multinucleated celler.
Vi har fortsatt kultur for de blandede cellepopulasjoner i henhold til definerte stemness fremmende tilstander forventer at denne tilnærmingen, i likhet med vår tidligere etablert primære prostata CIC-beriket cellelinje, PPT2 [32] vil føre til spredning av de sjeldne CIC. I tråd med våre observasjoner ble det vist tidligere at ko-kulturen av tykktarmskreftceller med karsinom-assosiert fibroblaster førte til anincrease i antall CIC via aktivering av β-catenin veien [33]. Endelig begrenset aging av primære celler i en stamcelle media førte til utseendet på mange spredte, små celleholdige, tettpakkede kloner med myke kanter (holoclones) omgitt av langstrakte celler (Figur 2A). Dette mønsteret er karakteristisk for embryo, induserte pluripotente og andre stamcelletyper samtidig dyrket med fibroblaster [32], [34]. Sucloning av slike holoclones førte til etableringen av den rensede tykktarmskreft cellelinje, CR4, med alle de grunnleggende funksjonene i CIC, inkludert høy tumor-initiering, 3D spheroid-og holoclone dannende evner og uttrykk av pluripotency og stamcelle-relevant markører (beskrevet nedenfor). Sammen med de antatte glatte kanter holoclones kan CR4 celler induserer paraclones med diffuse kanter (figur 2C), som er karakteristisk for stamceller. Under tidligere passasjer, nesten alle CR4 holoclones inneholdt jevnt pakket små celler fra sentrum til periferien av klone (figur 2B). Men senere passeringer hadde mye høyere forhold mellom de store flerkjernede celler som hovedsakelig er lokalisert i periferien av klonen, mens små celler okkupert mer sentrale delen av klonet (figur 2 E, F). De ultra-lave passasjer CR4 cellene holdes i alikvoter i flytende nitrogen; Foreløpig er denne linjen ved passering 14. For den beskrevne karakterisering, ble de frosne alikvoter spredte enten som NOD /SCID mus tumorxenotransplantater, flytende 3D-kuler eller type I kollagen-tilhenger kulturer.
(A) Clone av små CR4 celler omgitt av lange fibroblast-lignende celler med dychotomized prosesser. (B) Etter subkloning, små CR4-celler sådd til lav densitet i serumfritt SPCM på type I kollagen fremstilt typiske tett pakkede holoclones karakteristiske for stamceller av forskjellig opprinnelse. (C) Paraclone av langstrakte større celler ved siden av små CR4 celler. (D) Lavt antall de rensede små celler produseres hovedsakelig runde kanter holoclones og sjeldne paraclones tilhenger til type I kollagen med høy effektivitet. (E) Høyere forstørrelse av holoclone celler med store kjerner og tynn kant av cytoplasma. (F) Store MNCs (≥200 mikrometer; hematoxylin og eosin-farging). Er ofte plassert i periferien av holoclones
Funksjonell karakterisering av CR4 celler
For å bekrefte stemness staten av den CR4 cellelinje, ble flere funksjonelle analyser utført inkludert vurdering av den tumor-initiering potensial (evnen til å danne subkutane tumorer i immunodeficient NOD /SCID-mus), sfære dannende kapasitet (evne til å danne tette flytende kuler i ikke-adherente 3D-kulturer) og clonogenicity (evne til å danne tilhenger til type i kollagen holoclones). Vi har fastslått at CR4-celler besitter høy effektivitet i induksjon av tumorer i NOD /SCID-mus (figur 3A) etter subkutan serielle transplantasjoner av den relativt lave celletall. Således, 1 x 10
3 CR4-celler eller 2-3 flytende kuler induserte store tumorer i alle mus (6 mus pr hver gruppe). For å etablere klonogene og kule dannende kapasiteten til CR4-celler, ble et visst antall celler sådd ut på type I kollagen-belagte eller ultralave klebende plater, henholdsvis. Etter en uke av inkubasjon ble indusert adherente kloner eller flytende kuler telles og den klonogene effektivitet ble beregnet som forholdet mellom antall seeded celler i forhold til antall induserte kolonier eller kuler. Spesielt vi bestemt at etter såing usorterte CR4 celler passasje 13 i serie fortynning (250, 100, 50 og 25 celler /brønn av 96-brønners plater) om en celle i 10 (10%) indusert perfekte holoclones (figur 2B, D). Sphere dannende effektivitet av CD133-positive fraksjon av CR4 celler i 3D-kultur med 5% type I kollagen i SPCM var høyere sammenlignet med CD133-fratatte cellepopulasjoner (8,4 ± 2,6 versus 3,7 ± 0,6 kuler per 100 seeded celler /brønn , henholdsvis). Både holoclones og sfæroider ble pakket med meget små celler som uttrykker høye nivåer av vanlige stemness markører, inkludert EpCAM, CD133, CD44, CD166 og Lgr5 (beskrevet nedenfor). Selv om CD133 (klone 293C3), samt eventuelle andre vanlige markører, er ikke ideelt for kolon CIC, likevel det gir mulighet for ytterligere berikelse av svulsten-initiere og sfære dannende brøkdel av de CR4 cellene.
(A) stor subkutan tumor indusert ved transplantasjon av de CR4-celler (1 x 10
3) i NOD /SCID-mus (passasje 2). (B) Tette flytende kuler indusert av serieaging av CR4 celler i 3D kultur på de ultra-lav-tilhenger plater. (C) Tredimensjonal sfæroid indusert på overflaten av heft CR4 holoclone. (D) Dannelse av en stor 3D-organoid på overflaten av den heftende CR4 holoclone. (E) Utseende av lange prosesser i sfæroide celler indusert ved CR4 celler i 3D-kultur inneholdende 15% av kollagen gel, noe som indikerer deres høye invasive potensial [35]. (F) Long dychotomized prosesser utviklet av heft små CR4 celler. (G) lange prosesser av heft MNCs.
Den aggressive natur og enestående sfære dannende /klonogene kapasitet på CR4 celler ble demonstrert ved deres evne til å produsere flytende kuler, ikke bare i ikke-heftende kulturer (figur 3B), men også ved knoppskyting av den heftende til type i kollagen holoclones og påfølgende løsgjøring av de dannede kuler (figur 3C). CR4 holoclones var også i stand til å produsere de store heftflerlags organoids rett over holoclone overflaten (Figur 3D). Flytende CR4 kulene oppførte seg annerledes i 3D-kultur-systemer med og uten type I kollagen gels i stamcelle medier (MSCBM eller SPCM). Således sfæroider dyrket med ingen eller lav prosent av kollagen-gel (opptil 5%) har vanligvis glatte kanter (figur 3B), mens høyere gel-konsentrasjon (opp til 10-15%) førte til fremkomsten av flere prosesser, som dannet stjerne -lignende strukturer rundt kulene (Figur 3E). Slik fenotype av flytende sfæroider ble nylig forbundet med høy metastatisk kapasitet av bestemte kreftceller [35], som er på linje med det faktum at CR4-cellelinjen ble etablert fra levermetastaser i kolon kreftpasient. I likhet med 3D-kulturen, ble det invasive natur av CR4 celler som reflekteres ved deres evne til å utvikle lange, store, dikotomert prosesser på den ytre kant av de adherente kloner (figur 3F). De store multinucleated celler i periferien av kloner, beskrevet ovenfor, samt enkeltgigantiske multinucleated celler, vises også ofte lange og dychotomized prosesser (figur 3G).
Fenotypisk profilering av CR4 celler
Som nevnt ovenfor, subkloning av de små-celle-inneholdende holoclones førte til dramatisk anrikning av celler som uttrykker høye nivåer av stemness og pluripotency markører (tabell 1; figur 4 og 5). Generelt stamcelle fenotype
in vitro
er dynamisk på grunn av den doble natur CIC (dvs. deres evne til å fornye seg selv og for å skape engasjerte forfedre). Dermed tidlige og middels passasjer av primær CR4 cellene hadde ustabil fenotype uttrykker svært variable nivåer av CD133, CD44 og EpCAM (tabell 1 og figur 4A). De NOD /SCID-mus tumorxenotransplantater forårsaket av disse cellene uttrykte lignende nivåer av alle undersøkte markører (figur 4B). I motsetning til dette rensede CR4 cellene fremdeles forholdsvis stabil fenotype i 3D og vedheftende til type I kollagen kulturer. Dermed analyserer tre uavhengige FACS i løpet av de siste 7 månedene (passasjer 6-14) har vist at nesten hele befolkningen i CR4 celler forblir udifferensierte (bare 3-5% uttrykt markør for differensiering, pan-keratin), og flertallet av celler uttrykke høye nivåer av CD133 (62-82%), CD44 (65-99%), CD166 (97-98%), EpCAM (98-99%) og Lgr5 (80-83%; representative FACS data er vist på figur 4C). Spesielt omtrent 65% av cellene koekspresjon høye nivåer av CD133 og CD44. Viktigere, ca 20% av CR4 cellene er positive for markør for metastatisk aktivitet, CXCR4.
(A) Representant FACS analyser av de ulike celleoverflatemarkører uttrykk tidlig i primærkultur av de raske heft CR4 celler dyrket på type i kollagen i MSCB medium. (B) FACS-analyse av den første passasjen av FA tumorceller isolert fra NOD /SCID-mus tumorxenografter indusert ved hjelp av for tidlig passasje CR4 celler. (C) Dramatisk økning i uttrykket av de vanligste markører for stemness, inkludert CD133, CD44, CD166, Lgr5 og EpCAM i sen-passasjen (p13) CR4 celler. Legg merke til at 19% av cellene også uttrykt markør for CIC med metastatisk aktivitet, CXCR4, som ble identifisert i flere kreft hos mennesker.
(A) Nuclear lokalisering av viktige pluripotency markører, c-myc, Sox- 2 og Oct3 /4. (B) colocalization av kjernefysisk c-myc med høy membran uttrykk for CD133. (A, B: immuncytokjemisk analyse av CR4 celler dyrket på type I kollagen-belagte kamret lysbilder). (C) Western blot-analyse bekrefter ekspresjonen av c-myc og Oct-3/4 i atomfraksjoner av de CR4 cellene. I motsetning til dette, de er negative for p53 og p21. Atomfraksjonen også uttrykte høye nivåer av phosphorilated p65 (som indikerer konstitutiv aktivering av NF-kB), mens unphosphorilated p65 ble plassert hovedsakelig i et cytoplasma. (D, E) analyserer Representant FACS viser høyere uttrykk av Sox-2 og c-myc i CD133-positive celler i forhold til usorterte celler. (F) Immunohistokjemisk analyse viser høy atom ekspresjon av Sox-2 i den CR4-indusert NOD /SCID-mus tumor xenograft. (G) Negativ kontroll (vev seksjon uten inkubasjon med primære anti-Sox-2 Abs).
Ved hjelp immunocytokjemisk, FACS og western blot analyser, har vi vist at en betydelig forholdet mellom CR4 celler uttrykker flere viktige markører for pluripotency, inkludert Sox-2, Oct3 /4 og c-Myc. Nukleær lokalisering av disse markørene er vist ved ICC (figur 5A, B) ble bekreftet ved Western-blotting (C), som har vist sin ekspresjon i atomproteinfraksjonen og deres fravær i den cytoplasmatiske en. Vi har funnet at CD133
+ fraksjon av CR4-celler uttrykker høyere forhold mellom flere markører for pluripotency i forhold til de usorterte CR4 cellene. Således har FACS-analyse vist at mer enn en fjerdedel av CD133
+ populasjonen uttrykt Sox-2 og 10% av populasjonen var positive for c-Myc (figur 5D). I motsetning til dette, usorterte CR4 celler og CD133-negativ fraksjon uttrykte lave nivåer av disse pluripotency markører (6 og 4%, og 1,4 og 0,8%, respektivt, figur 5E, negativ fraksjon ikke vist). Colocalization analyse har vist at bare celler med den høyeste ekspresjon av CD133 har vanligvis nukleær farging for pluripotancy markører (figur 5B, bare c-Myc er vist). Høy andel av Sox-2positive celler og dens kjernefysiske lokalisering ble også bekreftet av IHC av NOD /SCID-mus tumorxenotransplantater (figur 5F). [Av notatet, bruk av anti-Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) for FACS analyse gitt mistenkelig høye prosenter av positive celler (mer enn 90%) og disse dataene ikke ble inkludert.] Viktigere, den CR4 cellene, på samme måte som prostata PPT2 CIC-anrikede cellelinje [32], ikke uttrykte de to store regulatorer av apoptose og tumorsuppressorgener, p53 og p21 (figur 5C). I tillegg er den kjernefysiske fraksjon av CR4 celler dyrket på type I kollagen i stamcelle medium som separate holoclones sterkt uttrykt fosforylerte p65, noe som betyr at NFkB er konstitutivt overuttrykt i kolorektale CIC. I motsetning til dette ble ufosforylerte p65 plassert hovedsakelig i den cytoplasmiske fraksjon. Alle de ovennevnte kan delvis forklare de høye tumorigen og klonogene kapasiteter og eksepsjonelle legemiddelresistens av denne CIC-anriket cellelinje. Spesielt CR4-celler er svært tolerant overfor behandling med vanlig anvendte cytotoksiske medikamenter så som paclitaxel eller Taxol (figur 6). Dermed, etter 72 timers behandling i konsentrasjonsområdet fra 10 nM opp til 10 mikrometer (MTT-analyse), har CR4 celler vist liten eller ingen cytotoksisitet; dessuten er de ofte øker deres proliferasjon i respons til lavere doser av paclitaxel. Det er funnet at flere medlemmer av den nye generasjonen taxoider, inkludert SBT-1214, SBT-121602 og SBT-12834 er mer effektive mot CR4 tumor-initiering celler. IC50 dødeligheten ble nådd ved ≥10 mikrometer av all narkotika konsentrasjon. Av notatet, kan den lovende effekten av lave konsentrasjoner av ny generasjon taxaner bli ytterligere forbedret ved deres kombinasjon med syntetisk derivat av curcumin, CMC2.24 (upublisert data), som er i tråd med vår tidligere studie [32].
Vanligvis brukes Paclitaxel (Taxol) i doser lavere enn 10 mikrometer er ikke effektiv mot CR4 celler og ofte øker deres spredning. I motsetning til flere nye generasjonen taxoider induserer en doseavhengig hemming av proliferasjon av disse potente tumorceller initiering. (MTT måle etter behandling i 48 timer). De oppnådde
p
verdier for alle stoffer og alle legemiddelkonsentrasjoner var mye mindre at 0,05. Den største
p
verdien ble oppnådd for SBT-1214 ved 10 nM konsentrasjon (
p
= 0,0131); Særlig på 10 mikrometer konsentrasjon av SBT-1214
p
= 0,00032.
Histopatologisk og IHC analyser av NOD /SCID-mus tumorxenotransplantater
Som vi er nevnt ovenfor, subkutan transplantasjon av et forholdsvis lavt antall CR4 celler (1 x 10
3 av de dissosierte cellene CR4 eller 2-3 flytende kuler) induserte store vaskulariserte tumorer i alt injisert NOD /SCID-mus (figur 3A og 7A) . De Hematoxylin-og eosin-farget vevssnitt av musene tumorxenotransplantater viste klassiske histologiske trekk ved menneskelig metastatisk kreft i tykktarmen (figur 7B, C). Meget atypiske epitelceller dannet villøse-lignende strukturer med fremtredende avlange kjerner og, i samsvar med dårlig differensiert adenokarsinom, mange atypiske mitotiske tall. Central nekrose var vanligvis til stede. Mange store multinucleated celler var tydelig ved høyere forstørrelse (figur 7C, piler). Immunhistokjemisk analyse viste at hele tumorområdet (men ikke tumor stroma) uttrykte høye nivåer av membran-lokaliserte EpCAM (figur 7D, E). Lignende mønstre og nivåer av ekspresjon var karakteristisk for CD166 (F). I motsetning til dette, farging med polyklonale CD44 (klon F10-44-2; Invitrogen /Biosources, USA) viste tre forskjellige mønstre for ekspresjon i ulike områder av den samme tumoren, dvs. tydelig membranen (figur 7G), samt cytoplasmisk og tydelig atom i andre deler (figur 7 H). Høy cytolasmic ekspresjon av den felles markør for kolon stamceller og CIC, Lgr5, var tydelig i enkelte tumor deler (fig 7J), mens det i andre deler, det ble enten moderat eller svakt uttrykt (K), eller til og med fraværende. Store områder av tumorxenotransplantater uttrykt sterke kjernefarging for pluripotency markør Sox-2 (figur 7L).
(A) Stor svulst indusert ved transplantasjon av 1 × 10
3 CR4 celler. (B) Hematoxylin og § eosin-farget vev viser klassiske histologiske trekk ved menneskelig metastatisk kreft i tykktarmen. (C) Ved høy effekt forstørrelse av området vist i (b); Pilene viser gigantiske multinucleated celler i papillær strukturer. (D, E) Sterk celleoverflate-ekspresjon av epiteliale markør, EpCAM. (F) Sterk celleoverflate-ekspresjon av CD166. (G) Cytoplasmatisk ekspresjon av CD44. (H) Mikroskopisk fokus med sterk kjernekraft og svakere cytoplasma uttrykk for CD44. (I) Negativ kontroll (primær Abs ble utelatt). (J, K) Sterk og moderat ekspresjon, henholdsvis, av tykktarmen stamcelle markør, Lgr5 /GPR49. (L) Sterk kjernekraft uttrykk for pluripotency markør, Sox-2 i store deler av svulsten.
RNA-Seq komplett transkriptomet profilering av CR4 liten versus bulk kreftceller
Bruk RNA-Seq, utførte vi en funksjonell genomisk analyse i tumor-initiering fraksjoner av CR4 (små) celler dyrket adherent til type i kollagen versus dyrkes som 3D-sfæroider, i forhold til bulk tumorceller (lange og dychotomized celler dyrket under standard dyrkningsbetingelser ). Ved hjelp av en HiSeq 2000, sekvensert vi mellom 40 og 50 millioner per leser biologisk prøve, slik som tidligere beskrevet [35], [36], [37]. Kort fortalt ble biblioteker for NGS laget av 100 nanogram total RNA. Den RNA prøver Kvaliteten ble vurdert med en Agilent Bioanalyzer. Alle RNA prøver hadde en RIN ovenfor 8. Sekvense bibliotekene ble opprettet ved hjelp av Illumina TruSeq Stranded mRNA LT kit i henhold til produsentens anbefalinger. Kvaliteten på hvert bibliotek ble evaluert med Agilent Bioanalyzer høy følsomhet analysen, og kvantifisert ved qPCR (Kappa Biosystem, CT). Bibliotekene ble slått sammen på 10 nM basert på qPCR resultatene, og deretter bassenget ble kvantifisert igjen ved qPCR. Den sammenslåtte Biblioteket ble sekvensert i ett kjørefelt av en HiSeq2000 paret slutten 100bp flyt celle. Dette tillot oss å oppdage hvilke transkripsjoner er uttrykt forskjellig mellom disse typer CR4 celler, og dermed bygge et helhetlig bilde av de aktiverte eller undertrykte signalveier. Vi har funnet at små CR4 celler dyrket enten som separate holoclones adherente til type I kollagen eller som 3D-flytende kuler har et stort antall differensielt uttrykte gener i forhold til bulk-tumorceller dyrket under standard dyrkningsbetingelser. Derfor, i vedheftende liten CR4-celler og 3D sfæroider, 357 og 365 gener, respektivt, ble overuttrykt i forhold til de lange CR4 (bulk) tumorceller. Blant disse genene, ble 287 vanligvis oppregulert, noe som betyr at begge dyrkningsbetingelser gir mulighet for vedlikehold av CR4 små celler ved stemness tilstand. Spesielt både små tilhenger og 3D-kuler uttrykt opptil flere størrelsesordener av oppregulering i følgende: (i) flere felles markører for stemness, inkludert CD44, CD24, EpCAM, ESA, Lgr5, ALDH1A1 og andre; (Ii) vekstfaktorer, inkludert epidermal (EGF), fibroblast (FGF) og transformerende vekstfaktor-beta (TGFp) familiemedlemmer; (Iii) transkripsjonsfaktorer (TFS), inkludert multippel homeobox (CDX1, CDX2, CEACAM6, MSX2) og pluripotency TFS (POU5F1B, OCT4, Sox-2, Sox-9, (iv) inflammatoriske cytokiner og deres reseptorer, inkludert IL18, IL20 , IL2RG, IL20RA og andre, (v) ABC transportører, (vi) gener ansvarlig for overføring av høy energi fosfat fra mitokondriene (CKMT1 og CKMT1B) og medlemmer av cytochrom P450 familie, inkludert CYP2B6, CYP2J2, CYP2S1 og andre av interesse. , tumor-initiering fraksjon av CR4 cellene overuttrykt flere gener som kontrollerer celle-til-celle-adhesjon, inkludert cadherins (CDH 1, 3 og 17, og CDHR5), intergins (ITGB4), gener som koder for tett sammenkoplingsproteiner (CLDN3, 4 og 6, COL17A1 og andre),. og keratin (KRT19, 20, 23 og KRTAP3-1) Dette funnet støtter vår tradisjonelt brukt tilnærming for første berikelse av prostata og tykktarm tumor initiere celler basert på deres evne til å forholde seg til type i kollagen-belagte overflater innen 15-20 minutters inkubasjon. de oppnådde rå RNA-Seq data ble sendt til Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO), en offentlig funksjonell genomikk dataregister (ID-nummer er <
