Abstract
Fotodynamisk terapi (PDT) har dukket opp som en effektiv behandling for ulike solide svulster. Den transkripsjonsfaktor NRF2 er kjent for å beskytte mot oksydativ og elektrofil spenning; imidlertid dens konstituerende aktivitet i kreft gir resistens mot anti-kreft medikamenter. I denne studien undersøkte vi NRF2 signalering som en potensiell molekylær determinant av feoforbid en (Pba) -baserte PDT ved hjelp
NRF2
-knockdown bryst karsinom MDA-MB-231 celler. Celler med stabil
NRF2
knockdown viste forbedret cytotoksisitet og apoptotisk /nekrotisk celledød etter PDT sammen med økte nivåer av singlet oksygen og reaktive oksygenforbindelser (ROS). En confocal mikroskopisk visualisering av fluorogent Pba viste at
NRF2
-knockdown celler akkumulerer mer Pba enn kontrollceller. En etterfølgende analyse av ekspresjonen av membranstoff transportører viste at basal ekspresjon av
BCRP
er NRF2 avhengig. Blant målt narkotika transportører, basal uttrykk for brystkreft resistance protein (BCRP; ABCG2) ble kun redusert med
NRF2
-knockdown. Videre, etter inkubering med BCRP spesifikk hemmer, differensial celle Pba akkumulering og ROS i to cellelinjer ble opphevet. I tillegg
NRF2
-knockdown celler uttrykker lavt peroxiredoxin 3 sammenlignet med kontrollgruppen, som innebærer at redusert mitokondrie ROS forsvarssystem kan være medvirkende til PDT sensibilisering. Rollen til NRF2-BCRP bane i Pba-PDT respons ble ytterligere bekreftet i colon carcinoma HT29-celler. Spesielt
NRF2
knockdown resulterte i økt celledød og økt singlet oksygen og ROS-nivåer etter PDT gjennom redusert uttrykk for BCRP. Tilsvarende PDT-indusert ROS generasjonen ble vesentlig øket ved behandling med
NRF2
shRNA i brystkarsinom MCF-7-celler, colon carcinom HCT116-celler, nyrekreft A498-celler, og glioblastom A172-celler. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at manipulering av NRF2 kan forbedre Pba-PDT følsomhet i flere kreftceller
Citation. Choi Bh, Ryoo Ig, Kang HC, Kwak MK (2014) følsomheten av kreftceller til å feoforbid en basert fotodynamisk terapi er forbedret med
NRF2
lyddemping. PLoS ONE ni (9): e107158. doi: 10,1371 /journal.pone.0107158
Redaktør: Michael Hamblin, MGH, MMS, USA
mottatt: 02.05.2014; Godkjent: 06.08.2014; Publisert: 16.09.2014
Copyright: © 2014 Choi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av National Research Foundation (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og Future Planning (NRF-2013R1A2A2A01015497). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fotodynamisk terapi (PDT) har dukket opp som en effektiv behandling for flere solide tumorer [1] – [3]. PDT krever tre elementer: i) en fotosensibilisator som kan være selektivt rettet mot tumorvev, ii) en passende lyskilde som sender ut lavenergi- og vev-gjennomtrengende lys, og iii) molekylært oksygen [4]. Det første trinn i PDT er aktivering av et fotosensibiliserende middel av lys. Når det aktiverte fotosensibilisator i sin eksiterte tilstand tilbake til sin grunntilstand, overfører den sin energi til oksygen og genererer singlett oksygen (
1O
2), en svært reaktive og kortlivede reaktive oksygenarter (ROS), så en type II reaksjon. På samme tid kan den aktiverte fotosensibilisator reagere direkte med cellulære komponenter og overfører et hydrogenatom som danner radikaler, som til slutt produserer oksydasjonsprodukter gjennom reaksjon med oksygen (type I reaksjon) [5]. Singlet oksygen og ROS er høyt oksiderende molekyler; derfor PDT-behandlede celler gjennomgår celledød gjennom både nekrose og apoptose [6]. I tillegg til sin direkte virkning på tumorceller, påvirker PDT svulsten mikromiljøet ved å ødelegge dets mikrovaskulaturen ved å øke og inflammatoriske responser og tumorspesifikke immunresponser [4], [7], [8].
feoforbid en (Pba) er et produkt av klorofyll sammenbrudd, som er isolert fra silkWorm ekskrementer [9] og kinesisk medisinsk urt
Scutellaria barbarta product: [10]. PBA absorberer lys ved lengre bølgelengder enn første generasjon fotosensibiliserende Photofrin. Den maksimale bølgelengde Pba er 666 nm, mens den for Photofrin er 630 nm [11]. Fordi vevspenetrasjon er forbedret med lengre bølgelengder, og Pba vært ansett som et fotosensibiliserende middel for behandling av store tumorer i bukhulen [12]. I likhet med Photofrin, induserer Pba apoptose og nekrose i pankreatisk karsinom, leukemi, og leverkreft celler [13] – [15]. I livmor karsinomceller, den underliggende mekanisme av apoptose er Pba opphopning i mitokondriene, noe som fører til generering av ROS og frigjøring av cytokrom c [16], [17]. På samme måte bevirker Pba mitokondrier avhengige apoptose i brystkarsinom MCF-7-celler [18]. Flere
in vivo
dyrestudier har støttet effekten av Pba-PDT i å forebygge tumorigenesis. For eksempel, en liposomal fremstilling av Pba-PDT forsinket tumorvekst i en colon carcinoma HT29 xenograft [19]. Intravenøs administrering av 0,3 mg /kg Pba, etterfulgt av lysbestråling i betydelig grad hemmet tumorvekst i nakne mus som bærer en human hepatomcellelinje xenotransplantat [11].
En faktor å bestemme effekt av PDT er ekspresjonen av ATP-bindende kassett ( ABC) transportører i målet vev. Disse transportører kontrollere intracellulær akkumulering av utenlandske kjemikalier ved aktivt å transportere dem ut av cellen [20]. Den brystkreft resistance protein (BCRP eller ABCG2) er en ABC-transportør som opprinnelig ble identifisert i doksorubicin-resistente brystkreft celler [21]. Overekspresjon av BCRP i tumorer gir resistens mot kjemoterapi [22]. I tillegg til anti-kreft medikamenter, har BCRP vist seg å transportere porfyrin-type fotosensibiliserende. Nærmere bestemt, HEK-celler som overuttrykker BCRP var resistente mot Pba-indusert cytotoksisitet [23]. På samme tid,
BCRP
Knockout-mus var svært utsatt for kost Pba-indusert hud fototoksisitet [24].
transkripsjonsfaktor NF-E2-relatert faktor to (NRF2) er en medlem av cap’n’collar familien av grunnleggende leucin-glidelås (CNC-bzip) transkripsjonsfaktorer [25]. NRF2 aktivitet reguleres primært av den cytoplasmiske protein Kelch lignende ECH-assosiert protein 1 (KEAP1) [26], [27]. Gjennom binding til Neh2 domenet NRF2, formidler KEAP1 ubiquitinylation og påfølgende proteasomal nedbrytning av NRF2. Under betingelser med oksidativt og elektrofil stress, er NRF2 frigjort fra KEAP1 og translocates inn i kjernen, noe som resulterer i transkripsjon av flere mål-gener som koder for avgiftende enzymer, antioksidanter proteiner, stress-respons proteiner, og stoffet transportører [28] – [30] . Fordi sine mål gener har cellebeskyttende effekter, er NRF2 betraktes som en kritisk aktør i forsvar mot oksidativt og elektrofil stresset [31]. Følgelig har flere studier vist at genetiske sletting av
nrf2
er assosiert med økt mottakelighet for vevsskade og skade som følge av miljømessige og endogene stressfaktorer [28], [31], [32]. På den annen side antyder økende bevis for at kreftceller utnytter NRF2 system for overlevelse ved å tilpasse seg den stress tumor mikromiljøet [33]. NRF2 signale konstitutivt aktivert i mange tumortyper og dyrkede cancercellelinjer, som er forbundet med økt tumorvekst og resistens overfor kjemoterapeutiske midler. I kreftceller, er NRF2 signale oppregulert etter eksponering for kjemoterapeutiske medikamenter, som gir oppnådd resistens mot kjemoterapi [34] – [36]. Tilsvarende PDT med hypericin i humane blære- carcinom-celler resulterte i økt ekspresjon av kjerne NRF2 protein og heme oksygenase-1 (HO-1) til og p38
MAPK og PI3K trasé [37]. Behandling av HepG2-celler med en ikke-toksisk konsentrasjon av Pba, etterfulgt av bildet aktivering i 90 minutter resulterte i økt ekspresjon av BCRP og heme oksygenase-1 (HO-1) i et NRF2 avhengig måte [38].
i den foreliggende studien undersøkte vi NRF2 som en ny molekylær determinant av PDT effekt. Fordi NRF2 regulerer uttrykket av ROS-motvirke komponenter og flere medikamenter transportører, hypotese vi at manipulere NRF2 uttrykk ville forsterke effekten av PDT. For å teste denne hypotesen, etablerte vi stabilt
NRF2
-knockdown cellelinjer ved hjelp av menneskelig brystkreft MDA-MB-231 celler og tykktarmskreft HT29 celler, og målt PDT følsomhet. Våre resultater viste at
NRF2
knockdown forbedrer PDT-indusert celledød ved å øke produksjonen av ROS. Som en underliggende mekanisme, ble BCRP uttrykk trykt av
NRF2
knockdown, noe som fører til økt cellulær akkumulering av Pba og økt produksjon av singlet oksygen.
Materialer og metoder
Material
Pba var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). NRF2 antistoff ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Antistoffer som gjenkjenner AKR1C1 og BCRP ble kjøpt fra Abnova (Taipei City, Taiwan) og Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), henholdsvis. PRDX3 og β-tubulin-antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Ko143, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), og puromycin ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 5 (6) -carboxy-2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA), trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren, og MitoGreen ble kjøpt fra Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Den lentiviral system som inneholder en pre-designet menneskelig
NRF2
shRNA og uspesifikke egge RNA (scRNA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich.
Cell kultur
Den menneskelige brystkreft celle linje MDA-MB-231 og MCF-7, tykktarmskreft cellelinje HT29 og HCT116, og human nyrekreft A498 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Den menneskelige glioblastom cellelinje A172 ble kjøpt fra koreanske cellelinje Bank (Seoul, Sør-Korea). MDA-MB-231, MCF7, A498, A172, og HCT116 ble opprettholdt i et medium inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagle-medium og Nutrient Blanding F-12 (Hyclone, Utah, USA) i forholdet 01:01 supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og penicillin /streptomycin (WelGene Inc., Daegu, Sør-Korea). HT29 ble opprettholdt i RPMI-1640 medium (Hyclone) med 10% FBS og penicillin /streptomycin. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære.
Produksjon av lentiviral partikler som inneholder
NRF2
shRNA uttrykk plasmid
lentiviral partikler med shRNA ble produsert i HEK-293T-celler etter transfeksjon av celler med
NRF2
shRNA ekspresjonsplasmid og emballasjen mix (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet [36]. I korthet, ble HEK-293T-celler utsådd i 60 mm plater ved en tetthet på 7 x 10
5 celler per brønn. Neste dag, medium ble erstattet av OptiMem (Life Technologies) og senere, 1,5 mikrogram pLKO.1-NRF2 shRNA, som inneholder menneske
NRF2
-spesifikk shRNA (5′-CCGGGCTCCTACTGTGATGTGAAATCTCGAGATTTCACATCACAGTAGGA-3), og emballasjen mix ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Den pLKO.1-scRNA plasmid ble anvendt som et ikke-spesifikt kontroll-RNA. På den andre dagen, etter fjerning av transfeksjon kompleks, ble fullstendig medium tilsatt til hver brønn. Media som inneholder lentiviral partikler ble høstet etter 4 dager.
Etablering av
NRF
knockdown cellelinje
MDA-MB-231 celler i seks-brønns plate ble inkubert med lentiviral partikler inneholder enten scRNA eller NRF2 shRNA uttrykk plasmid. Etter en 48 h-inkubering ble cellene gjenvunnet i fullstendig medium, og puromycin (1 pg /ml) utvalg ble fulgt i opp til 4 uker.
NRF2
knockdown HT29 cellelinje ble etablert som tidligere rapportert [39].
Transient knockdown av NRF2
MCF-7, HCT116, A172 og A498 celler ble sådd i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn og dyrket over natten. Neste dag ble cellene inkubert med kolesterol i 15 min og deretter ble den lentiviral partikkelholdige scRNA eller shNRF2 tilsatt til hver brønn. Etter 48 timers inkubasjon ble viral partikkelholdig media fjernet og cellene ble gjenfunnet i frisk medium for natten.
PDT og MTT analyse
MDA-MB-231 og HT29 ble sådd på en tetthet på 7 x 10
3 celler /brønn i 96-brønners plater og inkubert i 20 timer. Cellene ble behandlet med Pba (0-2,5 ug /ml) i 6 timer og deretter bestrålt med 0,3 (HT29) eller 0,6 J /cm
2 (MDA-MB-231) laser i fravær av Pba. For laserbestråling, den 670 nm LED-hybrid Lamp system (Quantum Spectra Life, Barneveld, WI) ble brukt. Cellene ble gjenvunnet i komplett medium i 18 timer og inkubert med MTT i 4 timer. Etter fjerning av MTT-løsning ble 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) tilsatt til hver brønn og absorbansen ble målt ved 570 nm ved anvendelse av en Spectro-stjerne Nano mikroplateleser (BMG Labtechnologies, Offenburg, Tyskland).
Cytotoksisitet måling
Cytotoksisitet av PDT ble vurdert ved hjelp CytoTox-Fluor analysesystem (Promega, Madison, WI, USA). Etter PDT, ble cellene opprettholdt i 24 timer og deretter 50 pl bis-AAF-R110-substrat ble tilsatt til hver brønn. Substratet inneholdende oppløsning ble inkubert i ytterligere 2 timer med kretsende rysting ved 37 ° C. Intensiteter av fluorescens ble målt ved hjelp av en SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved 485 nm Ex /520 nm Em.
Total RNA ekstraksjon og real-time PCR-analyse
Totalt RNA ble isolert fra celler ved hjelp av en Trizol reagens (Life Technologies). For syntese av cDNA, revers transkriptase (RT) reaksjoner ble utført ved inkubering av 200 ng av total RNA med en reaksjonsblanding inneholdende 0,5 ug /ul oligo dT
12-18 og 200 U /mL Moloney Murine Leukemia Virus RT (Liv Technologies). For sanntids polymerase-kjedereaksjon (PCR) analyse, ble Roche LightCycler (Mannheim, Tyskland) brukes med Takara SYBR Premiks ExTaq system (Otsu, Japan). Primere ble syntetisert ved Bioneer (Daejeon, Sør-Korea) og primer sekvenser for de menneskelige gener er:
NRF2
, 5′-ATAGCTGAGCCCAGTATC-3 «og 5′-CATGCACGTGAGTGCTCT-3»;
HO-1, etter 5′-GCTGCTGACCCATGACACCAAGG-3 «og 5′-AAGGACCCATCGGAGAAGCG-GAG-3»; aldo-keto reduktase 1C1 (
AKR1C1), etter 5′-CGAGAAGAACCATGGGTGGA-3 «og 5′-GGCCACAAA-GGACTGGGTCC-3»; NAD (P) kinon oksidoreduktase-1 (
NQO1
), 5′- CAGTGGTTTGGAGTCCCTGCC-3 «og 5′-TCCCCGTGGATCCCTTGCAG-3»; de katalytiske underenhetene i γ-glutamat cystein-ligase (
GCLC
), 5′-TGAAGGGACACCAGGACAGCC-3 «og 5′-GCAGTGTGAACCCAGGACAGC-3»; epoksyd hydrolase-1 (
EPHX1
), 5′-GCCTGCACTTGAACATGGCT-3 «og 5′-ATGTGCATGTAGCCGCTCTC-3»; superoksyddismutase 1 (
SOD1
), 5′-GATTCCATGTTCATGAGTTT-3 «og 5′-AGGATAACAGATGAGTTAAG-3»;
SOD2
, 5′-AACCTCACATCAACGCGCAGAT-3’and 5′-TCAGTGCAGGCTGAAGAGCTAT-3 «; katalase (
CAT
), 5′- GTGCATGCAGGACAATCAGG-3 «og 5′-GAATGCCCGCACCTGAGTAA-3»; peroxiredoxin 3 (
PRDX3
), 5′- GCCGTTGTCAATGGAGAGTTC-3 «og 5′-GCAAGATGGCTAAAGTGGGAA-3»;
PRDX5
, 5’GGTGGCCTGTCTGAGTGTTA-3 «og 5’ACCACCATGGAGAACCTCTTG-3»; glutationperoksidase 1 (
GPX1
), 5′-TTCCCGTGCAACCAGTTTG-3 «og 5′-TTCACCTCGCACTTCTCGAA-3»;
GPX4
, 5′-TCACCAAGTTCCTCATCGACA-3 «og 5’GCCACACACTTGTGGAGCTA-3»; glutation reduktase (
GSR
), 5′-ACCCCGATGTATCACGCAGTTA-3 «og 5′-TGTCAAAGTCTGCCTTCGTTGC-3»; glutaredoxin 2 (
GLRX2
), 5′-GTATTGCTCTCCATCCTCCTCG-3 «og 5’CTGGGAGCCTTTATGAGCGT-3». tioredoksin-2 (
TXN2
), 5′-CACACCACTGTGCGTGGAAA-3 «og 5′-ACTGTAACACCCAACCCAGC-3»; brystkreft motstand protein (
BCRP /ABCG2
), 5′- CACAACCATTGCATCTTGGCTG-3 «og 5′- TGAGAGATCGATGCCCTGCTTT-3»; multiresistens protein 1 (
MDR1 /ABCB1
), 5′-CTATGCTGGATGTTTCCGGT-3 «og 5′-TCTTCACCTGGCTCAGT-3»; multilegemiddelresistens-assosiert protein 1 (
MRP1 /ABCC1
), 5′-AGCTTTATGCCTGGGAGCTGGC-3 «og 5′-CGGCAAATGTG- CACAAGGCCAC-3»;
MRP2 /ABCC2, etter 5′-GCTGCCACACTTCAGGCTCT-3 «og 5′-GGCAGCCAGCAGTGAAAAGC-3»;
MRP3 /ABCC3, etter 5′-ATACGCTCGCCACAGT-CCTT-3 «og 5′-GCTGGCCATGATGACCACAA-3»;
MRP4 /ABCC4
, 5′-CTTG- GATCGCAA-TACCCTTG-3 «og 5′-GACACCTCTCTTCTGCTTTG-3»;
MRP5 /ABCC5, etter 5′-CAGAGACCGTGAAGATTCCA-3 «og 5′-TTTGGAAGTAGTCCGGATGG-3»;
MRP6 /ABCC6, etter 5′-TGTGTGGCTCACCACGATG-3 «og 5′-CATAGGTAG- GTGGACAG-GTGG-3»; organisk kation transportør nye 1 (
OCTN1;
SLC22A4), 5′-GCTGTATGTCTTCACTGCTG-3 «og 5′-GGTGAGGATTCCAATCAGGA-3»;
OCTN2 product: (
SLC22A5
), 5′-ATTGTTGTGCCTTCCACTATC-3 «og 5′-GGTCATCCACAGCATTATGG-3»; multidrug og toksin ekstrudering transporter 2 (
MATE2
;
SLC47A2
), 5′-TTCATTCCAGGACTTCCGGTG-3 «og 5′-AGGTGTGAGTGAGATGGATGG-3′; hypoxantin phosphoribosyltransferase-en (HPRT1), 5»-TGGCGTCGTGATTAGTGATG-3 «og 5′-GCTACAATGTG-ATGGCCTCC-3».
Måling av singlet oksygen
Cellene ble sådd i et dekkglass tallerken (SPL Life Science, Gyeonggi-do, Sør-Korea) og dyrket i over natten. Etter Pba-laserbestråling, ble cellene vasket med PBS og inkubert med 50 mM trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren (Life Technologies) i 30 min. For kjerner farging, ble Hoechst 33342 (H342) tilsatt til ovennevnte retter og inkubert i 10 min. Grønn fluorescens fra singlet oksygen ble oppdaget umiddelbart med en LSM 710 konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland) og intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av en ZEN2011 programvare (Carl Zeiss).
Måling av intracellulær ROS
Cellular ROS-nivåer ble undersøkt ved anvendelse av en celle-permeabel fluorogen probe, karboksy-H
2DCFDA. Cellene ble sådd i en cover glassbunn fatet (SPL Biovitenskap) og videre inkubert over natten. Etter Pba-laser terapi, ble cellene vasket med PBS og inkubert med 30 pM av karboksy-H
2DCFDA i 30 minutter ved 37 ° C. For kjerner farging, ble H342 inkubert i 10 min. Deretter ble oppnådd confocal bilder og grønne fluorescerende intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av en LSM 710 konfokalmikroskop og ZEN2011 programvare
Måling av Pba opphopning
Pba er et fluorogent stoff.; derfor nivået av intracellulær akkumulering av Pba ble bestemt ved å måle rød fluorescens i cellen. MDA-MB-231 og HT29 på dekkglass ble inkubert med Pba i 6 timer. Deretter, Pba ble fjernet, og PBS-vaskinger ble fulgt. Intensiteter av Pba rød fluorescens ble kvantifisert i confocal bilder ved hjelp ZEN2011 programvare. Som en alternativ måte for kvantifisering ble cellene sådd ut i 96-brønners plater (BD Biosciences) og inkubert med Pba i 6 timer. Etter celle vask, ble Pba rød fluorescens påvises ved hjelp av en CellInsight Personlig Cell Imager (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og intensiteter ble kvantifisert ved CellInsight programvare (Thermo Fisher Scientific).
Fluorometrisk bestemmelse av intracellulær PBA
celler i 96-brønners plater ble inkubert med Pba i 6 timer og deretter ble lysert ved anvendelse av 1% SDS etter PBS vask. DMSO ble tilsatt til cellelysatene for å oppløse celle Pba og fluorescensintensitet ble målt ved anvendelse av en SpectraMax M5 ved 415 nm Ex /Em 673 nm.
Western blot-analyse
Celler ble lysert med RIPA-buffer (50 mM tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, og 1% nonyl phenoxypolyethoxylethanol 40) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich). For BCRP proteinekstraksjon, ble 0,1% SDS tilsatt til RIPA buffer. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av en DC-proteinanalysesett (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteinprøvene ble separert ved elektroforese på 12% SDS-polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (Whatman, Dassel, Tyskland). Deretter ble membranen blokkert med 5% skummet melk eller 3% bovint serumalbumin i 1 time og inkubert med antistoffer. Kjemilumini bildene ble tatt med et Fujifilm LAS-4000 mini imager (Fujifilm, Tokyo, Japan) og intensiteter ble kvantifisert med tilhørende programvare.
Flow cytometri
NRFi-MDA celler ble sådd i 60 cm
2 retter ved en tetthet på 1 x 10
5 celler /brønn og dyrket over natten. Etter Pba-laserbestråling, ble cellene trypsinert og spunnet ned ved 15.000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Deretter ble 2 x 10
5-celler ble overført til 1,5 ml rør for sentrifugering ved 8000
g
i 5 min ved 4 ° C. Deretter 5 mL av fluorokromkonjugerte konjugert Annexin V (BioLegend, San Diego, CA, USA) og 10 mL av propidiumjodid (PI, BioLegend) ble tilsatt i hvert rør og inkubert med forsiktig vortex. Cellene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke og deretter 400 ul av Annexin V bindingsbuffer (BioLegend) ble tilsatt til hvert rør. Fargede celler ble analysert ved hjelp av en Becton Dickinson FACS Canto (SanJose, CA, USA) med og data ble analysert med FACSDiva programvare (BD).
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble bestemt av en student paret t-test fulgt eller en enveis variansanalyse (enveis ANOVA) etterfulgt av Student Newman-Keuls test for multiple sammenligninger ved hjelp GraphPad Prism programvare (La Jolla CA, USA).
Resultater
Pba cytotoksisitet forsterkes av
NRF2
knockdown i MDA-MB-231 brystkreftceller
for å undersøke involvering av NRF2 i effekten av Pba-PDT for brystkreft, etablerte vi en
NRF2
-knockdown brystkreft cellelinje i MDA- MB-231 celler. Stabile cellelinjer som uttrykker uspesifikk egge RNA (sc-MDA) eller
NRF2
-spesifikk shRNA (NRF2i-MDA) ble oppnådd fra puromycin utvalg i 4 uker. Uttrykket nivåer av NRF2 og dens mål gener ble undersøkt i disse cellelinjene. NRF2i-MDA celler viste en 85% reduksjon i
NRF2
mRNA og betydelige reduksjoner i uttrykk for NRF2 mål
AKR1C1 Hotell og
HO-1 product: (Fig. 1a). Western blot-analyse viste at proteiner nivåer av NRF2 og AKR1C er vesentlig redusert i knockdown-celler (Fig. 1B). Disse bekrefter vellykket hemming av NRF2 signalering i etablert stabil cellelinje. Deretter undersøkte vi følsomheten til
NRF2
-knockdown MDA-MB-231 celler til PBL og laser kombinasjonsbehandling. Uten laserbestråling, ble inkubering av sc-MDA og NRF2i-MDA-celler med Pba (0,025 til 2,5 ug /ml, 24 timer) ikke i vesentlig grad påvirker cellenes levedyktighet (fig. 1C). Tilsvarende hadde laserbestråling uten Pba inkubasjon ikke påvirke cellenes levedyktighet (fig. 1D). For å vurdere PDT følsomhet, ble cellene bestrålt med en 0,6-J /cm
2 laser etter inkubasjon med Pba og MTT-analyse ble utført etter 18 timer utvinning. Opprinnelig ble PDT virkning evaluert med varierte inkubasjonstidene med Pba. Inkubering av Pba (0,125 ug /ml) i 2, 6 og 18 timer viste lignende cytotoksisitet i fm kontrollcellene (fig. 1E). Basert på dette resultatet ble seks h-inkubasjon av Pba opprettholdt i denne studien.
(A) transkripsjonsnivåer av
NRF2
,
AKR1C1
, og
HO-1
ble målt i kontrollen (sc-MDA) og
NRF2
-knockdown celler (NRF2i-MDA) ved bruk av relativ kvantifisering av real-time PCR. HPRT1 ble anvendt som en kontroll rengjøring genet. Data representerer forhold med hensyn til sc-MDA og er rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik (SDS) av 3 eksperimenter. (B) Protein nivåer av NRF2 og AKR1C1 ble bestemt ved Western blot analyse i fm kontroll og NRF2i-MDA celler. (C) sc-MDA og NRF2i-MDA-celler ble inkubert med Pba (0-2,5 mg /ml) i 6 timer, og levedyktige celler ble kvantifisert ved hjelp av et MTT-assay etter en 18 timers utvinning. (D) Cellene ble bestrålt med en laser i fravær av Pba, og levedyktige celler ble kvantifisert ved hjelp av et MTT-assay etter en 18 timers utvinning. (E) Den sc-MDA ble inkubert med Pba i 2, 6 eller 18 timer og levedyktige celletall ble bestemt etter laserbestråling. Dataene representerer prosentsatser i forhold til kjøretøygruppe for hver cellelinje og er rapportert som gjennomsnitt ± SD av 8 brønner.
I MTT analyse, NRF2-MDA-celler var relativt mer følsomme for Pba -baserte PDT: levedyktig celleantall etter PDT var lavere i de NRF2i-MDA-celler enn i kontrollcellene (figur 2A.). Tilsvarende, når død celle-avledet peptidase-aktivitet ble målt i mediet ved hjelp av en CytoTox substrat
NRF2
knockdown-celler viste en signifikant høy cytotoksisitet sammenliknet med sc kontroll (Fig. 2B).
( A) sc kontroll og NRF2i-MDA-celler ble for-inkubert med Pba (0-2,5 ug /ml) i 6 timer og ble deretter bestrålt med 0,6 J /cm
2 laser. Deretter ble utført MTT analyse etter en 18 timer utvinning. Dataene representerer prosentsatser i forhold til kjøretøygruppe for hver cellelinje og er rapportert som gjennomsnitt ± SD av 8 brønner.
aP 0,05 sammenlignet med sc-MDA-kontroll ved hver konsentrasjon av Pba. (B) PDT-indusert cytotoksisitet ble bestemt ved å måle død celle-proteaseaktivitet i et cellekulturmedium. Celler ble inkubert med Pba (0,125 og 0,25 ug /ml) i 6 timer fulgt av laserbestråling, og inkubert i 18 timer. Død celle avledet protease-aktivitet ble bestemt ved anvendelse av fluorogent substrat AAF-R110. De data som representerer relativ cytotoksisitet i forhold til kjøretøygruppe for hver cellelinje og er rapportert som gjennomsnitt ± SD av 8 brønner.
aP 0,05 sammenlignet med hver sc-MDA-kontroll. ble utført (C) en strømningscytometrisk analyse av apoptotiske og nekrotiske celler i NRF2i-MDA-celler etter Pba-laser behandling. Cellene ble inkubert med PI og Annexin V, og cellepopulasjoner ble vurdert. (D) Baren diagrammet representerer cellepopulasjonen i Annexin V (AV) + /PI +, AV + /PI- eller AV- /PI + fasen fra tre separate forsøk.
aP 0,05 som sammenliknet med noen laserkontroll. (E) NRF2i-MDA-celler ble ko-inkubert med Z-VAD-FMK (10 uM) eller necrostatin (Nec-1, 50 uM) og Pba (0,125 ug /ml) i 6 timer; deretter ble cellene vasket med PBS og bestråles med en laser. Etter 18 timers inkubering, ble levedyktige celler kvantifiseres ved hjelp av et MTT-assay. Dataene er i prosent i forhold til kontrollen (ingen PDT og kjøretøy behandling) og er rapportert som gjennomsnitt ± SD av 8 brønner.
aP. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
PDT induserer celledød gjennom apoptotiske og nekrotiske trasé [6], [40]. Deretter for å identifisere mekanisme celledød involvert i PDT-behandlede
NRF2
knockdown brystkreftceller, FACS-analyse med Annexin V og PI dobbeltfarging ble utført. NRF2i-MDA celler ble behandlet med PDT; umiddelbart etterpå ble cellene trypsinert og farget med Annexin V (tidlig apoptose markør) og PI (slutten av apoptose og nekrose markør). Etter Pba-laser kombinasjonsbehandling, skiftet de fleste cellepopulasjon til apoptotiske-nekrotiske fase (Fig. 2C). Kvantifisering av eksperimentelle rapporter viste at 16,7% av cellene var i tidlig fase apoptotiske (Annexin V + /PI-) og 61,3% av cellene var i slutten av apoptotiske /nekrotisk fase (Annexin V + /PI +). Bare 15,7% av cellene var i den ikke-apoptotiske og ikke-nekrotisk fase (fig. 2D). Dette viser klart at PDT induserer celledød involverer prosessen med apoptose og nekrose. Som en bekreftelse, når celler ble ko-inkubert med en caspase pan-inhibitor Z-VAD-FMK (10 uM) og PDT (Pba 0,125 ug /ml) i prosent av levedyktige celletall økt fra 63% til 80,1% (fig. 2E ). I tillegg inkubasjon med necrostatin (50 uM), en potent inhibitor av programmerte nekrotisk celledød, forhøyet levedyktig celleantall til 78,2%. Til sammen oppnådde resultater indikerer at
NRF2
knockdown sensibilisert brystkreft MDA-MB-231 celler til Pba baserte PDT, noe som resulterer i økt celledød.
PDT-stimulert ROS generasjon er forhøyet i
NRF2
knockdown MDA celler
Pba-laser kombinasjonsbehandling utgivelser singlet oksygen inne i cellen, og den resulterende ROS er en stor bidragsyter til PDT er cytotoksisitet [5]. Derfor overvåket vi PDT-avledet singlet oksygen i begge cellelinjene. -Celler forbehandlet med Pba (2,5 ug /ml i 6 timer) ble bestrålt med en 0,6-J /cm
2 laser, og nivåene av singlet oksygen ble bestemt ved bruk av trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren, et fluorescerende fargestoff, som er spesifikk for singlet oksygen. Sammenlignet med behandling med bare Pba eller laserbestråling bare, trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren-baserte metode, viste at Pba-laser kombinasjonsgruppen viser et forbedret fluorescerende signal inne i cellen (data ikke vist), noe som bekrefter den økning i singlet oksygen ved PDT. I vår innledende vurdering, inkubering av trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren i 5 min, 30 min og 50 min viste lignende øke nivåene av singlett-oksygen-avledede fluorogene pyren intensitet (Fig. 3A). Dette bekrefter at singlet oksygen-avledet pyren fluorescens kan være pålitelig påvises i disse inkubasjoner ganger; derfor en confocal bestemmelse ble gjort etter 30 min inkubasjon av trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren i vår studie. Den sammenlignende måling av singlet oksygen viste at
NRF2
-knockdown MDA-MB-231 celler generere høyere nivåer av singlet oksygen enn (Fig. 3B) kontrollcellene. De fluorescente signalene ble fordelt i cytoplasma, så vel som kjernen, og den totale fluorescens-intensitet var 1,5-ganger høyere i knockdown cellene enn i kontrollcellene. Følgelig, det totale nivå av ROS, som ble overvåket ved bruk av DCFDA, ble vesentlig forhøyet etter behandling med Pba-laser kombinasjon i begge cellelinjer; men var økningen større i NRF2i-MDA celler. Nærmere bestemt, etter behandling med 2,5 ug /mL Pba og laserbestråling, var økningen i ROS var 4,6-ganger høyere i
NRF2
-knockdown cellelinje enn i kontrollcellelinje (Fig. 3C). Tilsvarende, etter behandling med den lave konsentrasjon av Pba (0,125 ug /ml) og laserbestråling, var økningen i ROS var 3,5-ganger høyere i NRF2i-MDA-celler (Fig. 3D). Disse resultatene antydet at høyden i singlett-oksygen og ROS forbedrer følsomheten
NRF2
-knockdown brystkreftceller til PDT.
(A) sc kontrollceller ble inkubert med Pba i 6 timer og bestrålt av en 0,6 J /cm
2 laser. Rett etter PDT, ble en singlet oksygen følsom trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren tilsatt, og cellene ble videre inkubert i 5, 30 eller 50 min, i nærvær av trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren. Deretter konfokalt observasjon ble utført for å påvise fluorogene fargestoffet dannelse, som ble dannet ved reaksjon med singlet oksygen.
