Abstract
Reprimo (RPRM), en nedstrøms effektor av p53-indusert cellesyklus-stans i G2 /M, er foreslått som en antatt tumorsuppressorgen (TSG) og som en potensiell biomarkør for ikke-invasiv påvisning av magekreft (GC). Hensikten med denne studien var å evaluere epigenetisk stanse av RPRM genet ved promoter metylering og dens tumor suppressor funksjon i GC cellelinjer. Videre ble kliniske betydningen av RPRM protein produkt og sin tilknytning til p53 /p73 tumor suppressor protein familien utforsket. Epigenetisk stanse av RPRM-genet ved promoter metylering ble evaluert i fire GC cellelinjer. Proteinekspresjon av RPRM ble evaluert i 20 tumor og ikke-tumor matchet tilfeller. Den kliniske betydningen av RPRM forbindelse med p53 /p73 tumor suppressor protein familien ble undersøkt i 114 GC tilfeller. Tumor suppressor funksjon ble undersøkt gjennom funksjonelle analyser. RPRM genekspresjon var negativt korrelert med arrangøren metylering (Spearman rank r = 1; p = 0,042). RPRM overekspresjon hemmet kolonidannelse og forankringsuavhengig vekst. I kliniske prøver, ble RPRM gene protein ekspresjon detektert i 75% (15/20) av ikke-tumor tilstøtende mucosa, men bare i 25% (5/20) av mage-tumorvev (p = 0,001). Clinicopathological korrelasjoner av tap av RPRM uttrykk var signifikant assosiert med invasiv stadium av GC (stadium I til II-IV, p = 0,02) og en positiv sammenheng mellom RPRM og p73-genet proteinprodukt uttrykk ble funnet (p 0,0001 og kappa verdi = 0,363 ). I konklusjonen, er epigenetisk stanse av RPRM genet ved promoter metylering forbundet med tap av RPRM uttrykk. Funksjonelle analyser tyder på at RPRM oppfører seg som en TSG. Tap av ekspresjon av RPRM genproteinproduktet er forbundet med invasiv stadium av GC. Positiv sammenheng mellom RPRM og p73 uttrykk tyder på at andre medlemmer av p53-genet familien kan delta i reguleringen av RPRM uttrykk
Citation. Saavedra K, Valbuena J, Olivares W, Marchant MJ, Rodríguez A, Torres- Estay V, et al. (2015) Tap av Expression of Reprimo, en p53-indusert cellesyklus arrest Gene, korrelerer med Invasive Stage for tumorprogresjon og p73 uttrykk i magekreft. PLoS ONE 10 (5): e0125834. doi: 10,1371 /journal.pone.0125834
Academic Redaktør: Mohammed Soutto, Vanderbilt University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 16 januar 2015; Godkjent: 25 mars 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Saavedra et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette fungerer ble støttet med tilskudd CONICYT-FONDECYT # 1111014 (AHC) og CONICYT-FONDAP # 15130011 (AHC og JCR) fra regjeringen i Chile
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall og den femte mest vanligste kreftformen i verden [1]. Til tross for den avtagende forekomst av GC, delvis på grunn av anerkjennelsen av visse risikofaktorer (f.eks
Helicobacter pylori Hotell og miljøfaktorer), er det fortsatt en av de vanligste kreftformene i verden og fortsetter å være en klinisk utfordring [2 , 3]. Gastric kreftutvikling innebærer en gradvis akkumulering av genetiske og epigenetiske forandringer, som fører til feilregulering i uttrykket av onkogener og tumorsuppressorgener (TSGs) [4]. Reprimo (RPRM) er en roman antatt TSG [5,6] og forbundet med magekreftutvikling [7]. Videre har vi foreslått at metylert RPRM celle-frie DNA kan være en potensiell biomarkør for ikke-invasiv påvisning av GC [8,9].
RPRM er et sterkt glykosylert protein som hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma og har vært identifisert som en nedstrøms effektor av p53-indusert cellesyklus-stans i G2 /M [10]. Rapporter tyder på at RPRM ekspresjon blir regulert av to mekanismer, en gjennom DNA-metylering ved sin promotor-regionen [8] og den andre av p53 bane [10]. Imidlertid har nyere studier ikke kunnet bekrefte disse funnene [6]. På den annen side har den kliniske betydningen av RPRM vært dårlig undersøkt [11]. I den foreliggende studien evaluerte vi den rolle av DNA-metylering i reguleringen av ekspresjonen RPRM, den kliniske betydning og dets forbindelse med medlemmer av p53 tumor suppressor protein familien (dvs. p53 og p73). Vi fant tett metylering i RPRM promoter-regionen, noe som var forbundet med tap av ekspresjon i GC-cellelinjer. I kliniske tilfeller ble tap av uttrykket som er knyttet til invasivitet stadium av GC. Videre observerte vi en positiv sammenheng mellom uttrykk for RPRM og p73, noe som tyder på at andre medlemmer av p53-genet familien kan være nye kandidater for regulering av RPRM uttrykk.
Metoder
Cellelinjer og vevsprøver
Fire GC cellelinjer (AGS, SNU-en, KATOIII og NCI-N87) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) i desember 2012 dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone) og supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og holdt ved 37 ° C, 5% CO
2. Tjue matchet tumor og ikke-tumor tilstøtende slimhinner (NTAM) prøver ble valgt for evaluering av RPRM uttrykk. Seks ble valgt for evaluering av RPRM metylering. En kohort av 114 GC pasienter ble valgt for clinicopathological korrelasjoner av RPRM gen proteinprodukt. Vevsprøver fra enkeltsaker ble klassifisert i henhold til japansk Research Society for magekreft anbefalinger [12]. Alle saker ble rekruttert fra Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas-Hospital Clínico San Borja Arriarán (ICHJED-HCSBA), Santiago, Chile mellom 1993 til 2000 [13] og clinicopathological funksjoner er vist i tabell 1. Denne studien ble godkjent av Institutional gjennomgang styrene i Pontificia Universidad Católica de Chile (Comité de Etica Científico) og ICHJED-HCSBA (Comité de Etica Científico, Servicio de Salud Metropolitano Central, Santiago, Chile). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker involvert i studien.
Tissue microarray og Immunohistochemistry
microarray (TMA) ble gjort ved hjelp av en manuell Tissue Array II instrument (Beecher Instruments ) som tidligere beskrevet [14,15]. Kjerne seksjoner (4 um) ble utsatt for farging av Vectastain Elite Kit R.T.U (Vector Labs), i henhold til produsentens instruksjoner. Antistoffer anvendt i denne studien var RPRM (38-50, Sigma-Aldrich), p53 (klon 318-6-11, Dako Danmark) og p73-protein α (klon 24, Novacastra). Resultater av immunofarging i hele svulsten og NTAM samt TMA snitt ble betraktet som positive for RPRM hvis 30% av epitelceller viste cytoplasmatisk farge, 10% nukleær farging for p53, eller 10% nukleær /cytoplasmatisk farge for p73 . Evaluering av immunhistokjemisk farging ble utført uavhengig av to patologer (JV GC). Som ble blindet for kliniske data
Bisulfite sekvensering og kvantitativ RT-PCR Expression Analysis
DNA fra GC cellelinjer var hentet ved hjelp TRIzol reagens (Life Technologies) ifølge produsentens protokoll, etterfulgt av sulfitt konvertering ved hjelp av EZ DNA metylering Gold kit (Zymo Research). RPRM promoteren ble amplifisert fra bisulfitt-behandlede DNA, ved anvendelse av primere RPRM_B_FW 5′-TTGTAAAAGTAAGTAATAAAAAGTAAG-3 «og 5′-RPRM_B_RV CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3», slik at deteksjonen av 52 CpG steder innenfor en 509-bp promoter-regionen. PCR-produktene ble renset med QIAXEN II gel ekstraksjon sett (QIAGEN), og ligert inn i pGEM-T vektor. Den ligation Produktet ble brukt til å transformere kompetente
E
.
coli
10 på topp-celler, i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Inoue et al. [16]. Transformantene ble selektert på LB-agarplater supplert med ampicillin (100 ug /ml), X-gal (50 mg /ml) og IPTG (100 mM). De resulterende hvite kolonier ble vurdert ved koloni-PCR. Positive kloner ble dyrket i flytende medium (LB /ampicillin) før sent eksponensiell fase (OD600 = 1) og DNA-plasmider ble renset ved anvendelse av Pure Utbytte miniprep system kit (Promega). Den RPRM promoter-regionen ble sekvensert ved hjelp av universal M13 (W 5′-GTAAAACGACGGCCAG-3 «og 5′-RV CAGGAAACAGCTATGAC-3′) ved Macrogen (https://dna.macrogen.com). BIQ analysator programvare ble benyttet for analyse av sekvenserte kloner. Alle positive pGEM-T-kloner ble dyrket på LB /ampicillin medium og lagret ved -80 ° C (i 14% glycerol). Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen) og cDNA ble syntetisert ved anvendelse av iScript cDNA syntese kit ifølge produsentens instruksjoner (Biorad). Deretter cDNA ble anvendt for hver PCR-reaksjon med hvert primerpar. De RPRM spesifikke primere: 5»-RPRM_FW GAGCGTAGCCTGTACATAATGC-3 «og 5′-RPRM_RV CCTTCACGAGGAAGTTGATCAT-3». Real time RT-PCR-analyse ble utført ved hjelp LightCycler Fast Start DNA MasterPlus SYBR Grønn I (Roche) i en LightCycler 1.5 Real-Time Detection System (Roche). Relativ kvantitativ analyse normalisert til RPL-30 ble gjennomført med en sammenligningssyklus terskelmetoden [17]. De RPL-30 spesifikke primere er:. RPL-30_Fw 5′-ACAGCATGCGGAAAATACTAC-3 «og RPL30_RV 5′-AAAGGAAAATTTTGCAGGTTT-3»
Validering av RPRM antistoff ved Immunoblot og immunfluorescens
3×10
5 AGS celler ble transient transfektert med pCMV6 /RPRM eller pCMV6 (Origene) tom vektor, ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens protokoll. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble cellene inkubert i 24 timer i RPMI 1640 med 10% FBS i nærvær eller fravær av N-glykosylering inhibitor Tunicamicyn (10 ng /ml). Celler ble høstet og hel-cellelysater ble ekstrahert ved hjelp av Triton-buffer (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,5% Triton X-100) med Protease Inhibitor Cocktail Kit (P8340, Sigma Aldrich) og fosfatase inhibitor cocktail Kit ( sc-45045, Santa Cruz Biotechnology). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med Quick Start Bradford Reagens (Bio-Rad). Femti ug protein ble separert på SDS-PAGE 4% til 12%. Proteiner på gelene ble elektroblottet til polyvinylidendifluorid-membraner ved hjelp av mini transblotter system (Bio-Rad, Hercules, CA). De polyvinylidendifluorid Membranene ble blokkert i 5% melk i Tris-bufret saltvann /Tween 20 (TBST) i 1 time. Primære antistoff anti-RPRM (38-50, Sigma-Aldrich) ble fortynnet 1: 1000 i TBST /3% BSA /og membranene ble inkubert i primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Membraner ble vasket tre ganger i TBST i 10 min hver. Anti-kanin-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz) ble fortynnet 1: 2000 i TBST og inkubert med membranene i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble vasket som ovenfor, og visualisert ved anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) i henhold til produsentens protokoll. For å evaluere den cellulære plasseringen av RPRM, ble immunfluorescens analyse utført. AGS celler transient transfektert med pCMV6-RPRM eller pCMV6 ble dyrket på dekkglass. De forbigående transfekterte AGS-celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur og deretter vasket tre ganger i fosfat-bufret saltvann (PBS). Celler ble permeabilisert i 0,1% Triton-X-100 (Sigma-Aldrich) i 10 minutter, blokkert i 3% BSA i 1 time ved romtemperatur, og deretter merket med et anti-RPRM-antistoff (1: 1000, 38-50, Sigma-Aldrich). Etter vasking med PBS, ble cellene inkubert med en Alexa Fluor 488-konjugert antistoff (1: 200, Molecular Probes, Invitrogene) i 1 time ved romtemperatur. Bilder ble kjøpt opp av fluorescens laser scanning konfokalmikroskopi (se Hjelpemiddel Informasjon S1 og S2 figurene).
Cell kultur og transfeksjon
For stabil transfeksjon eksperimenter, AGS celler ble sådd på 3×10
5 celler /100-mm kultur rett og transfekterte etter 24 timer med pCMV6-RPRM eller pCMV6 (Origene) tom vektor bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens protokoll. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene dyrket under samme betingelser med G418 (500g /ml). Kultur media ble endret hver 24. time i 14 dager.
Colony formasjon analysen
For kolonidannelse analysen ble 200 celler stabilt transfektert med pCMV6-RPRM eller pCMV6 tom vektor. Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone) og supplert med 10% FBS. Kultur media ble skiftet hver 24 timer. Koloniene ble farget med 0,4% krystallfiolett (Sigma) i 50% metanol, 21 dager etter første seeding, og telte 20 bilder tatt under invertert mikroskop (Evos XL Kjerne Cell Imaging System, Life Technologies). Hver transfeksjon ble utført i tre eksemplarer. I tillegg ble gjenskape eksperimenter utført for å oppnå ytterligere kloner for ekspresjon analyse.
forankrings-uavhengig vekst assay
Anchorage uavhengig cellevekst ble analysert ved å plate 1% agarose inneholdende 2×10
5-celler stabilt transfektert med pCMV6-RPRM eller pCMV6 tom vektor i 6-brønns plater. Celler ble tilført ukentlig av overliggende frisk soft-agar-løsning, og kolonier ble fotografert etter 4 ukers inkubering. Forsøket ble utført i tre eksemplarer.
Statistical Analysis
Spearman korrelasjonskoeffisient ble beregnet for å analysere sammenhengen mellom RPRM metylering og genet ekspresjonsnivåene. Kategoriske variabler ble analysert ved Pearson Chi-kvadrat test (tosidig), ble p-verdien korrigeres ved hjelp av en logistisk regresjonsanalyse. Kontinuerlige variabler ble analysert ved hjelp av Student
t
test og data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Kappa-testen ble brukt for å analysere sammenhengen mellom RPRM uttrykk og p73 ekspresjon. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) statistikkpakke og GraphPad Prism5 programvare (La Jolla, CA, USA). Alle verdiene var to-halet, med unntak av Spearman rang korrelasjon. Statistisk signifikans ble definert som p 0,05.
Resultater
RPRM metylering og uttrykk i magekreftcellelinjer
Tidligere har vi og andre har rapportert at RPRM uttrykk kan gjenopprettes ved demethylating agenten 5-aza -2-deoxycytidine (Se Hjelpemiddel Informasjon S3 og S4 figurene) [5,8,18]. Imidlertid RPRM metylering er blitt svakt korrelert med dets ekspresjon [18]. For å undersøke sammenhengen mellom RPRM promotoren metylering og genekspresjon ytterligere, ble den fullstendige promotorområdet av RPRM genet analysert ved DNA-bisulfitt-sekvensering i fire GC cellelinjer (AGS, SNU-1, KATO III og NCI-N87) (figur 1A). Således metyleringen status av 52 CpG-områder, som ligger mellom -207 og +302 nukleotider i forhold til transkripsjons-startsetet (TSS), ble analysert. Denne analysen viser tett metylering i cellelinjer AGS og SNU-1 (89.6% og 86%, respektivt), i forhold til KATO III og NCI-N87 (79,7% og 51,8%, henholdsvis) (p = 0,0002) (fig 1B) . Deretter nivå av RPRM ekspresjon ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Lav RPRM genekspresjon ble observert i AGS og SNU-en i forhold til KATO III og NCI-N87 cellelinjer (p 0,0001) (fig 1c). Ved Spearmans korrelasjonsanalyse viste signifikant negativ korrelasjon ble funnet mellom metylering tetthet og RPRM genuttrykk (r = 1; p = 0,042) (fig 1D). Samlet utgjør disse funnene tyder på at metylering av RPRM promoter regionen spiller en avgjørende rolle i reguleringen av RPRM uttrykk.
A) RPRM promoter region analysert av bisulfit kvantifisering. B) DNA Bisulfite sekvensering i magekreft cellelinjer. C) Relativ uttrykk for RPRM i fire mage kreft cellelinjer ns: ikke significative; * P 0,01; ANOVA test Enveis. D) Spearman rank korrelasjon mellom RPRM uttrykk og formidler metylering status for RPRM. E) RPRM metylering i svulsten og ikke-tumor tilstøtende slimhinnen (NTAM) vev, høyere metylering nivåer i tumorvev er observert i forhold til NTAM i alle seks sammenkoblede GC tilfeller.
RPRM metylering og uttrykk i mage kreft vev
For å underbygge tidligere data i GC vev, ble RPRM metylering nivåer bestemt i 6 sammenkoblede tumor og NTAM prøver. Resultatene indikerer høyere metylering nivåer i tumorvev i forhold til NTAM vev (Se figur 1E). For å undersøke uttrykket av RPRM genproteinproduktet i GC vev IHC analyse ble utført. Positive RPRM ekspresjon ble hovedsakelig observert i cytoplasma av mage-epitelceller. RPRM gen protein ekspresjon ble påvist i 75% (15/20) av NTAM vevsprøver. Men bare 25% (5/20) av tumorprøver viste ekspresjon av RPRM genproteinproduktet (figur 2). Disse forskjellene var svært signifikant (p = 0,001) og foreslår at uttrykk for RPRM er tapt i GC vev. For å evaluere den kliniske betydningen av dette tapet av RPRM uttrykk en kohort av 114 GC tilfeller ble evaluert. Tap av RPRM uttrykk ble funnet i 62% (71/114) av GC tilfeller. Clinicopathological korrelasjoner av RPRM ekspresjon er vist i tabell 1. progresjon fra trinn I til trinn II GC-IV (p = 0,006) og lymfeknutemetastaser (p = 0,037) var signifikant assosiert med tap av ekspresjon av RPRM genproteinproduktet. Imidlertid viser logistisk regresjonsanalyse som bare progresjon fra trinn I til II-IV er signifikant assosiert med tap av RPRM genproteinproduktet (p = 0,020).
A) Representative eksempel på ikke-tumor tilstøtende mucosa (NTAM ) viser positiv cytoplasmisk farging av RPRM i mer enn 30% av cellene. B) Representant eksempel på tumor (T) magekreft prøve som viser negativ farging av RPRM.
Funksjonell analyse av RPRM i magekreft (kolonidannelse og forankringsuavhengig vekst)
Som tap av RPRM uttrykk var assosiert i GC og hovedsakelig med progresjon fra trinn i til II-IV, kan en tumor suppressor rolle RPRM være troverdige. Derfor funksjonelle analyser som
in vitro
kolonidannelse og forankringsuavhengig vekst ble utført i AGS celle transfektert med pCMV6 /RPRM (fig 3A). Ikke-uttrykkende AGS cellelinjer transfektert med ekspresjonsplasmidene RPRM viste en betydelig redusert antall kolonier i forhold til pCMV6- tom vektor-transfiserte cellelinjer transfektert med tom vektor pCMV6-(p 0,05) (figur 3B). Effekten av RPRM overekspresjon på forankrings-uavhengig vekst i myk agar-kolonidannelse assay ble også vurdert i stabile transfekterte cellelinje AGS kloner. Koloniene ble tellet etter innledende såing og inkubering i bløt agar i 4 uker. -Celler transfektert med tom vektor viste robust kolonivekst, etter antall og størrelse av kolonier. Dette ble sterkt redusert da RPRM ble gjen uttrykt i AGS celler (figur 3C).
A) Western blot av AGS celler med overekspresjon av RPRM (pCMV6 /RPRM) og tom kontroll (pCMV6). B) Overuttrykte RPRM i AGS celler (pCMV6 /RPRM) resulterte i en betydelig reduksjon av
in vitro
kolonidannelse sammenlignet med AGS cellelinje transfektert med pCMV6 tom vektor (pCMV6). Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer. Det var en statistisk signifikant reduksjon av kolonidannelse i overekspresjon eksperimenter (* p 0,05). Nedenfor hver graf er representative plater som viser reduksjon av kolonier etter genet overekspresjon Feilfelt; SD. C) Overuttrykte RPRM i AGS celler (pCMV6 /RPRM) resulterte i en betydelig reduksjon av
in vitro
forankringsuavhengig kolonidannelse sammenlignet med AGS cellelinje transfektert med pCMV6 tom vektor (pCMV6). Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer. Det var en statistisk signifikant reduksjon av kolonier dannelse i overekspresjon eksperimentene (* p 0,05). Nedenfor hver graf er representative plater som viser reduksjon av kolonier etter genet overekspresjon Feilfelt; SD
Association of RPRM uttrykk og p53 /p73 tumor suppressor protein familie i magekreft
RPRM har blitt definert som en p53-mediert genet i embryonale fibroblast celler [18]. Imidlertid er det blitt rapportert at reguleringen av RPRM ekspresjonen kan være uavhengig av p53-genet status i neuronale celler behandlet med kobber [19]. På den annen side p73 kan aktivere transkripsjon av p53-responsive gener [20]. Vurderer denne innstillingen, evaluert vi uttrykket av p53 og andre medlemmer av p53 protein familien, p73 TSG. Ekspresjon av p53 ble plassert i kjernen av gastrisk mucosa-celler. Positiv p53 uttrykk ble påvist i 23,5% (20/114) av GC tilfeller. Bare tumorstørrelse var assosiert med ekspresjon av p53 (p = 0,035, tabell 2). Ekspresjon av p73 ble lokalisert i cellekjerner og cytoplasma av epitelceller. Positive p73-ekspresjon ble funnet i 30,6% (34/114) av GC prøver. Interessant nok ble signifikante korrelasjoner clinicopathological av p73 ekspresjonen forbundet med invasiv (trinn I 55,6%; 10/18 til trinn II-IV 25,8%, 24/93, p = 0,012) og lymfeknutemetastaser (p = 0,038) (tabell 2 ). Siden tap av uttrykk for RPRM og p73-genet proteinprodukter har lignende clinicopathological sammenhenger, evaluert vi assosiasjon mellom uttrykk for nivåer av både proteiner. Til dette formål saker ble delt inn i fire grupper etter uttrykk for RPRM og p73 protein produkter. Analysen viste at 22 ut 111 GC tilfellene var positivt for begge RPRM og p73 proteiner, mens 57 ut 111 var negative. Denne foreningen var statistisk signifikant (p 0,0001) med en kappa verdi på 0,363 (tabell 3)
Diskusjoner
RPRM er en svært glykosylert cytoplasma protein, først identifisert. som en nedstrøms effektor av p53-indusert cellesyklus arrest i G2 /M. Tidligere har det blitt foreslått at RPRM er brakt til taushet av arrangøren metylering, selv om det har vært svakt korrelert med sitt uttrykk [5,8]. I tillegg har RPRM blitt foreslått som en antatt tumorsuppressorgen i nyrecellekarsinom og hypofysesvulster [5,6]. I denne studien viste vi at RPRM genuttrykk er sterkt assosiert med sin promoter region metylering status, noe som tyder på epigenetisk stanse av RPRM genuttrykk. I tillegg, viser vi at RPRM genproteinproduktet ble redusert i GC vev sammenlignet med noncancerous gastrisk mucosa. Disse resultatene er lik som Luo
et al
. [11], som rapporterte tap av RPRM i GC sammenlignet med magesår vevsprøver. Videre våre funn angående tap av uttrykk for RPRM i overgangen fra fase I til trinn II-IV er klinisk relevant. Luo
et al
. [11] rapporterte et lignende funn, men i et lite antall trinn I GC tilfeller (n = 15). Disse funnene kan ha klinisk betydning som en prediktiv faktor for utviklingen av GC. Følgelig med dette tapet av RPRM ekspresjon i progresjonen av GC, våre funksjonelle analyser (kolonidannelse og forankringsuavhengig vekst) også foreslått en antatt tumor suppressor rolle for RPRM i GC.
Selv om p53 ble opprinnelig beskrevet som en RPRM spole [10], kliniske studier utført oppdatert har ikke vært i stand til å bekrefte slike funn [6,18]. Her identifiserte vi at tap av RPRM uttrykk korrelerer med tap av uttrykk for et annet medlem av p53-familien, p73. Selv om p73 TSG uttrykkes på et meget lavt nivå i normale humane vev [21], er overuttrykt i mange forskjellige humane cancerformer så som bryst, neuroblastom, lunge, spiserør, mage, tarm, blære og eggstokk [14,22]. I tillegg har det blitt rapportert at p73 kan aktivere transkripsjon av p53-responsive gener, inkludert p21Waf1 /Cip1, Bax, MDM2, cyklin-G, GADD45 og IGFBP3 [20]. Dermed er basert på våre funn, foreslår vi at RPRM uttrykket kan være regulert av p73 i en p53-uavhengig måte.
I sammendraget, våre data tyder på at epigenetisk stanse av RPRM genet ved promoter metylering er forbundet med tap av RPRM uttrykk og følgelig funksjonelle analyser foreslått en antatt tumor suppressor rolle RPRM i GC. I kliniske prøver, er RPRM tapt ved invasive stadier av GC og dens uttrykk korrelerer med at av p73 som tyder på at andre medlemmer av p53-genet familien kan delta i reguleringen av RPRM uttrykk. Videre forskning er garantert å karakter rolle RPRM i utviklingen av GC og validere den biologiske reguleringen av RPRM av p73.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 data. . Data underliggende studien
doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s001 product: (ZIP)
S1 Fig. Effekter av Tunicamicyn på RPRM protein.
RPRM er en svært glykosylert cytoplasmisk protein visualisert 25 kD av Western blot, glykosylering inhibitor tunicamycin (TK) fortrenger 25 kD RPRM bandet til 15 kD i AGS celler med RPRM overekspresjon (pCMV6 /RPRM) (RPRM spådd størrelse 12 kD). Celler ble inkubert i 24 timer i RPMI 1640 med 10% FBS i nærvær eller fravær av en inhibitor av N-glykosylering tunicamicyn (10 ng /ml). RPRM ekspresjon ble bestemt ved Western blotting ved anvendelse av en RPRM polyklonalt antistoff (øvre panel, fortynning 1: 1000, Sigma-Aldrich). Uttrykket av β-aktin (nedre panel, fortynning 1: 2000, Santa Cruz) representerer protein lasting
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s002 plakater (TIF)
S2 Fig. Lokalisering av RPRM uttrykk i overekspresjon AGS cellelinje Immunofluorescensanalyse av RPRM i magekreft AGS cellelinje transfektert med pCMV6 vektor koding RPRM.
24 timer etter transfeksjon cellene ble fiksert i paraformaldehyde 4% og inkubert med anti-RPRM-kanin (1 : 1000, 38-50, Sigma-Aldrich) og sekundære antistoff Alexa Fluor-488 (1: 200, molekylære prober, Invitrogene). Et positivt uttrykk for RPRM (GRØNN) er hovedsakelig sett i cytoplasma. Bilder ble tatt til fange ved hjelp Axio Vision4 flerkanals programvare i fluorescens mikroskop Axio Scope.A1- Zeiss
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s003 plakater (TIF)
S3 Fig. RPRM uttrykk er brakt til taushet av arrangøren metylering.
A) RT-PCR analyse av RPRM mRNA uttrykk i AGS magekreft cellelinje med og uten DNA metylering hemmer 5-azacytidin (1 uM i 72 timer). GAPDH ble anvendt som en kontroll. B) Forsterkning av RPRM ved metylering Spesifikk PCR i AGS magekreft cellelinje. Amplifisering av metylert MYOD1 ble anvendt som kontroll. AGS-cellelinjen ble metylert i det promoter-regionen. NC: negativ kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125834.s004 plakater (TIF)
S4 Fig. RPRM uttrykk er stilnet av promoter metylering (opprinnelig gel).
A) RT-PCR-analyse av mRNA-ekspresjon i RPRM AGS magekreft cellelinje med og uten DNA-metylering inhibitoren 5-azacytidin (1 uM i 72 timer). GAPDH ble anvendt som en kontroll. B) Forsterkning av RPRM ved metylering Spesifikk PCR i AGS magekreft cellelinje. Amplifisering av metylert MYOD1 ble anvendt som kontroll. AGS-cellelinjen ble metylert i det promoter-regionen. NC:. Negativ kontroll
doi: 10,1371 /journal.pone.0125834.s005 plakater (TIFF)
Takk
Vi vil gjerne takke Sabina Magedson for hennes bidrag i å bygge microarray. Vi vil også gjerne takke Hiroshi Kawachi for histologisk vurdering av saker, Ignacio Wichmann for deres verdifulle kommentarer på vår manuskript og Oslando Padilla for hans viktige støtte i statistisk analyse.
