Abstract
xenografter av human tykktarmskreft (CRC) i immun-mangelfull mus har stort potensial for akselererende studie av tumorbiologi og terapi. Vi evaluerte xenografter etablert i NOD /SCID /IL2Rγ-null mus fra primær eller metastatiske svulster i 27 pasienter med CRC å anslå deres evne til å utvide kreftceller for
in vitro
studier og å vurdere hvor trofast de rekapitulert den transcriptional profilen til foreldre svulster. RNA-seq analyse av foreldre menneskelige CRC svulster og deres derivative xenografter vist at reproduserbare transkripsjons endringer preger den menneskelige svulsten til murine xenograft overgang. I de fleste, men ikke alle tilfeller ble de menneskelige stroma, blodkar og blodkreft elementer systematisk erstattet av murine analoger mens carcinoma komponent vedvarte. Når etablert som xenotransplantater, humane CRC-celler som kan bli spredd av serietransplantasjon forble transkripsjonelt stabil. Tre histologisk atypiske xenotransplantater, etablert fra pasienter med peritoneal-metastaser, inneholdt tallrike humane stromale elementer og blodkar i tillegg til humane tumorceller. De transcriptomes av disse blandede svulst /stromal xenografter ikke likne de av foreldre svulster, og forsøk på å forplante slike transplantater etter serietransplantasjon var mislykket. Stabil uttrykk av mange gener som tidligere er identifisert så høyt prioriterte mål for immunterapi ble observert i de fleste xenograft linjene. Avvikende uttrykk i CRC celler av menneskelige gener som normalt bare uttrykt i hematopoetiske celler ble også observert. Våre resultater tyder på at menneskelige CRC celler utvidet i murine xenografter ha stor nytte for studier av svulst immunobiology og målrettede behandlinger som immunterapi, men også identifisere potensielle begrensninger
Citation. Chou J, Fitzgibbon MP, Mortales C-LL, Towlerton AMH, Upton MP, Yeung RS, et al. (2013) Fenotypisk og Transkripsjonell Fidelity av Pasient-Avledet Colon Cancer xenografter i Immune-mangelfull mus. PLoS ONE 8 (11): e79874. doi: 10,1371 /journal.pone.0079874
Redaktør: Siu Tim Cheung, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 22 april 2013; Godkjent: 26 september 2013; Publisert: 20.11.2013
Copyright: © 2013 Chou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en postdoktorstilling i kreft immunologi fra Irvington Institute of Cancer Research Institute (JC) (www.cancerresearch.org), J. Orin Edson Fund for Immunterapi, en klinisk forsker Award i translasjonell forskning (# 1007475) fra Burroughs Wellcome fondet (EHW) (www.bwfund.org), et stipend fra Department of Defense (W81XWH-12-0349) (MPF og MWM) (cdmrp.army.mil), og tilskudd fra NCI /NIH: SAIC kontrakt # HHSN261200800001E (MPF og MWM), U01 CA176270 (MWM og EHW), og P30 DK56465 (til B. Torok-Storb) (www.nih.gov). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Fersk resected primære og metastatisk kolorektal kreft (CRC) [1], [2], som mange andre typer menneskelig hematologisk og solide tumorer, kan etableres som xenotransplantater i immun-mangelfull mus som NOD /
SCID Twitter /IL2Rγ – /- (NSG) belastning og spredte langsiktig via seriell transplantasjon. CRC xenotransplantater gi en attraktiv modellsystem for å studere tumorbiologi og terapi. I motsetning til CRC cellelinjer etablert fra ferske kirurgiske vev ofte mister viktige kjennetegn ved foreldre humane tumorer når de har tilpasset seg, og blitt dyrket i,
in vitro
kultur, pasient avledet CRC xenografter gjengi mange av fenotypiske og genotypiske trekk ved sperre tumorer fra hvilken de er utledet [1] – [17]. Analyse av pasient avledet CRC xenografter fullstendig har vår forståelse av svulst arkitektur, heterogenitet, og andre kritiske aspekter av tumorbiologi. CRC xenotransplantater også har godt potensial for bruk som modellsystemer i å utforske behandling med kjemoterapeutiske midler [9] – [13], [17], så vel som nye former for målrettet CRC behandling som for eksempel immunterapi [11], [17], [18]. I tillegg kan evnen til å forplante human CRC i immun-manglende mus potensielt gi en fornybar tilførsel av CRC-celler for anvendelse i
in vitro-studier
.
Forskjeller mellom humane CRC-tumorer og deres deriverte xenotransplantater imidlertid finnes. Mest betydningsfulle er den konsekvente observasjonen at CRC-xenotransplantater støttes av murin, snarere enn humant, stroma [7], [9], [15], [16]. Følgelig, CRC xenotransplantater tilbyr en mulighet til å evaluere transkriptomet av humane karsinomceller atskilt fra den til den bærende human stroma. Dyp transcriptional analyse av CRC xenotransplantater kan derfor hjelpe til med forståelsen av publiserte transkripsjonelle analyser av ferskt resekterte humane CRC tumorer, som representerer en blanding av både human stroma og karsinom [19], [20]. I hvilken grad interaksjon med murine stroma og blodkar påvirker den transkripsjonelle profilen av de humane tumorceller i xenograft er ikke blitt undersøkt til dags dato med metoder som tillater entydig diskriminering mellom menneske transkripter avledet fra tumorceller og murine transkripter avledet fra stroma og blodkar. Vi foretok derfor en omfattende studie av morfologi og transkripsjons profiler av et panel av xenografter etablert i NSG mus fra ferske resected primære og metastatiske menneske tykktarm kreft, for å evaluere den troskap som de xenografter rekapitulert transkripsjons profiler og unike molekylære funksjoner i foreldre humane tumorer som de ble hentet. Den transkripsjonelle analyse ble utført med RNA-seq, som tillater bestemmelse av human eller murin opprinnelse av transkriptene med en høy grad av sikkerhet. For å vurdere stabiliteten av disse funksjonene gjennom serie transplantasjon, også utførte vi detaljert transkripsjonen analyse av en xenograft avstamning som ble etablert fra en enkelt primære humane kolon svulsten og har senere blitt spredd gjennom ti generasjoner av NSG mottakere. Vi har fastslått at xenotransplantasjon av humane tykktarmskreft er karakterisert ved reproduserbar biologisk og transkripsjonelle forandringer som karakteriserer den menneskelige til muse-overgang, noe som i de fleste tilfeller velge for en transkripsjonelt stabil svulst befolkning støttet av murine stroma og blodkar. I tillegg identifiserte vi gensettene selektivt uttrykt i epitel (karsinom) eller stromal komponenter av CRC xenografter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Kirurgiske prøver av primær eller metastatisk kolorektalcancer ble hentet fra avidentifiserte givere gjennom Cooperative menneskelig vev Network (CHTN, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee), eller fra individer som blir behandlet ved University of Washington (UW) Medical Center (Seattle, Washington) som ga skriftlig informert samtykke i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Review Board of UW /Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) Cancer Consortium. Undersøkelse av humane prøver ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene som finnes i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, 8
th Edition (National Research Council, National Academies Press). Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité for FHCRC. Alle operasjoner ble utført under tribromoethanol anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Transport og behandling av vevsprøver
Fersk resected metastatisk tumor og /eller primær tumor kolorektal kreft prøver hentet fra CHTN (23 unike pasienter, 24 eksemplarer) eller lokalt (27 unike pasienter, 33 eksemplarer) ble plassert i transportmedium bestående av DMEM /F12-medium (Hyclone) supplert med 10 ug /ml ciprofloxacin (Bayer), 1% penicillin /streptomycin ( 10 000 U /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin) (Invitrogen), og 0,5 mikrogram /ml amfotericin B (Invitrogen). De ble sendt over natten på is for behandling av påfølgende dag (CHTN tumorer) eller transportert innen én time etter behandling på den samme dag (UW-tumorer). Små porsjoner av hver tumor ble flash frosset eller plassert i RNAlater (Life Technologies) og også plassert i formalin. Balansen av hver tumor ble skylt med fosfatbufret saltvann (Invitrogen), og deretter reduseres til en enkeltcelle-suspensjon via mekanisk ødeleggelse, og enzymatisk nedbrytning i løpet av 1-2 timer i DMEM /F12-baserte transportmedium supplert med 4,66 ug /ml heparin natrium (Sigma), 2% B27 supplement (Invitrogen), og 5% KnockOut Serum erstatning (Invitrogen), 1 mg /ml Collagenase I (Sigma), 0,1 mg /mL, Hyaluronidase og 0,1 mg /ml DNase I (Worthington Biochemical) . Fordøyd celler ble vasket med enzymfritt medium og resuspendert i 30-50 mL Matrigel (BD Biosciences) før injeksjon.
Primære xenotransplantater ble etablert ved å injisere en enkelt cellesuspensjon (1 × 10
4-2 x 10
6 celler) fremstilt fra kolorektal kreft prøvene enten under nyrekapselen [21] (fra n = 14 unike pasienter) og /eller subkutant i flankene (n = 46 pasienter) i 6-12 uker gamle hann eller kvinnelig sublethally γ-bestrålte (250 cGy ved 20 cGy /min) NSG mus reist på Fred Hutchinson Cancer Research Center. Intervallet mellom kirurgisk reseksjon og mus injeksjon var 24-30 timer for colontumorer hentet fra CHTN og 3-6 timer for svulster hentet lokalt. Fem fordøyd tumorprøver ble beriket for CD133
+ celler før injeksjon, ved hjelp av magnetiske kuler konjugert til anti-CD133 antistoff (Miltenyi Biotec) i henhold til produsentens anvisninger. Mus med gradvis forstørring svulster fikk lov til å overleve til svulstene nådd en diameter på 2 cm, manifestert de tegn på lidelse, eller de vedvarende 20% vekttap, noe som medførte at de ble avlivet for svulst innhøsting. Stykker av høstet xenograft ble umiddelbart frosset flash eller plassert i RNAlater som er lagt inn i formalin for etterfølgende histologi, og plassert i transportmedium og behandlet på en identisk måte til den opprinnelige humane tumor for serie transplantasjon inn i et annet NSG vert.
immunhistokjemi og mikros~~POS=TRUNC
Formalin fiksert, parafininnstøpte vevssnitt fra resected tykktarmskreft prøver eller xenografter ble preparert for mikroskopi ved farging med hematoxylin og eosin, eller med antistoffer mot human leukocytt antigen (HLA) klasse i (MBL Corporation), carcinoembryonic antigen (CEA) (Novus), cytokeratin 20 (CK20) (Dako), Ki-67 (Dako), CD31 (Dako), epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM) (Novus), E-cadherin (Cell Marque ), programmert død-en (PD1) (Cell Marque), vimentin (Dako), fibronektin (Dako), CD4 (Novacastra), CD8 (Novacastra), og CD3 (Novacastra) i henhold til produsentens instruksjoner. Positive og negative kontroller ble utført for hvert antistoff. Slides ble vist på en Nikon E800 Eclipse mikroskop, og bildene ble kjøpt med et Olympus Magnafire SP kamera og Magnafire programvare (Optronics).
flowcytometrisystemer
En enkelt cellesuspensjon fremstilt av en xenograft avledet fra D61540.T2 var farget med Qdot 525 nanocrystal (Invitrogen) for live og døde celledifferensiering, fluorescein (FITC) konjugert anti-PD-1 antistoff (BD Biosciences), og fysoerytrin (PE) konjugert anti-CTLA-4 antistoff (BD Biosciences). Data ble ervervet på en FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences) og analysert med Kaluza programvare (Beckman Coulter).
RNA-seq Prøvepreparering og sekvense
RNA ble ekstrahert fra prøver ved hjelp RNeasy Plus Mini eller AllPrep RNA /kits DNA (QIAGEN). Kvaliteten på RNA ble vurdert på en Agilent 2100 Bioanalyzer. Prøver med RNA integritet nummer (RIN) større enn 7 ble fortynnet til 50 ng /mL for sekvensering bibliotek forberedelse med TruSeq Prøvepreparering Kit (Illumina). Fra og med ca 1 mikrogram total RNA, ble mRNA isolert med oligo-dT fangst perler, så fragmentert og konvertert til cDNA med tilfeldig heksamer-primet revers transkripsjon og andre-strand syntese. Resulterende cDNA ble fragmentert av lydbehandling og størrelse valgt for molekyler av ~300 bp. Ligering av strekkode sekvense adaptere ble deretter utført i henhold til produsentens anbefalinger. CDNA prøvene gjennomgikk multiplex sekvensering, med ett til fire prøver per kjørefelt, på Illumina HiSeq 2000 for å gi 50 bp parvise end sekvenser. Denne prosessen ga mellom 54,6 m og 367,0 M sekvenser passerer standard Illumina kvalitetskontroll filtre.
Kvantitativ PCR
kryopreserveres celler fra P2726.Ov ble behandlet med en død celle Removal Kit (Miltenyi Biotec) og deretter sortert i EpCAM
– og EpCAM
+ fraksjoner med magnetiske kuler konjugert til menneskelig EpCAM-spesifikt antistoff (Miltenyi Biotec). RNA ble ekstrahert fra hver fraksjon, og cDNA ble fremstilt ved bruk av oligo-dT og tilfeldige heksamerprimere fra First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). De 5 «og 3» primere for kvantitativ PCR (qPCR) ble konstruert ved anvendelse av enten qPrimerDepot [22] eller Primer-BLAST [23] (tabell S1 i File S4). Standard SYBR Grønn (Roche) qPCR utført på en ABI Prism 7900HT ble brukt til å påvise genet transkripsjoner. Fluorescens data ble analysert i LinRegPCR [24], og den estimerte startkonsentrasjon (N
0) av hvert gen ble normalisert mot at husholdningsgenet
GAPDH
. Den menneskelige opprinnelse PCR amplikonene fra xenografter ble verifisert ved dissosiasjon kurve analyse.
RNA-seq dataanalyse
For hver prøve, alle sammen leser passerer kvalitets filtrene ble behandlet med TopHat splice- klar kortlese aligner [25]. For xenograft prøvene, ansatt vi en enkel konservativ filter strategi for å skille menneskelig leser, som følge av de innpodet humane tumorceller fra mus leser forventes å bli samplet fra å støtte murine vev. I denne strategien ble Hat brukes til å justere leser til både menneskelig (hg19) og mus (MM9) henvisning genom forsamlinger. Leser som matchet det menneskelige genom med høyere fidelity (færre mismatching baser) ble beholdt som menneske leser. De som matchet musen genomet med høyere kvalitet ble beholdt som muse. Leser søker begge genomer med lik nøyaktighet ble plassert i en tredje «tvetydig» klasse og ikke betraktet videre. Å tillate nyttig sammenligning mellom mennesketumorprøver (gratis ved bygging forurenser mus sekvenser) og avledet xenografter, behandlet vi de humane prøver gjennom den samme filtre rørledningen. Færre enn 0,2% av lyder fra disse utelukkende humane prøver ble feilaktig merket som opprinnelse i mus, noe som tyder på at vår filter strategi har en lav feilklassifisering rate. Tabell 1 oppsummerer sekvense yield, som strekker seg fra minst 5 GB til over 30 GB per prøve, sammen med andelen leser i hver prøve klassifisert som menneske, mus, eller tvetydig. Sekvense data er tilgjengelige i NCBI Sequence Les Archive (tiltredelse #: SRP028952).
Gene-nivå lese tellinger ble generert fra menneske og mus justert leser bruker HTSeq pakken (http: //www- huber.embl.de/users/anders/HTSeq). Les tellinger ble generert med htseq-count script for hvert menneske og mus gen locus i en union av RefSeq og UCSC KnownGenes samlinger knyttet til menneskelig hg19 og MM9 forsamlinger. Leser helt inne i noen exon av et gen modell ble tilskrevet at genet. Lese teller for hvert gen ble normalisert ved å dele dem med det totale antall leser, i millioner, innhentet for at prøven.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført i R miljø for statistisk databehandling og Microsoft Excel. Unsupervised hierarkisk klynge analyse av genekspresjon data ble utført ved å bruke R miljø for statistisk databehandling. Pakken Kantskjærer 3.0.2 [26] ble anvendt for å identifisere gener som er differensielt uttrykt i to eller flere prøver. Tagwise dispersjoner ble beregnet for hvert gen ved hjelp av generalisert lineær modell metode, og sannsynligheten ratio tester ble beregnet mellom par av prøvesettene. Gener med falske funnrate på 0,05 etter Benjamini-Hochberg justering [27] for multiple sammenligninger ble definert som uttrykt forskjellig. Over- eller underrepresentert gensettene blant differensielt uttrykte gener ble identifisert ved hjelp av R-pakken goseq 1.10.0 [28], med den kanoniske sti og kjemiske og genetiske perturbasjon gensettene fra Molecular Signaturer Database (MSigDB) v3.0 [29] . Den Wallenius ikke-sentrale hypergeometrisk fordeling metoden ble brukt til å anslå fordelingen av genet sett medlemmer blant de differensielt uttrykte gener.
tumorvekst kurvene ble montert ligningen med dobling tid definert som og egnethets målt ved determinantkoeffisient R
2. De to-tailed Fishers eksakte test ble brukt for sammenligninger av kategoriske data mellom to grupper mens tosidige t-test ble brukt for sammenligninger av kvantitative data mellom to grupper.
Resultater
Erfaring med Generere og formeringsmateriale CRC xenografter
en fordel med xenotransplantasjon er at det potensielt gir en metode for å spre CRC celler på ubestemt tid og trofast gjenskaper den originale foreldre menneskelige svulst. Vi har søkt å utvikle en protokoll som vil mest effektivt oppnå dette målet. Sublethally bestrålte NSG mus ble injisert med enkeltcellesuspensjoner fremstilt fra tumorprøver uten langvarig gripe
in vitro
kultur som potensielt kan velge for tilpasninger som ikke finnes i den opprinnelige menneskelige svulst. Totalt 33 av 57 kirurgiske prøver hentet fra 27 av 50 enkeltpasienter med enten lokoregionalt og /eller metastatisk CRC (tabell S2 i File S4) ble opprettet som xenografter.
I utgangspunktet injeksjon av CRC tumorceller anriket før implantering av celler som uttrykker den antatte CRC stamcelle markør CD133
+ ble sammenlignet med injeksjon av bulk, usorterte tumorceller for å etablere xenografter fordi det tidligere har vært forbundet med en høyere sannsynlighet for innpoding [1], [2] . Når det er mulig, det maksimale antall CD133
+ – sorterte cellene eller bulk, usorterte celler som kan oppnås fra en tumor ble injisert i en dose på opp til 2 x 10
6 celler. Selv om injeksjon av 1 x 10
4 CD133
+ – sorterte cellene var i noen tilfeller tilstrekkelig for å etablere en xenograft (Tabeller S2 og S3 i File S4), de samlede tallene for engraftment for CD133
+ – sortert cellene var ikke signifikant bedre enn for bulkvarer, usorterte celler (2/5 sammenlignet med 25/45, henholdsvis). Gitt at både CD133
– og CD133
+ celler fra metastatisk CRC svulster har potensial til å etablere transplantater [6], og, for å fange heterogenitet av den opprinnelige menneskelige svulst så mye som mulig, var avgjørelsen laget for å bruke usorterte CRC kreftceller for xenotransplantasjon i alle senere forsøk. Vi har også, sammenlignet implantasjon av tumorceller under nyrekapselen med subkutan implantering, i lys av publiserte rapporter om høy forekomst av innpoding av CRC-celler etter infra-nyrekapselen injeksjon [1]. Når samtidige injeksjoner av et likt antall CRC-celler fra samme tumor ble gjort i flanken og under nyrekapselen av 3 forskjellige mus, de resulterende subkutane svulstene var langt større enn de som utvikles i nyren. Videre ble subkutan injeksjon av celler i flanken assosiert med en høyere rate av xenograft etablering enn subcapsular injeksjon (3/14 vs. 26/45,
p
= 0,03 ved tosidig Fishers eksakte test) (Tabell S2 og S3 i File S4), og var assosiert med mindre sykelighet og tidlig død, med tidlige dødsfall på ≤1 uke forekommer i 14 av 30 mus som fikk subcapsular injeksjoner og 6 av 208 mus som fikk subkutane implantater alene (
p
= 0,0001).
Basert på disse foreløpige observasjoner, subkutan injeksjon av bulk, usorterte CRC celler i flanken ble brukt i alle senere eksperimenter for å etablere CRC xenografter. De xenografter etablert på denne måten ble retrospektivt analysert for egenskaper som kan være forbundet med foretrukne engraftment. Det var ingen signifikant sammenheng mellom engraftment suksess og de kliniske kjennetegn ved pasientene som ble hentet svulster (tabell S4 i File S4). Mannlig pasient kjønn var forbundet med en trend mot overlegen engraftment (
p
= 0,06). Det midlere antall celler injisert i vellykkede og mislykkede engraftment forsøk var signifikant forskjellig -1,2 x 10
6 (område: 2 x 10
5-2 x 10
6) celler i vellykkede injeksjoner lignet med 8,8 x 10
5 (område: 1 × 10
4-2 × 10
6) i mislykkede forsøk (
p
= 0,04)
serie~~POS=TRUNC xenotransplantater ble etablert fra. 18 av 26 første generasjon, 11 ut av 14 andre-generasjon, og 8 av 8 tredje generasjons xenografter. Noen xenotransplantater ble ikke passert grunnet liten størrelse (≤1 mm i diameter), uventet musen død før svulsten innhøstingen, eller utilgjengelighet av mottaker NSG mus. Av de 26 første generasjon xenografter som serieaging ble forsøkt, de som hadde vist eksponentiell vekst viste en høyere rate av engrafting i andre generasjon enn de som ikke gjorde det (16/20 vs 2/6, henholdsvis
p
= 0,05), og ingen av xenografter som ikke klarte å vise eksponensiell vekst kan være vellykket passert utover andre generasjon. Alle de xenograft linjer som ble passert forbi den andre generasjon ga betydelige tumorer 5 mm, og kan vokse til den maksimalt tillatte tumorstørrelse på 2 cm. En primære kolon tumor (D55949) og en metastatisk tumor (P2726) var begge serie transplantert gjennom 10 generasjoner. Forsterkningen i humane tumorcelleantall gjort mulig ved xenografting var i de fleste tilfeller er minst 50 ganger fra den opprinnelige cellen dose for hver generasjon, slik at for effektiv og rask utvidelse av CRC-celler.
Histologi av CRC og svulster sine Derivative xenografter
de fleste første generasjons xenografter demonstrerte løst kjertel morfologi med veldefinerte epitel og stromal komponenter, likner foreldre humane tumorer (PHTs) som de ble avledet (figur 1 og figur S1 fig S2). Homogen ekspresjon av human klasse I hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) molekyler ble observert i alle CRC-kirurgiske prøver undersøkt i dette studiet, uavhengig av deres avledning fra primære tumorer eller fra tilbakevendende /metastatiske lesjoner. Uttrykk for menneskelig klasse I MHC i første generasjon xenografter viste imidlertid to forskjellige mønstre. Alle første-generasjons xenotransplantater avledet fra primære tumorer og alle men tre av de som er avledet fra tilbakevendende /metastatiske lesjoner viste homogen ekspresjon av human klasse I MHC i epitel-komponenter, men fravær av ekspresjon i de stromale komponenter (fig 1 og Fig S1 fig S2 ), noe som tyder på at stroma i disse xenotransplantater var av murin opprinnelse, som tidligere har blitt rapportert [7], [9]. Disse xenotransplantater vil bli referert til som carcinoma xenotransplantater (CXS). I motsetning til første generasjon xenografter avledet fra tre forskjellige pasienter (P2726, P2750 og P2825) var hovedsakelig stromal i morfologi og viste uttrykk for menneskelig klasse I MHC i begge sine epitel og stromal komponenter, noe som viser at stroma i disse xenotransplantater var på i det minste delvis består av humane celler (figur 1 og figur S3). Alle tre av disse pasientene hadde peritoneal spredning av sykdommen. Disse stromale xenografter (SxS) ble avledet fra peritoneal metastaser hos pasienter P2750 og P2825 og fra ondartet ascitesvæske av pasient P2726, fra hvis eggstokkene metastaser flere CX linjene med den typiske menneskelige svulst /muse stroma sammensetning ble også generert. Immunhistokjemisk farging med antistoffer som er spesifikke for humant vimentin, en stromal protein, bekreftet tilstedeværelsen av tallrike humane vimentin i de tre sxs, mens farging med human E-cadherin-spesifikke antistoffer viste at epitel-tumorceller innbefattet en liten brøkdel av celler i disse sxs ( figurene 1 og fig S3)
Hver rad i (A) -. (C) omfatter mikrografer av vevssnitt fra en enkel foreldre human tumor xenograft eller murine. (A) Venstre kolonne: vevssnitt farget med hematoksylin og eosin (H + E). Påfølgende kolonner, fra venstre til høyre: vevssnitt farget for human leukocytt antigen klasse I (HLA-ABC), epitelial markør E-cadherin, mesenchymale markør vimentin, endotelial markør PECAM1, og T-cellemarkør CD3. Radene, fra topp til bunn, viser histologiske trekk ved foreldre humane tumorer fra D61540, P2726 og P2750, sammen med sine første generasjons xenografter. Den histologi av stroma-dominerende xenograft utviklet fra P2726 ascitesvæske er også vist i den femte rad; den hvite pilen i E-cadherin-mikros i denne raden indikerer et lite fokus på kreftceller. Pilspisser i PECAM1 micrograph for P2750.Tu.X1 xenograft indikere områder med PECAM-en-immunoreactive celler. Alle bilder ble oppnådd ved 200x forstørrelse. Hvit skala bar i øverste venstre mikrograf representerer 200 mikrometer.
Immunohistochemistry (IHC) viste også at de vasculatures av CXS og SxS, som med sine stromal elementer, var av avvikende opprinnelse. En undergruppe av foreldre humane tumorer som er forbundet med de første generasjon xenotransplantater ble kontrollert for ekspresjon av human blodplate endotelial celleadhesjonsmolekyl (PECAM-1; CD31), som er selektivt uttrykt i humane endotelceller og undergrupper av hematopoetiske celler. Immunreaktiviteten til humane PECAM-1 ble observert i alle de PHTs, som forventet, men ikke i deres avledede CXS. Begge sxs imidlertid påvist ekspresjon av human PECAM-1, selv om fordelingen av humane PECAM-1-immunreaktive celler i sxs var noe uregelmessig og ikke helt rekapitulere fordeling av slike celler som ble vanligvis observert i de PHTs ( figurene 1 og fig S3). Tilstedeværelsen av menneskelige stroma i SxS men dens fravær fra CXS ble speilet av et lignende mønster av menneskelig CD3 uttrykk. IHC viste at CXS ikke i alminnelighet inneholde celler som farget med antistoffer til human CD3 og CD8, i samsvar med tap av menneskeliv infiltrerende CD3
+ og CD8
+ -celler fra deres avledede xenografter. Noe overraskende, både av sxs imidlertid inneholdt celler som uttrykte human CD3 og CD8 og var mest sannsynlig gjenværende humane T-celler som var blitt ko-injisert med tumorcelle inokulum, vedvarte i sxs, og infiltrert xenotransplantater større utstrekning enn tIL fra PHT (figur 1 og figur S3, og data ikke vist).
histologiske karakteristika for sekundære og påfølgende generasjon CXS var generelt ganske lik de i de foregående generasjon CXS hvorfra de ble avledet . Epiteliale komponent i de fleste CX linjene opprettholdt sterk ekspresjon av både EpCAM og CEA gjennom serietransplantasjon, og antallet og fordelingen av celler som uttrykker Ki-67 likeledes holdt seg stabil (figur S2A). Stroma og vaskulaturen av disse CX linjene var gjennomgående negative for ekspresjon av human klasse I MHC (figur S2A), noe som tyder på at de var stabilt understøttet av murine stromaceller og blodkar.
Global Transkripsjonell Analyse av kolorektale tumorer og og xenotransplantater
RNA-seq ble anvendt for å definere den menneskelige og, for xenotransplantater, muse-transkripsjonelle profiler av 4 tykktarmskreft prøvene -2 primærsvulster og metastatiske tumorer 2, 11 xenografter ble etablert fra disse tumorprøver, og en prøve av normal kolon ved siden av en av de metastatiske svulster (P2750) (filer S1 og S2). For å vurdere reproduserbarheten av RNA-seq analyse av tykktarmskreft prøver og deres avledede xenografter, sammenlignet vi transkripsjons profiler av de to halvdelene av en delt i to hoved kolon svulst fra pasient D61540. Denne analysen viste tett korrelasjon (Pearson koeffisient r = 0,985) mellom uttrykket nivåer av alle humane gener i de to halvdeler av prøven (figur 2A). Det ble observert en tilsvarende tett korrelasjon (r = 0,975) mellom transkripsjons profiler av de synkront resected men ikke-sammenhengende eggstokkene og oment metastaser fra pasient P2726 (figur 2A).
Spredningsplott viser normaliserte avskrift teller (i tellinger per million) for individuelle menneskegener i de to prøvene som er angitt på
x
– og
y
-axes. Røde kors viser konsensushusholdningsgener [50]. Ikke-husholdningsgener er angitt med sirkler eller fiolette gule trekanter: fiolett sirkler representerer gener som blir uttrykt på et eller annet nivå i begge prøver, og gule trekanter langs aksene representerer gener som blir uttrykt i en prøve, men ikke den andre. Pearsons korrelasjonskoeffisient på tvers av alle genene for hver parvise sammenligningen vises i svart over øvre venstre hjørne av hver tomt; korrelasjonen for undergruppe av housekeeping gener er angitt i rødt. Den diagonale linje er det geometriske sted for punkter for hvilke x = y. (A) Sammenligninger av uttrykket nivået av menneskets gener i de to halvdelene av bisected kolorektal svulst fra D61540 (venstre panel) og i eggstokkene og oment metastaser fra P2726 (høyre panel). (B) Sammenligninger av uttrykket nivået av menneskegener i tre foreldre humane tumorer (D61540.T2, P2726.Ov, og P2750.Tu, fra venstre til høyre) og i sine første generasjons xenografter (D61540.T2.X1, P2726 .Ov.X1, og P2750.Tu.X1). (C) Sammenligning av de menneskelige genuttrykk nivåer i atypisk stroma-dominerende xenograft etablert fra P2750 og i sin første generasjon xenograft. (D) Mean vekstkinetikk CXS (n = 5) avledet fra eggstokkene og oment metastaser av P2726 (P2726.Mets.X1) er angitt med sorte diamanter som kobles sammen med fet linje, sammenlignet med vekstkinetikk SX avledet fra ascitesvæsken av P2726 (P2726.As.X1) angitt med de grå rutene er koblet sammen med den grå linjen. Alle xenotransplantater ble etablert ved å injisere 2 × 10
6 celler inn i flanken av en NSG mus. Tabell S1. Tabell S2. Tabell S3. Tabell S4. Tabell S5.
