Abstract
Bakgrunn
erythroblastosis virus E26 trans sekvenser (
ETS
) familie av transkripsjonsfaktorer består av et høyt konservert gruppe gener som spiller viktige roller i cellulær proliferasjon, differensiering, migrasjon og invasjon. Translokasjon fusing ETS faktorer til arrangører av androgen responsive gener har blitt funnet i prostatakreft, inkludert de mest klinisk aggressive former. ERG og ETV1 er de mest translokerte ETS proteiner. Over-ekspresjon av disse proteiner i prostatakreftceller resulterer i en mer invasive fenotype. Inhibering av ETS aktivitet av lavmolekylære inhibitorer kan tilveiebringe en ny fremgangsmåte for behandling av prostatacancer.
metoder og resultater
Vi har nylig vist at det lille molekylet YK-4-279 hemmer biologisk aktivitet av ETV1 i fusion-positive prostatakreftceller fører til redusert bevegelighet og invasjon
in vitro
. Her presenterer vi data fra en
in vivo
mus xenograft modell. SCID-beige mus ble subkutant implantert med fusion-positive LNCaP-luc-M6 og fusion-negative PC-3M-luc-C6 svulster. Dyrene ble behandlet med YK-4-279, og dens virkning på primærtumorvekst og lungemetastase ble evaluert. YK-4-279 behandling resulterte i redusert vekst av primærtumor bare i LNCaP-luc-M6 kohort. Når primære tumorer ble dyrket til sammenlignbare størrelser, YK-4-279 hemmet tumormetastase til lungene. Uttrykk av ETV1 målgener MMP7, FKBP10 og GLYATL2 ble redusert i YK-4-279 behandlede dyr. ETS fusion-negative PC-3M-luc-C6 xenografter var ikke svarer til det sammensatte. Videre er YK-4-279 et chiralt molekyl som eksisterer som en racemisk blanding av R- og S-enantiomerer. Vi fastslått at (S) -YK-4-279 er den aktive enantiomeren i prostatakreftceller.
Konklusjon
Våre resultater viser at YK-4-279 er en potent hemmer av ETV1 og hemmer både primærtumorvekst og metastasering av fusion positiv prostatakreft xenografter. Derfor kan YK-4-279 eller lignende forbindelser vurderes som et potensielt terapeutisk verktøy ved behandling av human prostatakreft på forskjellige stadier
relasjon:. Rahim S, Minas T, Hong SH, Justvig S, Çelik H , Kont YS, et al. (2014) et lite molekyl hemmer av ETV1, YK-4-279, Forhindrer Prostate Cancer vekst og metastase i en mus xenograft modell. PLoS ONE 9 (12): e114260. doi: 10,1371 /journal.pone.0114260
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 21. mai 2014; Godkjent: 05.11.2014; Publisert: 05.12.2014
Copyright: © 2014 Rahim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Disse eksperimentene ble først og fremst støttet av en bevilgning fra Department of Defense congressionally Regissert Medical Research Program (PC111510, PI: Aykut Uren, http: //cdmrp.army.mil/). De farmakokinetiske Forsøkene ble støttet av Analytical Pharmacology kjernen i Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center ved Johns Hopkins (NIH tilskudd P30 CA006973 og UL1 RR025005, og Delte Instrument Grant (1S10RR026824-01), https://grants.nih.gov/tilskudd /oer.htm). BIAcore forsøk ble gjort på Genomics og Epigenomics delt ressurs, som er støttet av CCSG Grant P30 CA051008-16 (Lou Weiner, PI), https://cancercenters.cancer.gov/grants_funding/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: USPTO tildelt for YK-4-279 til Georgetown University, oppfinnere inkludere. Y.K., M.B., J.T. og A.Ü. En lisensavtale har blitt utført mellom Georgetown University og Tokalas Inc for disse patentene, der J.T. er en av grunnleggerne aksjonær. Georgetown University har innlevert patentsøknader på YK-4279 samt relaterte forbindelser og derivater av disse molekylene. Nedenfor er en oppsummering av de utstedte og patentsøknader relatert til disse forbindelsene. I. «målretting av EWS-FLI som Anti-Tumor Therapy» (GU Reference # 2006-041) 1. US midlertidig anvendelse (60/877856) innlevert 29. desember 2006. 2. PCT /US07 /089118 innlevert 28 desember 2007 . 3. US midlertidig anvendelse (61/177932) innlevert 13. mai 2009. 4. USA ikke foreløpig 12/494 191 innlevert 29 juni 2009 ((CIP) hevder prioritet til både PCT og amerikanske foreløpige søknader, nasjonal fase oppføring av PCT); utgitt som US Patent 8,232,310. 5. USA ikke foreløpig 12/720 616 innlevert 09.03.2010 (CONT). 6. Europa 07.872.364,0 innlevert 28 desember 2007 (nasjonal fase oppføring av PCT). 7. Canada 2711003 innlevert 28 desember 2007 (nasjonal fase oppføring av PCT). 8. Australia 2007341977 innlevert 28 desember 2007 (nasjonal fase oppføring av PCT). 9. USA Provisional 61/405 170 innlevert 20 oktober 2010 (inneholder tilleggsdata). 10. Europa 13.186.704,6 divisjons Europa 07.872.364,0 prioritet til 28. desember 2007. II. «Metoder og preparater for behandling av Ewings sarkom Familie av svulster» (GU Reference # 2012-019) 1. US foreløpig patentsøknad 61/623 349 innlevert 12. april 2012. 2. Patent Cooperation Treaty søknad PCT /US2013 /036 234 innlevert 11. april 2013. III. «Metoder og preparater for behandling av kreft» (GU Reference # 2014-012) 1. US foreløpig patentsøknad 61/895 308 innlevert 24. oktober 2013. Alle data i manuskriptet er fritt tilgjengelig. Forfatterne erkjenner og følg alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
kromosom omorganisering er en felles mekanisme kjøring onkogenese i sarkomer og hematologisk kreftsykdom [1]. Nylig, fusjoner som involverer erythroblastosis virus E26 transformere sekvenser (
ETS
) familie av transkripsjonsfaktorer har blitt oppdaget i prostata kreftsvulster [2].
ETS
familie av transkripsjonsfaktorer er et høyt konservert gruppe av gener som består av 27 medlemmer, hvorav mange har vist seg å spille en viktig rolle i sykdomsstart, progresjon, differensiering, migrasjon, invasjon og angiogenese [3] , [4]. ETS proteiner dele signifikant homologi med hverandre og inneholder en C-terminal
ETS
domenet som er involvert i DNA-binding, og en N-terminal PNT domenet er involvert i protein interaksjoner [5]. Kromosom rearrangements involverer ETS faktorer i prostatakreftceller plassere dem under direkte regulering av androgen responsive gener arrangører, og dermed aktivere deres uttrykk som svar på androgener. I motsetning til proteinprodukter av translokasjon i leukemi og sarkomer, trenger genet rearrangements i prostata kreft ikke opprette kimære fusjonsproteiner. I stedet, de fleste translokasjon og gen rearrangements involverer ETS faktorer i prostatakreft resultat i uttrykk for en full lengde eller nesten full lengde ETS familie proteiner.
trans involverer ERG og ETV1 utgjør majoriteten av ETS rearrangements funnet i prostatakreft . Mens ERG hovedsakelig kondensert til TMPRSS2 promoteren, kan ETV1 omgjøres til 5′-regionen av flere gener, slik som TMPRSS2, SLC45A3 og HNRPA2B1 [2], [6].
ETV1
trans resultater i uttrykket av full-lengde eller N-terminal avkortet ETV1 [7]. Over-ekspresjon av ETV1 i benign prostata epitel-cellelinjer som fører til induksjon av en undergruppe av gener involvert i migrering og invasjon [6]. ETV1 øker også ekspresjon av AR målgener, så vel som gener som er involvert i biosyntese steroid og metabolisme. Samarbeid med andre onkogene hendelser, for eksempel PTEN tap, predisponerer ETV1 uttrykker prostata celler til å utvikle seg til en mer aggressiv sykdom fenotype [8], [9]. Studier i musemodeller viser at ETV1 uttrykk er en underliggende årsak til prostatakreft innvielse. ETV1 transgene mus utvikler prostata intraepitelial neoplasi. I tillegg kombinerer ETV1 uttrykk med pre-eksisterende genomiske lesjoner som PTEN tap, resulterer i utvikling av invasiv adenokarsinom [10], [11].
Vi har nylig rapportert at YK-4-279, en inhibitor av EWS-FLI1 oncoprotein i Ewings sarkom, også hemmer ERG og ETV1 aktivitet i prostatakreftceller
in vitro
, noe som resulterer i redusert trekkende og invasive fenotyper [12], [13]. Basert på vår tidligere
in vitro
undersøkelser, vi testet anti-metastatisk evne YK-4-279 i en mus xenograft modell. Dyr behandlet med YK-4-279 hadde redusert tumorvekst og redusert metastasering av svulsten fra primær nettstedet til lungene. Vi viser også at effekten av YK-4-279 på ETV1 og prostata cancercellelinjer er enantiospesifikk og (S) -YK-4-279 enantiomeren er den aktive komponent bekrefter tilsvarende funn i andre tumormodeller [14].
diskusjon
YK-4-279 er et lite molekyl antagonist av ETV1
Vi i første omgang fokusert på å vurdere effekten av YK-4-279 på tumormetastaser
i
Resultater og -vivo
, siden vår
in vitro
eksperimenter med prostatakreft cellelinjer antydet at det først og fremst hemmer motilitet og invasjon [13]. For å teste effekten av YK-4-279
in vivo
, vi utnyttet en mus xenograft modell [15], [16]. LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 prostatakreft cellelinjer er generert av stabil transfeksjon av foreldre LNCaP og PC-3 celler med en vektor som uttrykker luciferase genet. Cellene blir injisert subkutant under den dorsale flanke i 8-10 uker gamle SCID /beige hannmus. Lungemetastase kan sees så tidlig som 6-7 uker etter tumor-implantasjon hos disse dyr [15], [16].
Vi har tidligere demonstrert at hemming av ETV1 biologisk aktivitet i LNCaP celler resulterer i redusert invasjon og migrering uten å påvirke vekst i kultur [13]. Cellelinjene anvendt i denne studien ble anskaffet kommersielt fra en annen kilde enn vårt tidligere arbeid og gjennomgikk selektivt trykk for å oppnå stabile luciferase-uttrykkende kloner. Vi først validert effekten av YK-4-279 på disse cellene før du går videre til
in vivo
modeller. LNCaP-celler inneholder en genetisk trans hvor hele ETV1 locus er satt inn i den siste intron i prostata-spesifikke MIPOL1 region på kromosom 14. Vi bekreftet nærvær av ETV1 translokasjon i LNCaP-Luc-M6 celler av genomisk DNA PCR ved anvendelse av primere som flankerer rekombinasjon området (fig. 1a). ETV1 omorganisering var eksklusivt for LNCaP-luc-M6 celler og ikke til stede i PC-3M-luc-C6 celler. Således ble det PC-3M-luc-C6-cellelinjen valgt som en negativ kontroll for våre studier.
a) Genomisk DNA fra prostata-celler ble analysert for ETS-omleiring status ved å utføre PCR ved anvendelse av spesifikke primere omorganisering. LNCaP-luc-M6 cellene næret ETV1 omorganisering, mens PC-3M-luc-C6 celler var fusion-negative. b) LNCaP-luc-M6 celler ble behandlet med 1 uM YK-4-279 i 48 timer og ETV1 målgenet nivåer ble evaluert ved sanntids-kvantitativ PCR. YK-4-279 behandling resulterte i redusert genekspresjon av MMP7, MMP13, GLYATL2 og FKBP10 uten vesentlig reduksjon i ETV1 nivåer. *; p 0,01, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test. c) LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 ble forbehandlet med en mikrometer YK-4-279 i 48 timer. En elektrisk impedans basert kjemotaksis-analyse ble anvendt for å overvåke cellemigrering, i nærvær av YK-4-279 mot den nedre kammer med 10% FBS gradient. YK-4-279 hemmet migrering av LNCaP-luc-M6, men ikke PC-3M-luc-C6 celler. *; p 0,005, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test. d) Motilities av celler ved slutten av 24-timers perioden ble beregnet basert på deres relative celleindeksverdier. *; p 0,01, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test.
Vi har behandlet LNCaP-luc-M6 celler med en sub dødelig dose (1 mm) av YK-4-279 i 48 timer og evaluert uttrykk for endogen ETV1 målgener av sanntid kvantitativ PCR. Vi fokuserte på kjente ETV1 mål som er implisert i prostata patogenesen [17] – [19]. Eksponering av LNCaP-luc-M6 celler til 1 uM YK-4-279 førte til betydelig reduserte mRNA nivåer av flere ETV1 målgener, inkludert MMP7, MMP13, FKBP10 og GLYATL2, uten å påvirke ekspresjonen av ETV1 (Fig. 1b).
Deretter utførte vi en elektrisk impedans-baserte chemotaxis analysen for å fastslå effekten av YK-4-279 på motilitet av LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 celler. Denne teknikk innebærer bruk av en Boyden kammer-lignende oppsett med mikroelektroniske sensorer integrert under et mikroporøst polyetylentereftalat (PET) membran. Sensorene registrerer elektrisk impedans som celler migrere fra det øvre kammer, gjennom membranen og inn i det nederste kammer i respons til et kjemotiltrekkende. Denne teknikken tillater sanntidsovervåking av cellemigrering som øker i elektrisk impedans korrelerer med økende antall migrerte celler til bunnkammeret. YK-4-279 behandling av LNCaP-luc-M6 celler resulterte i en signifikant reduksjon i cellemigrering, mens ingen effekt ble observert på motiliteten av det negative kontrollcellelinje, PC-3M-luc-C6 (fig. 1c og 1d). Disse funnene bekrefter at kommersielt tilgjengelige LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 celler hadde samme fenotyper og YK-4-279 svarprofiler som LNCaP og PC-3 celler som vi brukte i våre tidligere studier.
YK-4-279 hemmer tumorvekst
in-vivo
YK-4-279 behandlingsforsøk ble gjort i to forskjellige formater: 1) Tidlig behandling eksperimenter, hvor YK-4 -279 administrasjonen ble startet dagen etter xenograft implantasjon. 2) Sen behandling eksperimenter, hvor YK-4-279 administrasjon startet først etter primær xenograft tumor nådd en håndgripelig størrelse (rundt 200 mm
3). Disse to tilnærmingene tillatt oss å evaluere effektene av YK-4-279 på tumor opp ta, vekst og lungemetastaser både før dannelsen av veletablerte svulster samt etter følbar svulstdannelse.
Vi etablerte prostata xenografter av subkutant injisert LNCaP-luc-M6 eller PC-3M-luc-C6 celler i rygg flanken av SCID /beige mus. På begynnelsen av behandlingsstudie, begynte vi intraperitoneal behandling med 75 mg /kg YK-4-279 eller kjøretøy kontroll dagen etter tumorcelle injeksjon. Dyrene ble behandlet 3 ganger per uke og tumorvolum målt ukentlig. Studien ble avsluttet etter 14 uker for LNCaP-luc-M6 gruppe og 6 uker for PC-3M-luc-C6 gruppe på grunn av den relativt raskere vekst på PC-3M-luc-C6 celler. Selv om bare fire av de 13 mus som ble injisert subkutant med LNCaP-luc-M6 celler og behandlet med YK-4-279 utviklede tumorer, i sterk kontrast, 9 av de 13 dyrene i den kjøretøy kontrollgruppen utviklet tumorer. Ingen slik forskjell var tilstede i fusjons-negative PC-3M-luc-C6 kohort (fig. 2). Hos dyr som utviklet svulster, var det en betydelig reduksjon i tumorstørrelse i YK-4-279 behandlede gruppen i forhold til DMSO kontroll. Reduksjon i tumorstørrelse var bare til stede i LNCaP-luc-M6 gruppe og ikke observert med PC-3M-luc-C6 xenografter (Fig. 3a). Vår tidligere
in-vitro
undersøkelser avslørte at ETV1 hemming av YK-4-279 fører til redusert bevegelighet og invasjon uten å påvirke cellevekst og overlevelse. Derfor vi ikke forvente å se en forskjell i tumoropptak eller primær tumor vekst i disse dyrene. Den tidlige behandling eksperiment ble utformet for å måle lungemetastase, og alle dyr ble avlivet ved den forutbestemte endepunktet (6 uker for PC-3M-luc-C6 og 14 uker for LNCaP-luc-M6) for å høste vev for videre analyse.
Prostata xenotransplantater ble etablert av subkutant injisere cellene nedenfor ryggkanten i 8-10 uker gamle SCID /beige hannmus. Dyr ble behandlet med 75 mg /kg kroppsvekt YK-4-279 tre ganger ukentlig, med start dagen etter xenograft injeksjoner. LNCaP-luc-M6 dyr behandlet med forbindelse vises redusert svulstdannelse (4/13) i forhold til kjøretøykontroll (9/13). PC-3M-luc-C6 dyr som ikke viser signifikant forskjell i tumordannelse mellom forbindelse behandles (12/13) og bærerkontrollen (13/13) dyr. *; p 0,05, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test.
a) SCID /beige mus ble subkutant injisert med LNCaP-luc-M6 eller PC-3M-luc-C6 celler under rygg flanke. I tidlig behandling studiegruppen ble dyrene injisert med 75 mg /kg YK-4-279 starte dagen etter xenograft injeksjon. b) Et annet sett av dyr begynte å motta YK-4-279 behandling når svulstene var følbar (rundt 200 mm
3). Disse dyrene ble videre delt inn i 2 separate kohorter: en gruppe ble behandlet tre ganger i uken med 75 mg /kg YK-4-279 (slutten av behandlingsstudie lav dose). c) En annen gruppe ble behandlet 5 ganger i uken med 150 mg /kg forbindelse (sen behandlingsstudie høy dose). Tumor volum ble målt ukentlig. YK-4-279 redusert tumorvekst i LNCaP-luc-M6 dyr, men ikke i PC-3M-luc-C6 dyr. *; p 0,01, **; p 0,001, ***; p 0,0001, n.s .; ikke-signifikant.
Den avdøde behandlingsstudier startet med xenograft implantasjon og tett oppfølging. Når dyrene viste en følbar tumor (rundt 200 mm
3), ble de randomisert til YK-4-279 og kjøretøy kontroll (DMSO) grupper. Sluttpunktet for sent behandling studien ble valgt som primærtumorstørrelsen nådde 2 cm
3 i alle grupper, slik som metastatisk belastning mellom gruppene kan bli evaluert med lik primærtumorstørrelse i alle grupper. Videre ble sent behandlingsstudie gjentatt to ganger med to forskjellige YK-4-279 doser; 75 mg /kg YK-4-279 tre ganger i uken og 150 mg /kg YK-4-279 fem ganger i uken.
Primær tumorvekst ble betydelig redusert i slutten av behandlingsstudie i tillegg (Fig. 3b ). Denne forskjellen ble forbedret når medikamentdosen og frekvensen ble øket (fig. 3c). I gruppen med høy dose, men dyrene begynte å vise tegn på hyperventilering og apati, spørre en dosereduksjon til 150 mg /kg gitt 4 dager i uke etter uke 4 og 3 dager i uke etter uke 8. Medikamentell behandling ikke påvirke veksten frekvensen av fusion-negative PC-3M-luc-C6 xenografter på enten dose.
En gruppe av primærtumorprøver ble også evaluert for histopatologiske parametre (fig. S1). Områder i tumor nekrose ble identifisert i H E beiset lysbilder. Mengde celleproliferasjon ble bestemt av Ki67 immunhistokjemi og mengden av apoptose ble bestemt av TUNNEL farging. LnCap tumorer generelt viste en økning i nekrose i respons til YK-4-279 behandling i høydosegruppen (150 mg /kg). På samme måte ble det observert en reduksjon i Ki67 farging i LNCaP tumorer i behandlingsgruppen. Imidlertid er disse forskjellene i LNCaP tumorene var ikke statistisk signifikant (figur S2). Det var ingen merkbar forskjell i PC3 svulster for enten analysen.
YK-4-279 hemmer lungemetastaser i LNCaP-luc-M6 xenograft dyr
Vi har utviklet en total celle-lysat basert analyse som tok fordel av luciferase protein uttrykk å nøyaktig kvantifisere metastasering av prostata kreft celler til lungene. Analysen involverer ekstraksjon av protein lysatet fra lungene, etterfulgt av luciferase-målinger. Metastasering av LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 celler til lungene resultatene kan påvises i H E farget lunge seksjoner når de er store nok (figur 4a.). Imidlertid er denne metode ikke er kvantitativ og kan gå glipp av mikrometastaser, spesielt i innlagt partier av organet igjen i parafin blokken. Det er viktig å ha et assay følsom nok til å påvise nærvær av selv små antall av prostata tumorceller i lungene. Vi har konstruert en standardkurve ved å kombinere seriefortynninger av luciferase som uttrykker prostatakreftceller dyrket i kultur med lungevev fra friske mus (fig. 4b). Ved hjelp av denne analysen, var vi i stand til å oppdage så lite som en celle per milligram lungevevet. Vurderer en gjennomsnittlig lunge masse på 140 mg, har denne analysen en nedre deteksjonsgrense på 140 prostatakreftceller pr lunge [20]. Siden luciferase uttrykk er den primære metoden som brukes for å kvantifisere tumormetastase, utførte vi en
in vitro
luciferase-analyse, ved hjelp av doser av YK-4-279 som undertrykker invasjon, for å demonstrere at forbindelsen behandling dose ikke påvirke ekspresjon av luciferase i LNCaP-luc-C6 eller PC-3M-luc-C6 celler. Vi målte også luciferaseekspresjon i primære svulster hentet fra dyr behandlet med høyeste dose av YK-4-279 eller kjøretøy kontroll. Forbindelse behandling påvirket ikke luciferaseekspresjon enten
in vitro
eller
in vivo plakater (fig S3.)
a) H . E farget lunge seksjoner som viser en mikro -metastatic lesjon i DMSO behandlet LNCaP-luc-M6 dyr. b) En standardkurve ble konstruert for å måle påvisningsgrensen for luciferase-assay. Analysen er ekstremt følsom, slik at deteksjon av en enkelt prostatakreft celle pr milligram lungevevet. c) Lungene ble høstet fra xenograft dyr 15 minutter etter den siste forbindelsen eller bærer behandling. Protein lysater ble oppnådd fra vev og brukt til å utføre en luciferase-assay. Resultatene ble normalisert til vev vekt. Sammensatte behandlet LNCaP-luc-M6 xenograft dyr vises betydelig redusert lungemetastaser i forhold til kjøretøykontroller. PC-3M-luc-C6 lungemetastase var upåvirket av behandling med forbindelsen. *; p 0,05, **; p 0,005, ***; p 0,0001, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test.
Vi gjorde samme luciferase assay på lungene av xenograft frakte dyr behandlet med YK-4-279 eller kjøretøy kontroll. I alle 3 forsøkene (tidlig behandlingsstudien sent behandlingsstudie lav dose, sent behandlingsstudie høy dose), forbindelse behandling resulterte i en betydelig reduksjon i lungemetastaser i LNCaP-Luc-M6 xenograft dyr, men ikke på PC-3M-luc- C6 dyr (fig. 4c). Vi brukte også en PCR baserte analysen å kvantifisere lungemetastaser i slutten av behandlingsstudien høy dose kohorten ved hjelp av humane spesifikke primere for ribonuklease P RNA komponent H1 (RPPH1) og muse spesifikke primere som gjenkjenner transferrin reseptor genet (Tfrc). Denne analysen bekreftet våre tidligere observasjoner avslører betydelig redusert lungemetastaser i YK-4-279 behandlet LNCaP-luc-M6 gruppen (Fig. S4) og validert at luciferase måling i lungevev var en pålitelig metode. I to forsøk (tidlig behandling studie og sen behandling studie høy dose), ble lungene høstet fra LNCaP-luc-M6 xenograft dyr som vises reduserte primære tumor størrelser i behandlingsgruppen på tidspunktet for vev anskaffelse (Fig. 3a og Fig. 3c ). Derfor er det mulig at forskjellene i lungemetastase kan være et direkte resultat av mindre tumorvolumer i behandlingsgrupper. Men på slutten av behandlingsstudie lav dose gruppe hadde lignende primær tumorvolum (2 cm
3) når vev ble høstet fra dyr (Fig. 3b). YK-4-279 redusert lungemetastaser i disse dyrene også, noe som tyder på at medikamentell behandling påvirker metastase ved å hemme ETV1 aktivitet, uavhengig av primærtumor størrelse.
Vi vurderte også ETV1 mål genuttrykk i primære svulster på YK-4-279 behandling. ETV1 hemming av YK-4-279 resulterte i redusert MMP-7, FKBP10 og GLYATL2 uttrykk, uten at det påvirker ETV1 uttrykket nivåer (Fig. 5a og Fig. 5b). For å bestemme hvorvidt forskjellene i legemiddelrespons mellom LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 dyr er en faktor av differensial tumor gjennomtrengning av forbindelsen mellom de to kullene, målte vi konsentrasjonen av YK-4-279 i plasmaet og svulster av dyr etter siste dose av YK-4-279. LNCaP-luc-M6 mus viste en gjennomsnittlig konsentrasjon på 106,9 ± 64,1 pg /ml YK-4-279 i plasma og 27,8 ± 14,5 ug /g i tumoren for en tumor: plasma-forhold på 0,30 ± 0,20. PC-3M-luc-C6 dyr demonstrert 174,8 ± 53,5 pg /ml YK-4-279 i plasma og 23,3 ± 12,3 ug /g i tumoren for en tumor: plasma-forhold på 0,15 ± 0,10. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i inntrengning av YK-4-279 mellom de to gruppene sammenlignet med en chi-kvadrat-test.
a) RNA ble ekstrahert fra svulster i forbindelse og vehikkel behandlet LNCaP-luc- M6 dyr (sent behandlingsstudie lav dose) 15 minutter etter siste injeksjon. Genuttrykk nivåer ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR. Resultatene ble normalisert til 18s rRNA uttrykk. Forsøk ble utført i tre paralleller med 5 mus per gruppe ble analysert. YK-4-279 behandling resulterte i redusert genekspresjon av MMP7, GLYATL2 og FKBP10 uten vesentlig reduksjon i ETV1 nivåer. *; p 0,05, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test. b) ETV1 målet genuttrykk nivåer i slutten av behandlingsstudie høy dose. *; p 0,05, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test.
enantiospesifikk effekter av YK-4-279
YK-4-279 har et kiralt senter og racemisk forbindelse kan deles inn i dets bestanddeler R- og S-enantiomerer ved høytrykks væskekromatografi (HPLC), eller hver enantiomer kan syntetiseres individuelt. I Ewings sarkom modeller, har S-enantiomeren blitt etablert som den aktive bestanddel som hemmer EWS-FLI1, mens R-enantiomeren har de praktisk talt ingen spesifikk aktivitet [14], [21]. Vi testet hvorvidt det samme fenomen gjelder for inhibering av ETV1 i prostatakreftceller. Overflate-plasmonresonans (SPR) eksperimenter ble utført for å bestemme bindingen av racemisk YK-4-279, og hver enkelt enantiomer til ETV1. Forbindelsene ble injisert over en Biacore chip overflate som inneholder rekombinant ETV1. Racemisk YK-4-279 og S-enantiomeren bundet til ETV1, mens R-enantiomeren viste en svakere binding til ETV1 (fig. 6a). Vi evaluerte deretter YK-4-279 for sin effekt på ETV1 transkripsjonen aktivitet ved hjelp av en transient transfektert luciferase reporter-konstruksjonen, som inneholder en minimal ID2 promoter region med to bindingssteder for ETV1. Co-transfeksjon av ETV1 og ID2 reporter i COS-7-celler resulterte i en økning i luciferaseaktivitet. Promoter-aktivitet ble redusert ved behandling av cellene med racemisk YK-4-279 og (S) -YK-4-279. Men (R) -YK-4-279 hemmet ikke ETV1 transkripsjonen aktivitet (Fig. 6b).
a) Racemisk YK-4-279, (R) -YK-4-279 og (S ) -YK-4-279 ble injisert over en Biacore chip overflate som inneholder rekombinant ETV1. Racemisk YK-4-279 og S-enantiomeren bundet til ETV1, mens R-enantiomeren hadde en lavere bindingsaffinitet til ETV1. b) En luciferase-assay ble utført i COS-7-celler ko-transfektert med ETV1 og en Id-2-reporter-konstruksjonen luciferase. Id-2 promoter-aktivitet ble redusert ved behandling med racemisk YK-4-279 og (S) -YK-4-279. *; p 0,0005, n.s .; ikke-signifikant, uparet t-test.
kirale diskriminering mellom enantiomerer er en viktig funksjon i mange stoff som molekyler, som enkelt aktive enantiomerer kan gi større selektivitet for sine biologiske mål, bedre terapeutisk indeks, og vise bedre farmakokinetikk enn den racemiske blanding [22]. Den kan også redusere den totale legemiddeldose og redusere interaksjoner og toksiske bivirkninger. Når du sender inn et nytt legemiddel for godkjenning, US Food and Drug Administration (FDA) krever utviklere å rettferdiggjøre valget mellom å bruke en racemisk blandingen over single-enantiomeren formuleringer.
I vår
in vivo
eksperimenter, LNCaP-luc-M6 tumorvekstinhibitering var høyere ved 150 mg /kg YK-4-279 sammenlignet med 75 mg /kg. Imidlertid dyr som fikk en høyere dose medikament kunne ikke bli behandlet i mer enn 10-12 uker på grunn av manifestasjonen av nekrotiske tumorer, som kreves for dyr som skal avlives. Derfor, i tillegg til metastase hemming, YK-4-279 kan ha en direkte effekt på spredning i ETS-positive prostatakreftceller. Den eneste ulempen med behandling av dyr med høyere doser av YK-4-279 var forekomsten av narkotika toksisitet symptomer som startet på 4 uker. I denne studien klarte vi symptomene ved å redusere behandlingsfrekvens, og dermed gi dyrene mer utvinning tid mellom injeksjonene. Men for å flytte denne forbindelsen inn i klinikken, er ytterligere etterforskning nødvendig for å forbedre
in vivo
effekt og ser på symptomene som oppstår ved høyere doser. Vi er for tiden utforsker ulike doseringsregimer og formuleringer for å finne den ideelle behandling scenario som maksimerer on-target effekter mens minimere off-target narkotika toksisitet. På grunn av sin hydrofobe struktur, biotilgjengeligheten av YK-4-279 er bare 2% -15% når det blir administrert til mus ved oral gavage [14]. I tillegg har de senere farmakokinetiske eksperimenter i laboratoriet vist at intra-peritoneal administrasjoner på 75 mg /kg YK-4-279 utgangspunktet fører til en kraftig økning i plasmakonsentrasjonen, men er vesentlig ryddet fører til ~ 1 mikrometer nivå med 2 timer [ ,,,0],14]. De farmakokinetiske egenskapene til YK-4-279, sammen med manglende evne til å levere et bærekraftig høy dose over tid gjennom bolusinjeksjonene antyder behovet for å utvikle en kontinuerlig infusjon modell for å sikre tilstrekkelig levering av legemidler. Vi har testet dette paradigmet i en Ewings sarkom xenograft modell i naken rotter. Disse dyrene får kontinuerlig stoffet infusjon via et sentralt venekateter og vise bedre respons på YK-4-279 behandling enn daglige intra-peritoneal eller intra-venøs injeksjoner [21]. Videre kombinerer farmakokinetiske målinger,
in vivo
modellering og laboratoriestudier vil tillate oss å skape en optimal levering av legemidler formulering som er egnet for klinisk bruk. I tillegg vellykket validering av (S) -YK-4-279 som den aktive komponenten i YK-4-279 kan tillate drastisk redusert behandlingsdose
in-vivo.
En økende mengde av bevis tyder på at ETS fusjoner fungere samtidig med andre genomisk endringer i initiering og vedlikehold av prostata maligniteter. Androgen-induserbar prostata-spesifikt overekspresjon av ETV1 i transgene mus forårsaker prostata intraepitelial neoplasi (PIN), men fører ikke til kreft formasjon. Kryssing disse transgene mus til en PTEN
+/- bakgrunn eller konstitutivt aktiv prostataspesifikt PI3K /Akt sti induserer invasivt karsinom innen 6 måneder, noe som tyder på at ETS trans samarbeide med andre genetiske skader å indusere prostata kreft hos mennesker [10 ], [11]. Nyere funn har også identifisert Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP), en nøkkel DNA-reparasjon protein, for å samhandle med ETS faktorer i et DNA uavhengig måte [23]. PARP1 er vist å være viktig for ETS protein funksjon, og hemming av PARP1 svekker ETS mediert tumorigenesis og celle invasjon. PARP og PI3K /Akt pathway hemmere som olaparib, rucaparib, perifosine, og miltefosine er på et avansert tilstand av klinisk testing [24] – [26]. En viktig klinisk nytte av disse funnene er mulighet for å kombinere YK-4-279 med andre rusmidler for å oppnå en mer robust og synergistisk reaksjon, åpne et bredt spekter av nye strategier for å målrette ETS faktorer.
Transkripsjonsfaktorer har
