Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og c-MET reseptorer uttrykkes på mange ikke- småcellet lungekreft (NSCLC) celler. Nåværende monoterapi terapeutisk målretting av en mutant EGFR har en høy effektivitet i klinikken, men er ikke helbredende. Her undersøkte vi kombinasjonen av målretting EGFR og c-MET baner i NSCLC-celler som er resistente mot reseptor-tyrosin-kinase-inhibitorer (TKI), ved hjelp av RNA-interferens og hemming av TKI. Ulike NSCLC cellelinjer med ulike genomiske egenskaper (H358, H1650 og H1975) ble transfektert med EGFR-spesifikk-siRNA, T790M spesifikke-siRNA, c-MET siRNA eller kombinasjonen. Deretter EGFR TKI (gefitinib, erlotinib eller afatinib) eller monoklonalt antistoff cetuximab ble kombinert med henholdsvis med c-MET-spesifikke TKI su11274 hos NSCLC cellelinjer. Den celleproliferasjon, levedyktighet, caspase-3/7-aktivitet og apoptotisk morfologi ble overvåket ved hjelp av spektrofotometri, fluorimetri og fluorescens mikroskopi. Den kombinerte effekten av EGFR TKI eller cetuximab og su11274, ble evaluert ved hjelp av en kombinasjon indeks. Resultatene viste at de cellelinjene som var forholdsvis motstandsdyktig mot EGFR TKI, spesielt H1975 cellelinjen som inneholder motstanden T790M-mutasjonen, ble funnet å være mer følsomme for EGFR-spesifikk-siRNA. Kombinasjonen av EGFR siRNA pluss c-MET siRNA forbedret hemming av cellevekst, apoptose-induksjon og hemming av nedstrøms signalisering i EGFR-TKI motstandsdyktig H358, H1650 og H1975 celler, til tross for fravær av aktivitet av c-MET siRNA alene. EGFR TKI eller cetuximab pluss su11274 var også konsekvent overlegen til begge substansene alene. Den sterkeste biologiske effekten ble observert når afatinib, ble en irreversibel pan-HER blocker kombinert med su11274, som oppnådde en synergistisk effekt i T790M mutante H1975 celler. I en konklusjon, våre funn tilby preklinisk bevis på prinsippet for kombinert hemming som en lovende behandlingsstrategi for NSCLC, spesielt for pasienter hvor dagens EGFR-målrettede behandlinger mislykkes på grunn av tilstedeværelsen av T790M-EGFR-mutasjon eller høy c-MET uttrykk .
Citation: Chen G, Noor A, Kronenberger P, Teugels E, Umelo IA, De Grève J (2013) synergistisk effekt av Afatinib med Su11274 i ikke-småcellet lungekreft celler Resistent mot Gefitinib eller Erlotinib. PLoS ONE 8 (3): e59708. doi: 10,1371 /journal.pone.0059708
Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Universitetet i Porto, Portugal
mottatt: 07.12.2012; Godkjent: 17 februar 2013; Publisert: 18 mars 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet ble finansiert av Nasjonal kreftplan Belgia (Grant NKP-29-011), Stichting Tegen Kanker, Belgia. Denne studien ble delvis støttet av Forskningsfondet av Boehringer Ingelheim GmbH. Gang Chen ble støttet av den kinesiske Scholarship Council (CSC). Gang Chen og Ijeoma Adaku Umelo ble støttet av Vrije Universiteit Brussel (VUB) PhD stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Denne studien ble delvis støttet av forskningsfondet for Boehringer Ingelheim GmbH. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne
Innledning
I noen ikke -. Småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter, epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR, også kjent som ErbB1 eller HER1), inneholder «sensibiliserende» mutasjoner som øker effekten av EGFR-spesifikk tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) [1], [2]. To hoved anti-EGFR-strategier er for tiden i klinisk anvendelse: lav molekylvekt TKI som konkurrerer med ATP for binding til tyrosin-kinase parti av en mutant EGFR-reseptor, og monoklonale antistoffer (mAbs) som er rettet mot den ligandbindende ekstracellulære domenet, for derved å forhindre ligandbindende, og følgelig reseptor-dimerisering, og reseptorsignalisering. Disse to klasser av midler har vist solid preklinisk og klinisk aktivitet i en rekke krefttyper [3].
Blant reseptoren TKI, erlotinib (Tarceva, Genentech, Inc, South San Francisco, CA, og OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY) forbedrer overlevelse i avansert NSCLC progrediert etter ett eller to tidligere kjemoterapiregimer [4], [5], [6], [7]. Både gefitinib og erlotinib er overlegen kjemoterapi i førstelinjebehandling av lunge adenokarsinom hvor EGFR reseptor havner de sensibiliserende mutasjoner i ekson 19/21 [8], [9], [10]. Den samlede klinisk erfaring i dag viser at bare pasienter med tumorer inneholder et allergi mutasjon, utlede en meningsfull klinisk nytte av EGFR TKI. Faktisk, randomiserte studier viser at hos pasienter som ikke er valgt for slike mutasjoner, kan disse stoffene har en ugunstig virkning på utfallet [10], [11].
Effekten av inhibitorene er begrenset i tid på grunn av utseendet av celler med resistensmekanismer, i nesten halvparten av tilfellene en substitusjon i EGFR treonin-til-methionin i aminosyrestilling 790 (T790M). Afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), er en irreversibel hemmer av både EGFR, HER2 og HER4 kinaser og beholder noen aktivitet i svulster med T790M mutasjoner, men ved doser som er en logg høyere enn det som er nødvendig for kreft som bærer sensibiliserende mutasjoner [ ,,,0],12], [13], [14], [15], [16], [17].
Det kimære IgG1 monoklonalt EGFR antistoff cetuximab (Erbitux, Imclone Systems Incorporated, New York, NY, og Bristol -Myers Squibb Company, Princeton, NJ) blokkerer den ligand-reseptor-interaksjon og derved nedregulerer EGFR-signalering, hvilket resulterer i hemning av celleproliferasjon og angiogenese, og induksjon av apoptose [3]. Cetuximab i kombinasjon med kjemoterapi, har blitt godkjent av FDA og EMEA for behandling av metastatisk kolorektalcancer (CRC) og i kombinasjon med strålebehandling for behandling av lokalt fremskreden hode- og nakkekreft (HNC) [18], [19]. Cetuximab har vist en beskjeden aktivitet som monoterapi og i kombinasjon med docetaxel hos pasienter med avansert, kjemoterapi-ildfast NSCLC [20]. En flernasjonal, multisenter, åpen, har fase III studie vist at tillegg av cetuximab til platina-basert kjemoterapi bedret resultatet for pasienter med avansert NSCLC [21]. Den samlede fordel, men er begrenset, slik at det ikke er enighet om relevans for klinisk anvendelse.
RNA interferens (RNAi), av short interfering RNA (siRNAs) eller korte hårnål RNA (shRNAs), har gitt et kraftig verktøy for å modulere genekspresjon for studier av genfunksjon. RNAi er for tiden under vurdering også som et terapeutisk verktøy, i laboratoriet og klinikken [22], [23], [24]. Flere rapporter beskrevne virkninger av EGFR-målrettet RNAi for å hemme cellevekst, [25], [26], [27], [28], [29], men forsøk på å slå ned T790M-holdige allel (ved hjelp av lentiviral shRNA-konstruksjonene) var mislykket [26].
Ervervet resistens mot TKI kan også utvikle seg gjennom en «kinase switch», med c-MET forsterkning og over-uttrykk [30], [31]. Amplifikasjon av c-MET, et transmembran tyrosin-kinase-reseptor, kan allerede skje før behandlingen med TKI i NSCLC [32], [33], [34], [35], og c-MET er uttrykt i 60% av NSCLC-tumorer som målt ved immunohistokjemi [34]. Høye nivåer av hepatocytt-vekstfaktor (HGF), den c-MET ligand, produsert av stromale celler [36], er også blitt korrelert med dårlig prognose av NSCLC [37]. c-MET forsterkning og oppregulering ble identifisert hos noen pasienter med ervervet resistens mot gefitinib /erlotinib [30], [31]. I tillegg kan c-MET bli aktivert ved mutasjoner, så vel [38]. derfor c-MET hemming kan bli en verdifull behandlingsstrategi for disse pasientene.
I denne studien har vi først undersøkt den kombinerte effekten av EGFR-spesifikke sirnas med c-MET siRNA på ulike NSCLC cellelinjer med distinkte genomisk kjennetegn. Vi undersøkte også kombinasjonen av EGFR TKI (gefitinib, erlotinib eller afatinib) eller monoklonalt EGFR antistoffet cetuximab, med c-MET inhibitor su11274 i samme sett av lungekreftcellelinjer.
Metoder
sirnas
Tidligere åtte sirnas rettet mot villtype EGFR og T790M sekvenser (NCBI Reference Sequence: NM_005228.3) ble utformet ved hjelp av algoritmer fra Invitrogen, Eurogentec, Dharmacon, Maurice HO Rational siRNA design (http: //ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html), Reynolds [39], Ui-Tei [40] og Jagla [41]. Kapasiteten på disse siRNAs kandidater til å slå ned EGFR eller T790M-mutant EGFR på mRNA-nivå, og deres evne til å undertrykke celleproliferasjon ble testet [42]. De mest effektive sirnas ble valgt for forsøkene i denne studien (tabell 1). c-MET sirnas (NCBI Reference Sequence: NM_001127500.1) ble kjøpt som en «på målet smartpool» (Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, England) og siRNA sekvenser ble oppsummert i Tabell 1. Egge sirnas ble generert av www.sirnawizard. com og verifisert av en BLAST søk (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Den glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) positiv kontroll siRNA fra Invitrogen (ref. SKU # 12935-140 Skjult RNAi GAPDH positiv kontroll, Merelbeke, Belgia) ble anvendt som en primær test for siRNA transfeksjonseffektiviteten. En TOX transfeksjon Kontroll og Siglo Grønne transfeksjon indikatorer ble utført som positive kontroller for transfeksjon effektivitet (ref D-001630-01-02;. D-001500-01-05, Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, England). Den negative kontrollen siRNA var en proprietær sekvens som ikke korresponderer med noen eukaryote gen (OR-0030-neg 05, Eurogentec S.A., Liège, Belgia). SiRNA duplekser ble transient transfektert ved å bruke lipofektamin
TM 2000 (Cat. No. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Belgia) i RPMI-1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum uten antibiotika, som tidligere beskrevet [43], [44 ], [45]. Hvert forsøk ble gjennomført minst tre ganger og tre ganger uavhengig av hverandre.
Cellelinjer og reagenser
Den menneskelige NSCLC cellelinjer H292 (CRL-1848 ™, mucoepidermoid lunge karsinom), H358 (CRL-5807 ™, bronkioalveolær karsinom), HCC827 (CRL-2868 ™, adenokarsinom), H1650 (CRL-5883 ™, adenokarcinom; bronkioalveolær karsinom), og H1975 (CRL-5908 ™, adenokarsinom) ble oppnådd fra the American Type Culture Collection (ATCC, Nederland). Den cellelinje H292 ble rapportert som en EGFR og K-Ras villtype-cellelinjen [46], [47], [48], [49], som vi bekreftet ved hjelp av sanntids-RT-qPCR og sekvensanalyse (data ikke vist ). H358 er EGFR villtypen, har en kodon 12 K-Ras mutasjon [50], og en homozygot delesjon av p53 [51]. H1650 og HCC827 har en i-ramme slettingsmutasjon i EGFR-tyrosinkinase-domene (E746-A750 sletting, ekson 19). H1650 cellene har også en COOH-terminal delesjon av PTEN og tap av PTEN protein [52] og uttrykker insulin-lignende vekstfaktor-reseptor (IGF1R) [53]. Den cellelinje H1975 har en sensibiliserende L858R kinase domene mutasjon i exon 21, og en andre T790M i exon 20,
i cis
, i EGFR kinase domene, hvilket gjør dem motstandsdyktige mot den reversible TKI gefitinib og erlotinib [54 ]. Videre er alle disse fem cellelinjer som uttrykker c-MET-reseptoren uten genamplifikasjon [28], [30], [53], [55], [56]. Alle fem cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen Corp., Gent, Belgia) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Perbio Science NV, Erembodegem, Belgia), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Ti mM bestander av EGFR-spesifikke TKI gefitinib (Astrazeneca, Cheshire, Storbritannia), erlotinib (Astrazeneca, Cheshire, Storbritannia), den irreversible pan-HER inhibitor afatinib (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Tyskland) og en c-MET inhibitor , su11274 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgia) ble fremstilt i dimetyl sulfoksid (DMSO) og lagret ved -80 ° C. Disse stoffene ble fortynnet i frisk RPMI 1640 med en sluttkonsentrasjon av DMSO mindre enn 0,1% i alle forsøk. EGFR-spesifikt monoklonalt antistoff cetuximab (2 mg /ml) ble kjøpt fra Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland.
RT-qPCR
RNA isolering, RNA normalisering, revers transkripsjon og qPCR var som tidligere beskrevet [43], [44], [45].
Western blot-analyse
Etter å ha blitt behandlet med sirnas eller ulike midler for de angitte perioder, ble cellene vasket med PBS og lysert i en buffer inneholdende Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCl 150 mM (pH 6,85), EDTA 1 mM (pH 8), Triton-X 1% Na-pyrofosfat 2,5 mM natrium ortovanadat (Na3VO4) 1 mM, leupeptin 1 mikrogram /ml, proteasehemmere cocktails 1% og fosfotasesubstrat hemmer cocktails 1% (Sigma-Aldrich NV /SA, Bornem, Belgia). Lysatene ble sentrifugert ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og kokt i 5 minutter. Proteinkonsentrasjonen av løsningen ble gjenkjent av Bio-Rad Bradford proteinanalyse (Nazareth Eke, Belgia) og 25 ug av denaturert protein ble underkastet SDS-PAGE (10% SDS-akrylamid gel) med en lastebuffer inneholdende 80 mM Tris -HCI (pH 6,8), 5% SDS, 10% glycerol, 5 mM EDTA (pH 8), 5% 2-merkaptoetanol, 0,2% bromfenolblått og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid. De separerte proteiner ble overført til PVDF-membraner (BioRad) i 2 timer ved 100 mA. Membranen ble inkubert med følgende primære antistoffer som indikert: EGFR (cellesignalisering), fosfor-EGFR (Tyr1173, klone 9H2, Upstate), c-MET (L41G3, Cell Signaling), fosfor-c-MET (Tyr1234 /1235, 3D7, Cell Signaling), fosfor-AKT /PKB (pS473, Invitrogen), fosfor-ERK1 /2 (pTpY185 /187, Invitrogen), fosfor-STAT3 (Tyr705, 3E2, Cell Signaling), fosfor-STAT5 (pY694, BD Biosciences ) og β-aktin (Sigma-Aldrich NV). En peroksydase-konjugert sekundært antistoff (1:4000 fortynning, ECL anti-mus eller anti-kanin-IgG-HRP bundet, Na 931, GE Healthcare Bio-fag /Amersham, Zaventem, Belgia) ble tilsatt, og membranene ble utsatt for kjemiluminescens deteksjon (ECL Plus Western Blotting Detection reagenser, GE Healthcare Bio-vitenskap /Amersham, Diegem, Belgia).
Proliferation
Cellevekst vekst~~POS=HEADCOMP ble vurdert ved hjelp av en kolo tetrazolium-analysen (substrat MTS, CellTiter96 vandige løsning Cell Proliferation Assay G3580, Promega, Madison, USA). Protokollen var som følger: forskjellige midler og kombinasjoner ble tilsatt til 96-brønners plater med økende konsentrasjoner og inkubert ved 37 ° C i opptil 96 timer (kombinasjon eksperimenter opp til 72 timer). Etter tilsetning av 20 ul av MTS-reagens til hver brønn, platene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator, og absorbansen ved 490 nm ble målt ved anvendelse av en 96-brønners mikroplateavleser (Scientific Multiskan MK3, Thermo Finland). Resultatene var gjennomsnittet av seks brønner og uttrykt som forholdet mellom absorbans dividert med absorbansen av mock-kontroll x 100.
Levedyktighet
Cellenes levedyktighet ble analysert ved fluorimetrisk påvisning av resorufin (CellTiter -Blue celleviabilitet analysen, G8080, Promega, Madison, USA). Fremgangsmåten var i henhold til produsenten. Behandlinger og kontroller var som nevnte. Fluorimetri (ex: 560 nm /em: 590 nm) ble ved hjelp av en FL600 fluorescens plateleser (Bio-Tek, USA). Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og hver gang ble anvendt seks individuelle brønner. Fluorescens data er uttrykt som fluorescens av behandlede prøver delt på fluorescens fra den mock-kontroll x 100.
Caspase-3/7-aktivitet detektering
Caspase-3/7-aktivitet ble målt ved anvendelse av en syntetisk rhodamin merket caspase-3/7 substrat (Apo-ONE® Homogen caspase-3/7 Assay, G7790, Promega, Madison, USA) umiddelbart etter fluorimetrisk påvisning av cellelevedyktighet på de samme brønnene, i henhold til produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon ved romtemperatur i 60 min, ble fluorescensen til hver brønn målt (ex: 499 nm /em: 512 nm), ved hjelp av en FL600 fluorescens plateleser (Bio-Tek, USA). Caspase-3/7-aktivitet er uttrykt som fluorescens av behandlede prøve /mock-kontroll x 100.
Fluorescent mikros evaluering av celle apoptose og morfologi
Virkningene av forskjellige behandlinger på apoptose og kjernemorfologi i cellene ble vurdert av Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgia) og propidiumjodid (PI, Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgia) dobbel fluorescerende kromatin farging. I korte trekk, etter enkel eller dobbel behandling av sirnas eller agenter, ble cellene vasket med iskald PBS og farget 15 min med Hoechst (1 mg /ml) og propidiumjodid (PI, mg /ml), og observert under en avansert fluorescens mikroskop (ZEISS Axiovert 25, Zaventem, Belgia). Apoptose og kjernemorfologi ble identifisert ved kondensering av kjernefysiske kromatin og dens fragmentering. Dette systemet bestemmer den absolutte antallet levedyktige celler (Hoechst positiv /PI negativ), tidlige apoptotiske celler (Hoechst positiv /PI negativ med blå fragmentations i cellene), sent apoptotiske celler (Hoechst positiv /PI positiv, med røde fragmentations i cellene ), nekrotiske celler (Hoechst negativ /PI positive) og rusk signaler. Levedyktige og apoptotiske celler ble talt i 10 forskjellige felt under 200 × forstørrelse, og i hver brønn fra tre uavhengige forsøk. Telle var av to personer og gjennomsnittlig resultat ble uttrykt relativt til mock-kontroll. Apoptotiske celle tall fra forskjellige behandlinger ble sammenlignet ved å bli normalisert til deres levedyktige celler.
Statistisk analyse
SPSS19.0 ble brukt for statistisk analyse. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter med mindre annet er angitt. Verdier ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Én-veis analyse av varians (ANOVA) test ble brukt til å analysere betydning mellom gruppene. De minst signifikant forskjell (LSD) metode for multiple sammenligninger med ulike behandlinger og kontrollgruppen ble brukt da sannsynligheten for ANOVA var statistisk signifikant. Statistisk signifikans ble bestemt på et
P
0,05 nivå. Analysen av additivity og synergi ble vurdert av Biosoft CalcuSyn program (Ferguson, MO, USA). Kombinasjonen Index (CI) ble brukt til å uttrykke synergisme (CI 1), additiv effekt (CI = 1), eller antagonisme (CI 1). [57]
Resultater
Effekt av EGFR villtype og T790M spesifikke-sirnas på målet uttrykk og ondartede fenotype
siRNA rettet mot villtype sekvensene var i stand til å slå ned EGFR avskrift, redusere EGFR protein nivå, hemme cellevekst og induserer celle apoptose i alle NSCLC-cellelinjer testet, men med forskjellig størrelse uavhengig av de spesifikke driver genmutasjoner (figur 1). Likeledes kan den T790M-spesifikk-siRNA knock down T790M-mRNA, og også undertrykker celleproliferasjon og forbedre celle caspase-aktivitet i H1975 celler som inneholder T790M mutasjonen. Effekten var mindre potent enn den EGFR-spesifikk-siRNA (data ikke vist). Alle negative kontroll og egge sirnas hadde noen effekt.
lungecancer cellelinjer ble behandlet med EGFR-spesifikk-siRNA 1247. Levende celler og apoptotiske celler ble detektert med Hoechst 33342 og PI dobbel fluorescerende farging. Antallet av apoptotiske celler ble normalisert til antall levende celler i den samme brønnen. Hoechst 33342 og PI dobbel fluorescerende farge × 200
Dual målretting av EGFR og c-MET med sirnas
cellelinjer med forskjellige mutasjoner (KRAS: H358, PTEN. H1650; T790M : H1975) som gjør dem motstandsdyktige mot EGFR TKI ble videre valgt for dual målretting. Motstanden av H1975-celler mot EGFR TKI er blitt tilskrevet tilstedeværelsen av T790M mutasjon, men også til aktivering av c-MET-reseptoren [30], [31]. Synergi av c-MET inhibering med EGFR-hemming er vist i modeller som har en aktivert eller overuttrykt c-MET veien [58]. I vårt eksperiment har vi undersøkt samspillet av EGFR-hemming og c-MET hemming i celler hvor en slik c-MET aktivisering er ikke til stede. En pool av c-MET sirnas hadde liten eller ingen virkning på cellevekst (MTS-analyse) i cellelinjene H358 og H1650. I H1975-celler, ble en meget beskjeden reduksjon i formeringshastigheten observert (til 87%, figur 2A). Det var en tilsvarende mangel på caspase-3/7 induksjon for c-MET-inhibering eneste behandling i alle cellelinjer (figur 2B). Selv om immunoblotting avslørte at c-MET-reseptoren ble effektivt slått ned, og at c-MET fosforylering ble hemmet, også på H1975-celler (figur 3), var det liten virkning på nedstrøms signalisering (AKT, ERK og STAT trasé). c-MET siRNA behandling har alene altså ingen signifikant effekt på noen av NSCLC cellelinjene som ble testet
in vitro
Panel A:. Celleproliferering etter transfeksjon med forskjellige siRNAs. Cellelinjer H358 (hvit), H1650 (grå) og H1975 (svart) ble transfektert med EGFR-spesifikk-siRNA 1247, ble T790M bestemt siRNA, en c-MET siRNA basseng, eller kombinasjoner av disse, og spredning analysert 72 timer etter transfeksjon ved hjelp av en kolo MTS analysen. Panel B: Caspase-3/7-aktivitet. *
P
0,05 og **
P
0,01 i forhold til både enkelt behandling
Panel A: immunoblotanalyse av H358 og H1650 celler transfektert. med villtype EGFR siRNA, en c-MET siRNA basseng eller en kombinasjon av disse. Panel B: Immunoblot-analyse av H1975-celler, som i panel C. Her ble den T790M-spesifikk-siRNA også inkludert. Antistoffer inkludert fosforylert (p-) EGFR, EGFR, pc-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, p-STAT5, p-STAT3, og β-aktin.
tillegg av EGFR siRNA (enten villtype eller T790M spesifikk) til c-MET sirnas forbedret veksthemming i H358 og H1650 celler sammenlignet med EGFR siRNA alene, men mye mindre grad i H1975 celler (figur 2A). Kombinert behandling økte også caspase-3/7-aktivitet. I H1650-celler i apoptose signal selv øket til 8,94 ganger av kontrollen sammenlignet med enkelt EGFR siRNA (4,16-fold. I H1975-celler, var det en mer beskjeden økning til 3,29 ganger, som er noe høyere enn EGFR siRNA alene (2,26 fold). Western blotting, imidlertid, viser at kombinasjonen EGFR /c-MET siRNA var i stand til å påvirke den ERK-reaksjonsveien også (i tillegg til AKT, figur 3), som er i motsetning til EGFR inhibering alene. den ERK-reaksjonsveien ble nedregulert mest i H1975 celler, mens den største reduksjonen av p-AKT ble observert i H1650 celler.
effekten på levedyktighet ble også vurdert ved hjelp av en fluorimetrisk resorufin levedyktighet analysen og ved mikroskopisk telling av levedyktige (Hoechst 33342 positive /PI negative) celler. i begge analyser av resultatene speilet MTS-tetrazolium assay (data ikke vist). på samme måte, caspase-3/7-aktivitet ble også bekreftet av Hoechst og PI dobbel fluorescerende farging analyse (data ikke vist).
dual målretting av EGFR med TKI eller cetuximab og c-MET med su11274
Vi bekreftet videre om resultatene som oppnås med kombinert siRNA behandling kan bli etterlignet ved hjelp av dual EGFR og c-MET-spesifikke hemmere som kan være lettere brukes
in vivo
. Lungekreft celler ble behandlet med singelen EGFR TKI gefitinib, erlotinib, eller afatinib, og i kombinasjon med c-MET inhibitor su11274. Kombinasjonen av det monoklonale EGFR-antistoff cetuximab med su11274 ble også undersøkt.
Effekten av su11274 alene på cellevekst og apoptose var ekstremt svak i alle tre cellelinjer, selv om det var en noe sterkere virkning på H1975-celler som har høyere c-MET ekspresjon enn de andre to cellelinjer (figur 4). Ved en konsentrasjon på 1 uM su11274, for eksempel, en reduksjon på 20-30% i den formeringshastigheten og en moderat økning på 40-50% i kaspase-3/7-signaler i kontrast til en manglende effekt i de to andre cellelinjer (Figur 4, Figur 5). Disse resultatene er sammenfallende med de c-MET siRNA eksperimenter.
H358, H1650 og H1975 cellene ble inkubert med et konsentrasjonsområde på su11274, og cellene ble inkubert i 72 timer. Panel A: spredning. Panel B: caspase-3/7-aktivitet. Panel C: apoptose. Panel D:. Dose-effekt-kurver
Panel A: spredning av celler etter enkel eller kombinert TKI behandling. Cellelinjer H358 (hvit), H1650 (grå) og H1975 (svart) ble dyrket i RPMI som inneholder 10% FBS og 1 mikrometer su11274, gefitinib, erlotinib, afatinib eller cetuximab, og deres kombinasjoner. Utbredelsen ble analysert 72 timer etter behandling ved hjelp av en kolo MTS analysen. Panel B: caspase -3/7 induksjon av én eller kombinert TKI behandling. *
P
0,05 og **
P
. 0,01 i forhold til både enkelt behandling
I kombinasjon med EGFR TKI, konsentrasjonene ble opprettholdt ved 1 uM for alle agenter. I H358 og H1650-celler (figur 5A), den TKI alene induserte en liten reduksjon i cellevekst (maksimalt ved 41% i H1975 med afatinib, figur 5A), og en moderat økning av kaspase-3/7-signaler (ved 1,6 ganger -at maksimal også i H1975 med afatinib, figur 5B) i forhold til kjøretøykontroller. Kombinasjonene med su11274 var i stand til å redusere celleveksten noe lenger i H358 og H1650, og kombinasjonen effekten var mer potente i H1975 (særlig su11274 + afatinib, figur 5A). Samtidig ble tilsetningen av su11274 tilbudt noen gevinst i kaspase-3/7-signaler, i samsvar med celleveksthemmings data (figur 5B). De sterkeste effektene ble sett i H1975 celler, kjent for å være EGFR-TKI resistente. I disse cellene, mono behandling med gefitinib og erlotinib er ineffektiv, mens afatinib kan redusere vekst og indusere apoptose. Alle kombinasjoner med su11274 oppnådd en forbedret effekt på cellevekst og apoptose. Kombinasjonen su11274 + afatinib var i stand til å redusere cellenes levedyktighet med 49% ved en uM konsentrasjon (figur 5A), og øket apoptotiske signaler til 2,64 ganger (figur 5B).
For å fastslå den additive eller synergistiske natur av de to behandlinger, ble en serie med konsentrasjoner opp til 1 pM satt opp for hver forbindelse og kombinasjonene. Effekten ble scoret med kolo MTS formazanforbindelsen spredning analyse, og en CI som skiller mellom additive og synergistiske effekter ble beregnet (Biosoft Calcusyn programvare). Resultatene entydig viser at den samlede virkningen av alle agenter på spredning i H358 og H1650 var additiv. I H1975 celler, ble en additiv effekt fra gefitinib eller erlotinib eller cetuximab + su11274 også observert (figur 6). Imidlertid er kombinasjonen av afatinib + su11274 mottok en synergistisk (CI 1) i cellevekst-inhibering og induksjon av apoptose (figur 7). Denne synergistiske effekt kunne forklares ved samarbeidende inhibisjon av den proliferative /overlevelse og anti-apoptotiske signalveier AKT, ERK og STAT (figur 8). Western blot foreslått at inhibering av disse tre baner er spesielt effektiv i H1975 celler etter kombinert behandling med su11274 + afatinib (figur 8).
kombinasjonsindeksen (CI) ble beregnet i H1975. Konfigurasjons 1, noe som indikerer additiv effekt (Panel A: gefinib + su11274; Panel B: erlotinib + su11274; Panel C: cetuximab + su11274).
Kombinasjons Index (CI) av afatinib og su11274. Her CI av afatinib + su11274 1, noe som indikerer synergistisk effekt
Immuno blotting av cellelysatene av H358, H1650 og H1975 celler behandlet med enkel eller kombinert TKI /cetuximab.. Antistoffer inkludert fosforylert (p-) EGFR, EGFR, pc-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, p-STAT5, p-STAT3, og β-aktin.
diskusjon
EGFR er en terapeutisk mål i NSCLC. I en tidligere studie har vi vist at monoterapi legemiddelmålretting med EGFR-TKI ikke oppnår en maksimal biologisk effekt, selv på sensitive cellelinjer, og at tilsetningen av EGFR-spesifikk-siRNA til EGFR TKI eller cetuximab øker den terapeutiske effekter [45 ]. Men bare rettet mot EGFR veien er ikke effektive i celler som havn resistensmekanismer og er utilstrekkelig til å annullere hele ondartede fenotype i følsomme celler. Dermed er det neste spørsmålet var om samtidig hemmer utskillelsen av EGFR og c-MET, ved RNAi, vil resultere i økte biologiske effekter, og derfor være nyttig for å overvinne TKI motstand i H1975 celler. Tang et al [28] har vist at kombinasjonen av EGFR siRNA og c-MET siRNA på H1975-celler resulterte i forbedret inhibering av EGFR nedstrøms signalering, omfattende de pro-overlevelse AKT og STAT3 veier. Her utforsket vi effekten på cellevekst og apoptose. Tilsetningen av c-MET siRNA til enten EGFR villtype eller T790M-spesifikke sirnas, resulterte i en øket effekt på cellevekst-inhibering og caspase-3/7-aktivitet induksjon. EGFR villtype siRNA var mer potent enn T790M siRNA, i overensstemmelse med enkelt siRNA resultater som er beskrevet ovenfor, og i overensstemmelse med graden av inhibering reaksjonsveien (se nedenfor). Kombinasjonen med c-MET siRNA økt veksthemming og apoptoseinduksjon mer betydelig i H358 og H1650 celler. Immunoblotting viser en konsistent nedregulering av fosfo-AKT, i samsvar med Tang et al. [28], men den nedregulering av fosfo-STAT3 var svakere. Vi fant også at to nedstrøms signalene ble hemmet: fosfor-STAT5 og spesielt fosfor-ERK1 /2. Når T790M og c-MET sirnas ble kombinert, samarbeidende effekten var mindre potent.
Den doble målretting av EGFR og c-MET ble deretter bekreftet ved hjelp TKI (gefitinib, erlotinib og afatinib pluss su11274). Enkelt middel behandling med enten inhibitor, i de tre EGFR TKI resistente cellelinjer hadde en relativt svak virkning på vekst-inhibering og induksjon av apoptose, og var til og med minimal eller fraværende for c-MET-inhibitor. Imidlertid kan høyere doser av erlotinib indusere apoptose i KRAS mutant cellelinje H358 [45]. I denne studien fant vi at en kombinasjon av su11274 og erlotinib hadde også en høyere effekt på cellevekst hemming i H1975 celler. Graden av inhibering (35%) var i samme størrelsesorden som rapportert av andre (ved 42%) [28]. For å fastslå den additive eller synergistiske art av dobbel behandling, ble en serie av økende konsentrasjoner TKI satt opp. Effektene ble evaluert ved anvendelse av den kolorimetriske MTS formazan proliferasjonsanalyse, og en CI ble beregnet. Effekten av dual erlotinib pluss su11274 behandling i H1975-celler var additiv. En lignende additiv effekt ble funnet med gefitinib eller cetuximab pluss su11274 i H1975 celle. Imidlertid er kombinasjonen av afatinib og su11274 hadde klart en synergistisk effekt på cellevekst-inhibering på H1975-celler.
