Abstract
Den aktiverte AHR /ARNT kompleks (AHCR) regulerer uttrykket av målgener på eksponering for miljøgifter som 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-
p
-dioksin (TCDD). Viktigere, har bevis vist at TCDD undertrykker østrogen reseptor (ER) target genet aktivering gjennom AHRC. Våre data indikerer at AHR og ARNT opptre uavhengig av hverandre ved ikke-dioksin respons element nettsider. Derfor søkte vi å finne de spesifikke funksjonene AHR og ARNT i østrogenavhengig signalering i menneskelig MCF7- brystkreft og menneske ECC-1 endometrial carcinoma celler. Knockdown av AHR med siRNA opphever dioksin-induserbare undertrykkelse av østrogen-avhengige gentranskripsjon. Forbløffende nok ikke knockdown av ARNT ikke effekten TCDD-mediert undertrykkelse av østrogen-regulert transkripsjon, noe som tyder på at AHR undertrykker ER fungere uavhengig av ARNT. Denne teorien er støttet av evnen til selektiv AHR modulator 3 «, for å 4»-dimetoksy-α-naphthoflavone (DiMNF) undertrykker østrogen-induserbar transkripsjon. Videre basal og østrogen-aktivert transkripsjonen av gener som koder for
kathepsin-D
og
pS2
er nedregulert i MCF7-celler, men oppregulert i ECC-1 celler som respons på tap av ARNT. Disse svarene er speilet på proteinnivå med cathepsin-D. Videre knock-down av ARNT førte til motsatte, men tilsvarende endringer i østrogenstimulert spredning i både MCF7 og ECC-1 celler. Vi har fått eksperimentelle bevis som viser et dioksin avhengig repressor funksjon for AHR og dioksin uavhengig co-aktivator /co-repressor funksjon for ARNT i østrogen signalering. Disse resultatene gir oss ytterligere innsikt i mekanismene for transkripsjon faktor crosstalk og mulige terapeutiske mål i østrogen-positiv kreft
Citation. Labrecque MP, Takhar MK, hollingshead BD, Prefontaine GG, Perdew GH, Beischlag TV ( 2012) Tydelige roller for aryl hydrokarbon~~POS=TRUNC Receptor Nuclear Translocator og Ah reseptor i Østrogen-mediert signalering i humane kreftcellelinjer. PLoS ONE 7 (1): e29545. doi: 10,1371 /journal.pone.0029545
Redaktør: Bernhard Ryffel, Fransk Nasjonalt senter for Scientific Research, Frankrike
mottatt: 24 oktober 2011; Godkjent: 30 november 2011; Publisert: 03.01.2012
Copyright: © 2012 Labrecque et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske Breast Cancer Foundation – BC /Yukon, naturvitenskap og Engineering Research Council til Dr. Beischlag, og en National Institutes of Health gi ES04869 til Dr. Perdew. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
klargjørende mekanismene som ligger til grunn transkripsjon er avgjørende for vår forståelse av hvordan celler og organismer svare på fysiologiske signaler og miljømessige stimuli. The aryl hydrokarbon reseptor (AHR) og aryl hydrokarbon reseptor atom Translocator (ARNT) er medlemmer av den grunnleggende helix-loop-helix /PER-ARNT-SIM (bHLH-PAS) familie av proteiner og danner en heterodimere transkripsjonsfaktor ved binding en rekke miljøgifter, inkludert 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-
p
-dioksin (TCDD) [1]. Den aktiverte AHR /ARNT kompleks (AHCR) spiller nøkkelroller i kreftutvikling og regulerer uttrykket av
cytokrom P4501A1 product: (
CYP1A1
) og andre xenobiotisk målgener for å bekjempe effektene av miljøgifter [1 ]. I tillegg har AHR vist seg å være viktig for normal utvikling og fysiologisk homeostase [2], [3], [4] og er viktig for visse funksjoner av immunresponsen, slik som regulering av interleukin-17 produserende T-hjelperceller [5] og induksjon av cytokinet interleukin-6 i MCF7 brystcancerceller [6].
Unliganded AHR finnes i cytoplasma som en del av et multimert kompleks som inneholder to molekyler av HSP90, den HSP90 ko-p23 anstand , og hepatitt B-virus X-assosiert protein 2 (XAP2) [7], [8], [9], [10]. Ved ligandbindende, AHR translocates til kjernen hvor den knyttes til ARNT for å danne et funksjonelt transkripsjonsfaktorkompleks, AHRC. Som et aktivert kompleks, er det AHRC i stand til å rekruttere regulatoriske proteiner, så som steroid-reseptor coactivator-1 (SRC-1), CREB bindende protein (CBP /P300), NCoA2 /GRIP1 [11], [12], reseptor-veksel -protein 140 (RIP140) [13], kakao [14], GAC63 [15], NcoA4 [16] og TRIP230 [17], som spiller viktige roller i å bestemme aktiviteten til TCDD-indusert gentranskripsjon. Disse co-aktivatorer og co-repressors innlemme seg inn multimæriske komplekser som modifiserer kromatinstruktur, stabilisere kjernen transkripsjonen maskiner, og megle RNA kjedeforlengelse [18]. I tillegg til disse klassiske transkripsjonelle ko-aktivatorer og ko-repressorer er AHR rekruttert av andre transkripsjonsfaktorer under transkripsjon, blant annet østrogen reseptor-α (ERα) [11], [19], [20] og NF-kB [21] å endre sine iboende aktiviteter.
ERα /β er ligand aktivert transkripsjonsfaktorer som tilhører superfamily av atomhormonreseptorer (NR) [22] og binder 17β-østradiol (E2) gener involvert i reproduksjon å regulere og cellevekst og spredning [23]. Ved ligand binding, danner ER en funksjonell homodimer og binder sine beslektede responselementer. Interessant er det en ligand-avhengig gjensidig forstyrrelse mellom ER og AHR signalering. For eksempel, aktiveres ERα hemmer AHCR aktivitet på
CYP1A1
gjennom direkte protein-protein interaksjoner, kalt
transrepression product: [11]. Omvendt er TCDD anti-østrogen egenskaper godt dokumentert som det undertrykker de E2-induserbare gener
pS2 Hotell og
cathepsin-D (CAT-D) product: [24], [25], [26 ]. Men mekanismene for undertrykkelse som forekommer på E2-responsive gener er uklart. Foreslåtte teorier for denne undertrykkelse omfatter: (i) konkurranse om et felles forråd av ko-aktivatorer [27]; (Ii) en direkte nedregulering av
CAT-D
transkripsjon gjennom oppstrøms inhiberende dioksin respons elementer [28]; (Iii) aktivering av en TCDD-induserbar faktor-inhiberende [28]; (Iv) en AHR-avhengig E3-ligase som degraderer proteiner avgjørende for ER-signalisering [29], eller; (V) en direkte interaksjon mellom transrepression AHR og ER [11], [19].
I denne studien undersøkte vi rolle AHR og ARNT på ERα avhengig target gentranskripsjon i den humane MCF7 brystcancer og de menneskelige ECC-1 endometrial-livmorhalskreft cellelinjer. Våre data tyder på at AHR og ARNT opptre uavhengig av hverandre ved off-målse og vi viste at ARNT er ikke avgjørende for TCDD avhengig undertrykkelse av ER-signalering. I tillegg har vi vist at ARNT fungerer som en cellespesifikk coactivator i MCF7-celler, og som en corepressor i ECC-1-celler. Til slutt viser vi at ARNT knockdown ikke bare påvirker opphopning av mRNA og protein av ERα-målgener, men har også fenotypiske konsekvenser ved å påvirke ERα-mediert celleproliferasjon.
Resultater
AHR-avhengige undertrykkelse av østrogen signalisering i ECC-1 celler
tilstedeværelsen av AHR, ARNT og ERα på dioksin-induserbare
CYP1A1
enhancer og E2-induserbare
pS2
arrangøren har allerede blitt dokumentert i MCF7-celler og andre brystcancercellelinjer [11], [19], [20], [30]. Selv om foreløpige studier har identifisert ECC-1 menneskelige endometrial celler som et ideelt system for å studere dioksin forstyrrelse av østrogen signale [31], [32] svært lite er kjent om rollene til AHR, ARNT og ER og deres respektive interaksjoner i denne cellelinjen . Vi benyttet brikken analyse for å fastslå status for disse proteinene på
pS2
promoter og
CYP1A1
forsterker i både tilstedeværelse og fravær av E2 og TCDD. ECC-1-cellene ble behandlet med DMSO, 10 nM E2, 2 nM TCDD eller en kombinasjon av E2 og TCDD i 45 min. Etter kjemisk tverrbindingsprotein til DNA med formaldehyd, ble cellene høstet og sonikert. Skåret DNA-proteinkomplekser ble utfelt med antistoffer som er spesifikke til AHR, ARNT eller ERα og deretter isolert komplekser ble revers-tverrbundet og DNA ble underkastet PCR-amplifikasjon. I samsvar med andre søkernes observasjoner i brystkreftceller, observerte vi rekruttering av AHR og ARNT på menneske
CYP1A1
forsterker i en TCDD avhengig måte og ERα ble sterkt beriket bare etter behandling med en kombinasjon av to nM TCDD og 10 nM E2 (figur 1A). Videre rekruttering av ERα til
pS2
promoter forekommer i en E2-avhengig måte mens AHR og ARNT er til stede etter behandling med enten ligand men er beriket ved samtidig behandling (figur 1B).
Chromatin immunoutfellingsstudier analyser av
CYP1A1
forsterker (A) og
pS2
promoter (B) regioner i ECC-1 celler ved hjelp av antistoffer rettet mot AHR, ARNT eller ERα. Cellene ble behandlet i 45 minutter med enten DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) eller en kombinasjon av E2 og TCDD. (C og D) Den funksjonelle rolle av AHR i TCDD-mediert transkripsjon. ECC-1-celler ble transfektert med sirnas til enten GFP (siGFP) som en negativ kontroll eller AHR (siAHR # 3 eller siAHR # 4) 24 timer før ligand behandling, deretter ble cellene behandlet med DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) eller en kombinasjon av E2 og TCDD. De mRNA nivåer for
pS2 product: (C) og
CYP1A1 product: (D) ble bestemt gjennom real-time RT-PCR og normalisert til konstitutivt aktiv GAPDH uttrykk. (E) ECC-1 celler ble transfektert med siRNA-tallet til AHR og høstet for helcellelysater for Western blot analyse av AHR, ERα og XAP2 proteinnivåer.
Vi har tidligere vist at ERα forbinder med AHCR å formidle østradiol-avhengig transrepression av dioksin-induserbar gentranskripsjon [11]. Derfor setter vi ut for å bestemme den funksjonelle betydningen av AHR i østrogen-induserbar gentranskripsjon. Vi transfektert ECC-1-celler med liten inhiberende RNA rettet mot enten AHR (siAHR) eller et GFP negativ kontroll (siGFP). Etter transfeksjon ble cellene serum sultet i 24 timer, etterfulgt av 24 timers behandling ligand og deretter høstet for total mRNA ble kvantifisert ved kvantitativ PCR. Som forventet, ablasjon av AHR og samtidig behandling med 2 nM TCDD og 10 nM E2 resulterer i tap av TCDD-indusert undertrykkelse av
pS2
transkripsjon (figur 1C). Men tapet av AHR hadde ingen målbar effekt på basal eller østrogen aktivert
pS2
mRNA akkumulering. Som en kontroll for siRNA spesifisitet, Western blot av AHR protein viser en sterkt redusert uttrykk for AHR protein etter transfeksjon og uendret proteinnivåer ERα og XAP2 som fungerte som en lasting kontroll (figur 1E). Disse viser spesifisiteten av siRNA-tallet til AHR, og at tap av AHR påvirker ikke opphopning eller omsetning av basale ERα protein nivåer. Videre er induksjon av
CYP1A1
transkripsjon med TCDD etter AHR knockdown blir dempet i forhold til den siGFP negativ kontroll (figur 1D). Således er AHR et krav for TCDD-indusert undertrykkelse av E2-responsive gentranskripsjon og den økte transkripsjonen respons med kombinatorisk behandling er utelukkende på grunn av tap av AHR og andre mulige transkripsjonelle modifiseringsmidler i forbindelse med dens nærvær. Til slutt fikk vi i hovedsak identiske resultater i både MCF7- og ECC-1 cellelinjer i henhold til serum-sultet eller kull-strippet serum forhold som tyder på at forskjeller i cellelinjene evne til å gå gjennom cellesyklusen påvirker ikke dette fenomenet. Sammen utgjør disse resultatene støtter ideen om at ECC-en cellelinje er et utmerket alternativ celle modell for å studere dioksin-indusert forstyrrelse av østrogen reseptor signalisering.
ARNT har cellespesifikke co-aktivator /co-repressor funksjoner
Identifiseringen av ARNT som en co-aktivator i østrogen signale [27], [30], sammenstilt med de kjente transrepressor effekter av TCDD, ledet oss til å undersøke hvilken rolle ARNT i TCDD-mediert transrepression av ER funksjon i forskjellige humane kreftcellelinjer, nemlig MCF7 og ECC-1-celler. Gjennom siRNA rettet mot ARNT og en egge negativ kontroll (siSCX), og påfølgende qPCR analyse av endogen
pS2 Hotell og
CAT-D
gentranskripsjon, har vi gjort flere interessante observasjoner. Først viser ARNT co-repressor eiendommer i ECC-1 celler. Opphopning av
pS2 plakater (figur 2A) og
CAT-D plakater (figur 2B) mRNA nivåer forsterkes under E2 behandlinger etter tap av ARNT tyder på en celle spesifikk funksjon for ARNT uavhengig av AHR. Videre observerte vi at dette fenomen med tre separate sirnas rettet mot ARNT (siRNA s 1 og 3 er vist i figur 2A, B og C). Vi brukte minst to siRNA-er for alle andre eksperimentelle parametere med i det vesentlige identiske resultater, men for korthets skyld heretter vi bare angir data som viser bruken av en siRNA. Dernest, i samsvar med funnene i flere andre forskere, vises ARNT co-aktivator eiendommer i MCF7 celler [27], [30]. Faktisk, knockdown av ARNT protein demper E2-indusert transkripsjon av
pS2 plakater (figur 2C) og
CAT-D plakater (figur 2D). Til slutt, i et doseresponsforsøk, ble det observert en samtidig reduksjon av CAT-D-proteinnivåer med økende konsentrasjoner av TCDD i både ECC-1 og MCF7 celler (figur 2E). Disse data indikerer at ARNT funksjon i tilknytning til ER signalisering er sannsynligvis diktert av andre faktorer som er spesifikke for det cellulære miljø.
ECC-1-celler (A og B) og MCF7 celler (C og D) ble transfektert med enten egge siRNA (siSCX) eller siRNA rettet mot ARNT (siARNT # 1 eller siARNT # 3). Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med bærer (DMSO), E2 (10 nM), TCDD (2 nM) eller en kombinasjon av E2 og TCDD. Genekspresjon ble bestemt ved sanntids RT-PCR etter isolering og revers transkripsjon av total RNA.
CAT-D Hotell og
pS2
uttrykk ble normalisert til konstitutivt aktiv 36B4 genuttrykk. (E) Western blot-analyse av CAT-D-proteinnivåer i MCF7 og ECC-1-celler. Cellene ble behandlet med DMSO eller E2 (10 nM) og varierende konsentrasjoner av TCDD (10 PM, 50 pm, 100 pm, 500 pM, 1 nM eller 5 nm). Etter 24 timers behandling, ble helcellelysater høstet, og Western Blot analyser ble utført ved bruk av antistoffer rettet mot CAT-D og α-tubulin. Feilfelt representerer ± S.D. * P. 0,05
For å finne ut om modulering av transkripsjonen aktivitet oversatt til lignende protein uttrykk profiler, vi brukte Western blot analyse for å visualisere nivået av CAT-D protein etter ARNT knockdown. -Celler ble transfektert og liganden ble behandlet under identiske betingelser som qPCR parametere. Sammenlignet med det forvrengte negative kontroll, er CAT-D proteinekspresjon etter E2 behandling forsterkes i ECC-1-celler med ARNT knockdown (figur 3A). Omvendt, MCF7-celler transfektert med ARNT siRNA resulterte i en avstumpet ekspresjon av CAT-D-proteinet i løpet av E2-behandling (figur 3C). Videre ERα nivåer forble konsekvent, uavhengig av ARNT status (figur 3A og C). Viktigst var dioksin-indusert undertrykkelse av ER signalering opprettholdes på proteinnivået etter ARNT knockdown (figur 3A og C). De representative blotter ble normalisert til a-tubulin og luminescens ble målt ved hjelp av GeneTools 4.01.2 programvare (Syngene). Disse normaliserte verdier viste en todelt induksjon av CAT-D i ECC-1 celler med ARNT knockdown etter E2 behandling (Figur 3B, kolonne 2 og 6), mens i MCF7 celler, knock-down av ARNT resulterte i en reduksjon 40% i E2-avhengig CAT-D-uttrykk (figur 3D, colunms 2 og 6). Disse resultatene gir konkret bevis på at nivået av protein ekspresjon speil transkripsjonen respons i begge cellelinjer, og at fysiologiske konsekvenser må følge med tap av ARNT.
ECC-1 (A og B) og MCF7 (C og D ) celler ble transfektert med enten siSCX eller siARNT og ligand behandlet som beskrevet i figur 2. (A og C) Representative Western-blots av ARNT, CAT-D, ERα og a-tubulin proteinnivåer. Stolpediagrammene i CAT-D-proteinnivåer i ECC-1 (B) og MCF7 (D) celler etter normalisering luminescens verdier til a-tubulin. Åpne barer representerer ligand behandlinger etter siRNA til egge negativ kontroll (siSCX) og lukket (svart) barer representerer ligand behandlinger etter siRNA til ARNT (siARNT). Eksperimenter ble utført tre ganger med i det vesentlige identiske resultater.
Disse overraskende resultater ble koblet med den observasjon at TCDD-indusert undertrykkelse av ER-signalisering er holdt i begge cellelinjer etter ARNT knockdown (figur 2 og 3 ) således tilveiebringe bevis for at ARNT ikke er nødvendig for TCDD /AHR avhengig undertrykkelse av ERα signalering. Denne hypotese støttes av evnen til en selektiv aryl-hydrokarbon-reseptor modulator (SAHRM) for å undertrykke østrogensignalisering. Vi undersøkte evnen til kjente SAHRM, DiMNF [33], [34] for å undertrykke E2-medierte transkripsjon ved RT-PCR i MCF7 og ECC-1-celler (figur 4). DiMNF var så effektiv på å undertrykke CAT-D mRNA akkumulering som TCDD. DiMNF er en potent antagonist av AHR og fortrenger effektivt TCDD fra reseptoren på 1 mikrometer [34]. I tillegg klarer DiMNF å indusere AHR-ARNT-dioksin responselement dannelse i en elektroforetisk mobilitet skift analyse, noe som tyder på at AHR-ARNT dimerisering ikke kan oppstå [34], og dermed er det sannsynlig at AHR s transrepression funksjon er helt ARNT-uavhengig.
effekten av en mikrometer DiMNF på E2-induserbar CAT-D uttrykk i MCF7- og ECC-1 celler. Celler ble behandlet med de angitte ligander i 24 timer forut for RNA-isolering. Genekspresjon ble bestemt som beskrevet ovenfor. Feilfelt representerer ± S.D. * P. 0,05
Arnt knockdown fører til økt spredning i ECC-1 celler og redusert spredning i MCF7 celler
Følsomhet for østrogen har vært knyttet til spredning og celle transformasjon i ER- positive carcinoma celler [35]. For å fastslå om ARNT kan påvirke E2 avhengig cellulær proliferasjon, utførte vi spredningsanalyser på ECC-1 og MCF7 celler etter ARNT siRNA behandling. Konsistente med vår kvantitative PCR og Western blot data, ECC1 og MCF7 celler vises endrede satsene for spredning etter ARNT knockdown sammenlignet med celler transfektert med egge negativ kontroll siRNA (figur 5A og B). Knockdown av ARNT ble overvåket i 72 timer og den betydelige knock-down observert var uendret i det vesentlige ved hvert tidspunkt (figur 5C). Heller ikke vises cellelinje endrede vekstmønstre inntil 48 timers tidspunkt. Ved 48 timer, ECC-1-celler i både siSCX og siARNT betingelser viste moderat proliferasjon i respons til E2-behandling. Ved 96-timers tidspunktet, var det en svært signifikant økning i E2-induserbare proliferasjon av ECC-1-celler behandlet med siARNT, sammenlignet med kontrollegge behandlede celler. Forbløffende nok ARNT knockdown økt basal vekstrater og forårsaket en forsterket reaksjon på E2 med mobilnummeret nesten dobling i siARNT E2 behandlinger i forhold til de siSCX E2 behandlinger. Motsatt MCF7 celler viste en redusert spredning rente etter ARNT knockdown (figur 5B). Vekstratene var ikke signifikant forskjellige inntil 48 h tidspunkt, da den E2-induserbare proliferativ respons i det omkastede negative kontroll var tydelig. De siARNT transfekterte cellene hadde en avstumpet vekstrespons under både kontroll og E2 forhold. På 96 timer, cellene begynte å miste følsomhet for E2 og inngått en senescent tilstand. Hvorvidt dette var på grunn av vekstvilkår er uklart. Men disse dataene støtter videre hypotesen om at ARNT har co-repressor eiendommer i ECC-1 celler og co-aktivator eiendommer i MCF7 celler. Videre er følsomheten til E2 og den gjensidige vekstresponser som oppvises av de to cellelinjene er bona fide fenotypiske konsekvenser av ARNT ablasjon.
ECC-1 (A) og MCF7 (B) celler ble transfektert med enten siSCX eller siARNT i 6 timer, deretter trypsinert og reseeded på 10.000 celler /brønn i 12-brønners retter. Tjuefire timer etter utsåing ble cellene behandlet med enten DMSO eller E2 (10 nM), og celletellinger ble utført på 0, 48 og 96 timer etter behandling med en Fuchs-Rosenthal tellekammer. Ved 48 h tidspunkt ble cellene behandlet en andre gang med 10 nM E2. Forsøkene ble utført in triplo, og hver studie ble tellet tre ganger. (C) Western blot analyse av ARNT etter siRNA knock-down avslører at betydelig knock-down ble oppnådd, og vedvarer over en 72 timers periode. Feilfelt representerer ± S.D. * P. 0,05
Diskusjoner
Mange miljøgifter som fungerer som aktivatorer av aryl hydrokarbon reseptor er kjent som mulige hormonforstyrrende stoffer. Eksponering for mange av disse forbindelsene oppstår på en daglig basis, og representerer betydelig risiko for menneskers helse. Spesielt har de undertrykkende virkninger fremkalt av ligander av AHR på ER-signalering er godt dokumentert [11], [19], [36], [37], [38]. Andre rapporter har beskrevet co-aktivator potensialet for ARNT for ER-mediert transkripsjon [27]. Til tross for den økende bevis for å støtte roller for AHR og ARNT i ER funksjon, er lite kjent om den normale fysiologiske rollen til disse proteinene som de forholder seg til østrogen signalering eller de molekylære determinanter av gift-indusert transrepression av ER funksjon ved AHR. Til slutt, denne undersøkelsen viste at ARNT er ikke avgjørende for AHR-mediert off-target transrepression. For å avgrense de molekylære mekanismene bak AHR-mediert transrepression søkte vi å frikoble AHR og ARNT funksjon i ER-positive humane kreftcellelinjer. Ved å gjøre dette, fant vi at ARNT demper aktivert ER-target gentranskripsjon i ECC-1-celler, i direkte kontrast til dens ko-aktivator funksjon er beskrevet i MCF7-celler [27].
ARNT ble opprinnelig identifisert som en bona fide transkripsjonsfaktor [39] og dimerization partner av AHR [40]. Utover sin kanoniske transkripsjonsfaktor funksjonen kan ARNT samhandle med flere andre transkripsjonsfaktorer, inkludert ERα [11] og dens co-aktivator funksjon for ER signalering har blitt godt beskrevet [27], [30]. Derfor forventet vi at knockdown av ARNT i ECC-1 endometrial-livmorhalskreftceller vil resultere i en reduksjon av ER målet genuttrykk. Den resulterende økning i mRNA-akkumulering, proteinekspresjon og E2-induserbar spredning sterkt antyder at ARNT virker som en transkripsjons co-repressor i denne cellelinje. Den molekylære mekanisme (r) bak de forskjellene som ble observert i MCF7 og ECC-1-celler sannsynligvis er relatert til forskjeller i natur og sammensetning av det hjelpe-transkripsjonelle maskiner rekruttert av ARNT i hver cellelinje. ARNT presenterer flere forskjellige protein-protein interaksjons domener for rekruttering av co-aktivator proteiner, inkludert en karboksyterminal transdomene [18], sin PAS-B-regionen [41] og dens grunnleggende-helix-loop-helix domene [12] . I tillegg er en sammenheng mellom ARNT og den transkripsjonelle co-repressor-proteinet, SMRT er blitt demonstrert [42]. Vi mener imidlertid at dette er den første demonstrasjonen som ARNT har to co-aktivator /co-repressor funksjoner i en celle-spesifikk måte (figur 6). I tillegg kan ettervirkningene av disse transkripsjons effekter observeres på translasjonsforskning og fenotypiske nivåer.
Tilstedeværelsen av E2 forenkler monteringen av transkripsjons modifikatorer som induserer transkripsjon av E2-responsive gener. Ligand aktivert AHR undertrykker ER-signalering uavhengig av ARNT. Tapet av ARNT i ECC-1-celler, hvor det virker som et co-repressor, fører til økt følsomhet for E2 og økt transkripsjonen aktivitet i ER-regulerte gener. Tapet av ARNT i MCF7 celler, hvor det fungerer som en co-aktivator, fører til redusert følsomhet for E2 og reduserer transkripsjonen aktivitet på ER regulerte gener.
Flere modeller har blitt antatt å forklare den molekylære mekanismene bak transkripsjonsfaktor mediert krysstale, spesielt muligheten for en transkripsjonsfaktor for å undertrykke en annen funksjon [18]. Reugg og kolleger, blant andre, har antydet at transkripsjonsfaktor-mediert transrepression kan være et resultat av konkurranse for en begrenset pool av co-aktivator proteiner [27]. Imidlertid identifisering av ARNT som en ko-repressor i ECC-1-celler avslører en mer kompleks mekanisme av transrepression ved E2-induserbare gener deretter ko-aktivator konkurranse modell antyder. Selv om disse dataene ikke definitivt avkrefte denne modellen, mener vi at våre data tyder på at det er usannsynlig fordi co-aktivator konkurranse ikke kan gjøre rede for TCDD-induserbar undertrykkelse i ECC-1 celler som aktiveres AHR bør squelch ARNT co-repressor funksjon. I tillegg ARNT, et protein som har vist evne til å rekruttere tallrike ko-aktivatorer [12], [15], [17], [41], [43], [44] bør illegale en virkning som ligner på ligand-aktiverte AHR om co-aktivator bassenger var i en slik begrenset tilførsel at konkurransen ville hindre enkelte transkripsjonsfaktor funksjon. Dette er åpenbart ikke tilfelle i ECC-en cellelinje.
Den eksperimentelle bevis er presentert ovenfor indikerer at AHR ikke krever ARNT å formidle sin off-target transrepressor effekter. Tap av ARNT i både MCF7 og ECC-1 celler mislyktes i å oppheve de undertrykkende virkninger av TCDD for E2-induserbar transkripsjon og protein ekspresjon (figurene 2 og 3). Effektene DiMNF-bundet AHR er uavhengige av dioksin responselement binding som atom ekstrakt fra celler behandlet med DiMNF ikke retarderer bevegelsen av et merket dioksin responselement sonde i gel-skift-analyser [34]. Videre er AHR-ARNT dimerization et krav for DNA-bindende, noe som tyder på at dette ikke kan skje i nærvær av DiMNF. Dette representerer et paradigmeskifte i vår forståelse av AHR funksjon og har implikasjoner for bruken og effekten av selektive Ahr modulatorer. Faktisk har en ny AHR antagonist vist seg å være en potent stimulator av AHR-avhengige stamcelle utvidelse [45]. Dermed kan antagonister som ikke lokke fram AHR-ARNT dimerization være mer effektive repressors av ER funksjon enn rene agonister som AHR ikke ville bli squelched av ARNT bindende. Den sarhm DiMNF er en potent AHR-avhengig repressor cytokin signalering [33], [34]. Videre DiMNF var effektive i å undertrykke ER-regulert target-genekspresjon (figur 4). Molekylære modellering studier viser at DiMNF danner en ekstra hydrogen bånd med AHR på Thr289 [34], en egenskap ikke delt med partiell agonist α-naphthoflavone tyder på at DiMNF-AHR vedtar en unik bekreftelse. Således, flavonoider representerer en klasse av forbindelser som kan være attraktive mål for ytterligere testing og utvikling for å bestemme deres virkninger på ER mål genekspresjon.
eksperimentelle bevis demonstrerer en TCDD-avhengig repressor funksjon for AHR og en TCDD /AHR uavhengig co-aktivator /co-repressor funksjon for ARNT i østrogen signalering. Disse resultatene gir oss ytterligere innsikt i mekanismene for transkripsjon faktor crosstalk og mulige terapeutiske mål i østrogen-positiv kreft. Til sammen tyder våre data en mer kompleks mekanisme av ARNT funksjon og AHR-mediert transrepression av ER-signalering enn tidligere foreslått. Den kliniske nytten av disse funnene gjenstår å bli testet, og vil bli gjenstand for fremtidige undersøkelser.
Materialer og metoder
Materialer og cellekultur
3 «, 4» dimetoksy-α-naphthoflavone (DiMNF) ble oppnådd kommersielt (Indofine Chemical Co., Hillsborough, NJ). ECC-1 og MCF7-celler (ATCC) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; BioWhittaker, Lonza,) med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, PerBio, Thermo Fisher Scientific Inc.) og supplert med 100 enheter /ml kalium-penicillin-100 ug /ml streptomycin sulfat (BioWhittaker, Lonza) ved 37 ° C, 20% O
2, og 5% CO
2. Tjuefire timer før noen eksperimentell forstyrrelse ble cellene vasket 2 x med PBS, og vedlikeholdes i Fenol-Red-frie medier uten FBS [46].
Chromatin immunoutfellingsstudier analyser.
Kromatin immunoprecipitation (chip) analyser ble utført som beskrevet av tidligere [17]. I korthet ble cellene sådd ut i 150 cm
2 retter og serum-sultet 24 timer før behandling. Behandling av celler ble utført i serum-fritt media supplementert med 3 mg /ml bovint serumalbumin i 45 min. Kromatin komplekser var kjemisk tverrbundet ved hjelp av en 1% formaldehyd /0.7 mol /L HEPES-løsning (sluttkonsentrasjon), pH 7,8, og kompleksene ble ultralydbehandlet for å gi DNA-fragmenter av 200-900 bp størrelse. Komplekser ble forbehandlet med protein A-agarose-harpiks (Calbiochem) og inkubert over natten med spesifikke antistoffer [ERα kanin polyklonale eller ARNT geit polyklonale (Santa Cruz) eller AHR kanin polyklonale beskrevet tidligere [47]. Immunoadsorbed komplekser ble tatt opp på protein A-agarose Harpiksen og vasket to ganger med 0,5 x RIPA, etterfulgt av tre vaskinger med 10 mmol /liter Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mmol /L EDTA. Prøvene ble eluert ut av harpiksen med 100 mmol /l NaHCO3 og 1% SDS, og kryssbinder ble reversert ved 65 ° C over natten. Prøvene ble fenol-kloroform-ekstrahert og utfelt med 70% EtOH og Pellet Paint (Novagen). Immuno-adsorberte DNA ble analysert ved PCR. Primere for
CYP1A1
enhancer og PS2-arrangøren har blitt beskrevet tidligere [20], [48].
Transient transfections
MCF7 og ECC-1 celler ble dyrket i betingelser som er beskrevet ovenfor inntil omtrent 70% sammenflytende før siRNA transfeksjon. Cellene ble transfektert med enten grønn fluorescens protein (GFP) siRNA (Dharmacon), egge (SCX) siRNA (DS Egge negativ kontroll siRNA, Integrated DNA Technologies Inc.), AHR sirnas (Dharmacon) eller ARNT sirnas (Integrated DNA Technologies Inc., . Cat No. HSC.RNAI.N187426.11.1, HSC.RNAI.N178426.11.2, HSC.RNAI.N178426.11.3, siARNT 1, siARNT to, og siARNT 3 henholdsvis). Cellene ble transfektert med 10-15 nM siRNA bruker 0,3% (v /v) Trifectin (Integrated DNA Technologies) i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble inkubert i transfeksjon blandingen i 6 timer ved 37 ° C, og 5% CO
2, hvoretter blandingen transfeksjon ble fjernet og erstattet med serumfritt medium.
Revers transkripsjon og Real- Time PCR
Revers transkripsjon og real-time PCR ble utført som beskrevet tidligere [11]. I korte trekk ble celler behandlet med enten DMSO (Me
2SO), TCDD (2 nM), E2 (10 nM), eller en kombinasjon av TCDD og E2, i 24 timer.
