Abstract
Om lag 3-7% av ikke-småcellet lungekreft havn en anaplastic lymfom kinase (
ALK
) genet fusjon, utgjør en ny molekylær subtype av lungekreft som reagerer på crizotinib, en
ALK
inhibitor. Selv om tidligere studier har evaluert
ALK
-rearranged lungekreft, har omfattende analyse av lungekreft i kinesisk ikke godt vurdert. Heri, identifiserte vi 44 tilfeller av
ALK
-rearranged prøver ved fluorescerende in situ hybridisering (FISH), immunohistokjemi (IHC), og revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) i et stort antall kirurgisk reseksjon lungekrefttilfellene. Alle 44
ALK
-rearranged lungekrefttilfellene var adenokarsinomer, med 2 tilfeller ha flere knutepunkter plateepitel komponenter. Målet var å analysere clinicopathological funksjonene til
ALK
-rearranged lunge adenokarsinomer. Våre data viste at en cribriform struktur, fremtredende ekstracellulært slim og alle typer slimete celle mønster kan enten være sensitiv eller spesifikk å forutsi en
ALK
omorganisering. Vi brukte FISH som standardpåvisningsmetoden. Vi sammenlignet
ALK
omorganisering nøyaktigheten av FISH, RT-PCR og IHC. RT-PCR kan definere både
ALK
fusjonspartner og fusion variant, men virket ute av stand til å oppdage alle trans involverer
ALK
genet. Det er bemerkelsesverdig at IHC ved hjelp av D5F3-antistoff (Cell Signaling Technology) viste høyere følsomhet og spesifisitet enn Alk1-antistoff (Dako). Derfor konkluderer vi med at IHC fortsatt en kostnadseffektiv og effektiv teknikk for å diagnostisere
ALK
rearrangements og at D5F3 kan være den optimale screening antistoff i klinisk praksis
Citation. Li Y, Pan Y Wang R, Sun Y, Hu H, Shen X, et al. (2013)
ALK
-Rearranged Lung Cancer in Chinese: en helhetlig vurdering av Clinicopathology, IHC, FISH og RT-PCR. PLoS ONE 8 (7): e69016. doi: 10,1371 /journal.pone.0069016
Redaktør: Giuseppe Viglietto, UNIVERSITY Magna Graecia, Italia
mottatt: 15 februar 2013; Godkjent: 11 juni 2013; Publisert: 26.07.2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Natural Science Foundation of China (81101761, 81172218); Key Construction Program av National «985» Project (985-YFX0102) URL: https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i verden. Den kliniske viktighet av den molekylære fenotype av lungekreft ligger hovedsakelig i sin terapeutiske implikasjoner siden forskjellige subtyper kan svare på forskjellige mål behandlinger. En fusjon genet som tiltrer echinoderm microtubule-assosiert protein-lignende 4 (
EML4
) genet med anaplastisk lymfom kinase (
ALK
) genet ble funnet i en undergruppe av ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLCs) i 2007 [1]. Dette fusjon oppstått på grunn av kromosom inversjon eller trans på kromosom 2p, noe som resulterer i dannelsen av
EML4-ALK
fusjonsgenet. Til tross for den relativt lave frekvensen av
EML4-ALK
fusion,
ALK
-rearranged lungekreft er en unik molekylær undergruppe med høy følsomhet for ALK-hemmere, og er gjensidig utelukkende fra andre vel- kjente onkogene mutasjoner som involverer EGFR eller KRAS [2] – [5]. For bedre å forstå
ALK
-rearranged lungekrefttilfellene, er det viktig å karakterisere sine clinicopathologic funksjoner. Resultatene av detaljerte clinicopathologic analyser har variert. I vår studie ble 572 lunge adenokarsinomer delt inn i
ALK
-rearranged, vanlig driver mutasjon, og pan-negative grupper i henhold til mutasjonsstatus. Vi sammenlignet clinicopathological funksjonene til
ALK
-positivt gruppe med felles driver mutasjon, og med pan-negative gruppe, som søker å vurdere om det var karakteristiske clinicopathological funksjoner knyttet til
ALK
omorganisering kohort.
ALK
-rearranged lungekreft kan identifiseres ved IHC, FISH, eller RT-PCR med hver metode har fordeler og ulemper for screening. Nåværende klinisk utprøving av crizotinib bruk FISH som diagnostisk test [6]. Imidlertid krever FISH spesialiserte tekniske ressurser og kompetanse, og signalene raskt svekkes over tid. Videre kostnadene ved FISH analysen begrenser sin søknad om screening i klinisk praksis. RT-PCR kopling direkte sekvensering er blitt brukt for å identifisere kjente fusjons varianter, men kan gå glipp av ukjente varianter. IHC er relativt billig, raskere, og utføres rutinemessig på formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev. Men resultatene av ALK IHC testing i lungekreft gjenstår å være utilfredsstilt på grunn av forholdsvis lav sensitivitet eller spesifisitet, og fravær av en ideell antistoff. Nå er den svært følsomme ALK monoklonalt antistoff, D5F3 kan gjenkjenne epitoper innenfor ALK protein av alle kjente fusjoner. IHC er lett tilgjengelig i rutine patologi praksis og test koster bare ett- tjuedel av FISH test i Kina. Derfor har dette IHC analyse løftet om å være kostnadseffektive og en rask screening metode [7]. Men nøyaktigheten og følsomheten til D5F3 antistoff ikke blitt grundig testet. Vi sammenlignet samstemmighet blant IHC, FISH og RT-PCR for å bestemme optimal screening metoden. Fisk er den mest nøyaktige metoden og RT-PCR kan definere fleste ALK fusjons varianter, men kan ikke oppdage alle ALK trans. Vi fant at IHC med D5F3 monoklonalt antistoff viste både høy sensitivitet og spesifisitet (91% og 98%, henholdsvis) og således kan være rutinemessig anvendelse i klinisk praksis.
Materialer og metoder
Case markering
totalt 572 frosne lunge adenokarsinom vevsprøver og tilhørende parafininnstøpte tumorvev ble oppnådd ved Fudan University i Shanghai Cancer Centre fra oktober 2007 til juni 2011, med skriftlig informert samtykke fra alle pasienter. All forskning som omfatter mennesker deltakere i denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Shanghai Cancer sykehus (shanghai kreftsenter), Fudan University, Kina. Vi har tidligere vist at 90% av lungekreft adenokarsinomer fra aldri-røykere næret gjensidig utelukkende onkogene mutasjoner på bare fire gener (
EGFR
,
KRAS
,
HER2 Hotell og ALK) [ ,,,0],8]. I studien, hadde vi tatt med 527 lunge adenokarsinomer uavhengig av røykestatus i tillegg til de 45 svulster (41
EGFR
, 3
EML4-ALK
fusjoner og en
KRAS
) tidligere publisert [8]. Det var 411 av 572 prøver som næret kjente mutasjoner, inkludert 361
EGFR
, 40
KRAS Hotell og 10
BRAF
svulster, mens 161 av 572 prøver ikke havn noen av de ovennevnte mutasjoner. For påvisning av
EML4-ALK
fusjoner, ble primere laget for å forsterke alle kjente fusjons varianter, ved hjelp av cDNA, som beskrevet tidligere [9]. Ifølge mutasjonsstatus, ble 572 lunge adenokarsinomer delt i tre grupper. Det var 44 tilfeller identifisert som ALK omorganisering av fisk og gruppert som
ALK
-positivt. Det var 411 saker som næret kjente onkogene mutasjoner (361
EGFR
, 40
KRAS Hotell og 10
BRAF
) identifisert ved RT-PCR og gruppert som vanlige driv mutasjoner . Det var 117 tilfeller som ikke havna noen av de ovennevnte mutasjonen og ble derfor gruppert som pan-negative. Clinicopathological data samlet inn for analyser inkludert alder, kjønn, tumorstørrelse, røyking historie, pleural invasjon, lymfeknute status og patologisk stadium. For hvert tilfelle ble flere lysbilder som tilsvarer hele vevssnitt anmeldt av to patologer og klassifisert i henhold til gjeldende IASLC /ATS /ERS klassifisering [10]. Alle svulstene ble gradert av mønsterbasert karaktersystem foreslått av Sica i klasse I, klasse II, eller klasse III. Grade jeg, en lepidic dominerende mønster; Grade II, en acinar, papillær eller mucinous dominerende mønster; og Grade III, et fast stoff, micropapillary eller cribriform mønster [11]. Saker med forskjellene mellom lesere ble revurdert og en konsensus tolkning ble gjengitt.
RT-PCR og mutasjonsanalyser
Det var 572 tilfeller utsatt for RT-PCR. Frosne vev ble grovt deles opp i TRIZOL (Invitrogen Inc.) for RNA ekstraksjon følgende standardprotokoller. Total RNA prøver ble reverstranskribert inn i enkelt-trådet cDNA ved bruk av RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, EU). Mutasjonsstatus av
EGFR
(eksoner 18-22),
KRAS
(eksoner 2 til 3) og
BRAF
(eksoner 11 til 15) ble hentet med standard RT- PCR og kombinert direkte sekvensering. For påvisning av
EML4-ALK
fusjoner, ble primere laget for å forsterke alle kjente varianter fusjon ved å bruke cDNA, som beskrevet tidligere [8], [9]. Termin primere inkludert
EML4
E2F (5′-TGATGTTTTGAGGCGTCTTG-3 «),
EML4
E13F (5′-AGATCGCCTGTCAGCTCTTG-3′),
EML4
E18F (5 « -TTAGCATTCTTGGGGAATGG-3 «), og revers primer
ALK
E20R (5′-TGCCAGCAAAGCAGTAGT TG-3′). Multipleks PCR-analyse ble utført med KOD pluss DNA-polymerase (Toyobo, Osaka, Japan), med følgende program: 94 ° C 5 minutter; 94 ° C i 30 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder, 68 ° C 1 minutt, 35 sykluser; 68 ° C 10 minutter. PCR produktene ble direkte sekvensert i forover og bakover. Alle mutasjoner ble bekreftet ved analyse av en uavhengig PCR-isolat. PCR produktene ble direkte sekvensert i forover og bakover. Alle mutasjoner ble verifisert ved analyse av en uavhengig PCR isolat.
Fluorescens in situ hybridisering
ALK
-rearranged lungekreft er en molekylær undergruppe og gjensidig utelukkende fra andre mutasjoner slike som
EGFR
,
KRAS Hotell og
BRAF
. De 161 tilfellene som ikke bærer på noen av de ovennevnte mutasjonene ble utsatt for fisk. FISH ble utført på formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) eksemplarer med en kommersielt tilgjengelig break-apart sonde spesifikk for
ALK
genet (Vysis LSI ALK Dual Color, break-apart omorganisering sonde; Abbott Molecular, Abbott Park, IL) i henhold til produsentens instruksjoner. Proben hybridiserte til bandet 2p23, på hver sin side av ALK-genet stoppunkt. 5′-ALK signal ble merket med spektrum Grønn (grønn), og den 3 «
ALK
signal ble merket med spektrum Orange (oransje). 4, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) II ble søkt om kjerner kontra. Signaler for hver sonde ble evaluert under mikroskop utstyrt med trippel-pass filter (DAPI /Grønn /Orange; Abbott Molecular) og olje nedsenking objektiv. FISH-positive saker ble definert som to positive
ALK
omorganisering mønstre. Den ene var break-apart mønster med en fusjon signal og to separerte oransje og grønne signaler. Avstanden mellom to adskilte signaler ble beregnet ved hjelp av dobbelt så stor som den største signal størrelse. En annen definisjon var et isolert rød signalmønster med en fusjon signal og en rød signal uten en tilsvarende grønt signal. Positive tilfeller ble definert som mer enn 15% break-apart signaler eller isolerte røde signal signaler i 50 tumorceller. FISH-negative saker ble definert som de presenterer overlapping av røde og grønne signaler (gulaktig) i kreftceller, noe som indikerer at
ALK
ble ikke omdisponeres.
Immunohistochemistry
Det var 161 saker som ikke bærer på noen av ovennevnte mutasjoner. Disse ble utsatt for D5F3, alk 1, p63 og TTF-en IHC. IHC ble utført på 4 mikrometer tykke FFPE- seksjoner. Objektglassene ble forbehandlet med deparaffinized og 1 mmol /L EDTA og varme-mediert antigen henting løsning i en mikrobølgeovn. Ytterligere trinn ble utført ved romtemperatur i en hydratisert kammer. Glass ble preinkubert i 20% normalt geiteserum. ALK (D5F3) XP Rabbit monoklonalt antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), mus monoklonalt antihuman alk 1 (Dako) på 1:10 fortynning i Dako fortynningsmiddel, p63 (1:400, 4A4, DAKO), og TTF-1 ( 1:100, ble 8G7G3 /1, DAKO) brukt. Objektglassene ble deretter vasket i Tris-HCl og påvist med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin EnVision + kit (Dako). Alle lysbildene ble kontra med hematoksylin.
Cytoplasmatiske farging ble ansett som positivt for D5F3 og alk 1. Dette gjenkjenner epitoper innenfor ALK protein som er bevart i alle kjente ALK fusjoner. IHC farging ble scoret som følger: 0 (ingen flekker); 1 (svak, cytoplasma farging); 2 (moderat, jevn cytoplasma farging); 3 (intens, granulært, cytoplasmatisk farge) i mer enn 10% av tumorcellene. Skåring ble utført av to patologer. Nuclear farging av tumorceller ble ansett positiv for TTF-en og p63.
Statistisk analyse
sammenslutninger av lunge adenokarsinomer med
ALK
-positivt og felles driver mutasjon eller panne -negativ gruppe med kliniske egenskaper ble vurdert ved hjelp av Chi-square (for kategoriske data) og Wilcoxon rank-sum (for kontinuerlige data) tester.
p
verdier basert på en tosidig hypotese.
p
verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Kliniske funksjoner i
ALK
-rearranged lungekreft
572 kirurgisk resected stadium i-IV lunge adenokarsinomer pasientene var alle fra Kina, deres alder som spenner fra 22 til 84 år, med et gjennomsnitt på 59 år. Pasientene ble sammensatt av 215 menn og 357 kvinner. Tumordiametere varierte 0,5 til 11 cm. Patologiske trinn var I, 285 og II-IV på 287 pasienter. Ifølge mutasjonsstatus, ble 572 pasienter delt inn i tre grupper, som heter
ALK
-positivt gruppe (44 tilfeller), vanlig driver mutasjon gruppe (411 tilfeller) og pan-negative gruppen (117 tilfeller). I alle
ALK
-positive tilfeller ingen samtidige aktiverende mutasjoner i
EGFR
,
KRAS Hotell og
BRAF
ble oppdaget. Vi sammenlignet clinicopathological funksjonene til
ALK
-positivt gruppe med felles driver mutasjon og pan-negative grupper. Av tilfellene med kliniske data,
ALK
-positivt lungekrefttilfellene ble assosiert med yngre alder sammenlignet med den vanlige sjåføren mutasjon gruppe (
p
= 0,023, Tabell 1), men alder på
ALK
-positivt gruppe var ikke signifikant forskjell fra den pan-negative gruppen (
p
= 0,83, tabell 1).
ALK
-positivt gruppen ble assosiert med nei-smoking historie sammenlignet med pan-negative pasienter (
p
0,001, Tabell 1), mens
ALK Anmeldelser – positiv gruppe viste ingen betydning forskjell sammenlignet med det felles driver mutasjon gruppe (
p
= 0,828, tabell 1). Selv
ALK
-rearranged pasientene viste en tendens til assosiasjon med positive lymfeknuter status og høyere stadium i tidligere rapporter [12], [13], vår
ALK
-positivt gruppe hadde ingen betydning forskjell fra de 2 andre gruppene. Kliniske kjennetegn ved
ALK
-positivt gruppe, felles driver mutasjon gruppe, og pan-negative gruppen er oppsummert i tabell 1.
patologiske funn av
ALK
-rearranged lungekreft
Tabell 1 oppsummerer de patologiske trekk ved alle 44 tilfellene. Alle 44 var adenokarsinomer og 2 hadde flere knutepunkter plateepitel komponenter (utgjør 10% av tumorvolumet). Ifølge mønsterbasert karaktersystem, var det ingen forskjeller i tumor grad mellom
ALK
-positivt, vanlig driver mutasjon eller pan-negative grupper (
p
= 0,59 og
p
= 0,344, henholdsvis). Ifølge overvekt subtyper basert på IASLC /ATS /ERS klassifisering, vår
ALK
-positivt gruppen hadde ulike dominerende undergrupper: acinar 15 tilfeller (34,09%), solide 19 tilfeller (43,18%), lepidic en sak (2,27%), papillær 6 tilfeller (13,64%), micropapillary en case (2,27%, figur 1A), mucinkjertler 2 tilfeller (4,55%).
ALK
-positivt svulster var signifikant assosiert med solid-og acinar- dominerende mønstre sammenlignet med vanlig driver mutant adenokarsinomer (
p
0,0001 og
p
= 0,013, henholdsvis), mens ikke signifikant assosiert med andre overveiende histologiske mønstre. I tillegg
ALK
-positivt svulster ble ikke signifikant assosiert med noen dominerende histologiske mønstre sammenlignet med pan-negative adenokarsinomer
(A) papillær og micropapillary mønstre.; (B) mucinous cribriform mønster bestående av rikelig ekstracellulære slim og cribriform strukturer; (C) fast mønster med signetringceller; (D) mucinous cribriform mønster ofte flytende innenfor slim fylte alveolarområdene; (E) slimete celler i form av slimceller; (F) fast mønster med hepatoid kreftceller som har rikelig eosinofil cytoplasma, runde kjerner, og fremtredende nukleoli; de tumorcellekjernene er relativt monomorfe.
ALK
-positive svulster ble også assosiert med forskjellige morfologiske egenskaper. Av de 44 svulster, 52,27% (23/44) viste en cribriform mønster (figur 1B), enten fokal eller diffus. I kontrast, bare 20 av 411 felles driver mutant (
p
0,001) og 34 av 117 pan-negative tumorer hadde en cribriform mønster (
p
= 0,006). Det var 29,55% (13/44) av
ALK
-positivt men bare 2% (8/411) av felles driver muterte tumorer (
p
0,001) som hadde minst noen graden av signetring celler (figur 1C). Signet-ring celler var assosiert med en solid dominerende mønster i 11
ALK
-positive svulster, en acinar mønster i en, og begge acinar og faste mønstre i ett. Forholdet mellom signet-ring-celler til å summere tumorceller varieres, med et område på 5 til 80 prosent. Interessant,
ALK
-positivt svulster ble ikke signifikant assosiert med signet-ring celler mønster sammenlignet med pan-negative tumorer, som viser at signet-ringemønster kan være observert i andre sjeldne onkogene mutant lungekreft. Også funnet var fremtredende ekstracellulært slim og alle typer slimete celler var betydelig mer vanlig i
ALK
-positive tumorer (P 0,0001) sammenlignet med de andre to gruppe (
p
0,001 ). I 22 tilfeller (50%) var det fremtredende ekstracellulære slim, med slim ekspandere inn alveolarområdene på svulsten periferien (figur 1D). Enhver type mukøse celler ble funnet i 26 tilfeller (59,09%), og hadde forskjellige mønster, men de ble funnet oftest i en fast eller acinar mønster. Slimete cellene ble oftest signet-ring og søyleslimtyper (figur 1E). I 2 mucinkjertler tilfeller slimceller økt i antall acinar og lepidic mønstre. I 11 (25%) tilfeller var det minst et samlings befolkning på hepatoid tumorceller med rikelig eosinofil cytoplasma, runde kjerner, og fremtredende nucleoli i et overveiende fast mønster (figur 1F). I tillegg ingen enkelt histologisk mønsteret var helt sensitiv eller spesifikk å forutsi
ALK
omorganisering, og også tilfeller med signet-ring celle eller cribriform mønstre kan være til stede i de andre 2 gruppene. I alle
ALK
-positive tilfeller, tumorcellekjernene var relativt monomorf (figur 1F), bortsett fra to tilfeller som viser fokale områder av pleomorphism. Av de 44, 40 var TTF-1 positive, mens i 6, foci av adenokarsinom co-uttrykt TTF-en og p63.
EML4-ALK fusion variant deteksjon av multipleks RT-PCR og sekvensering i frossen materiale
Vi undersøkte tilstedeværelsen av
EML4-ALK
fusion variant i 161 saker som ikke harbor
EGFR
,
KRAS Hotell og
BRAF
av RT-PCR. Vi identifiserte 38 tilfeller av
EML4-ALK
fusion variant av RT-PCR.
EML4-ALK
variant 1 ble påvist i 19 prøver. Fem tilfeller var variant 2, 7 tilfeller var variant 3a /3b og en var V3b, E17; A20, ins E17 65; A20, ins E17b 39; A20 E10a /b, E13; A20, E6a /b ins 18; A20 og E6a; A19 hver (Tabell 2). Fusions ble bekreftet ved direkte sekvensering.
ALK
rearrangements deteksjon av FISH
Det var 161 saker ble utsatt for ALK FISH. ALK omorganisering er vanligvis definert ved delt grønne og oransje signaler som ligger minst to ganger tider av høyeste signal størrelse. Det var 44 tilfeller positive som er identifisert av fisk. Vanligvis ble to forskjellige delinger i røde og grønne signaler bemerket 38 tilfeller (tabell 2, figur 2A). Seks av FISH-positive saker ble preget av tapet av en grønn signal (figur 2B). Tre av disse 6 tilfeller var to variant 1 tilfeller, en variant 3b sak og tre negative saker. Seks RT-PCR negative tilfeller var positive med FISH. To tilfeller av sameksistens av både adenokarsinom og samlings plateepitelkarsinom demonstrert FISH-positive signal å være til stede bare i adenokarsinom komponent.
(A) To forskjellige røde og grønne signaler. (B) Isolert rødt signal.
ALK rearrangements deteksjon ved IHC ved bruk alk 1 og D5F3 antistoff
ALK IHC testing i lungekreft er fortsatt utfordrende på grunn av den relativt lave uttrykk for ALK protein, med mange resultater som viser at dette er tilfelle ved bruk av alk 1 antistoff. For å avgjøre om IHC bruker D5F3 antistoff kan bli bedre, vi evaluert både i 161 tilfeller. Alk1 antistoff ekspresjon ble påvist i 32, noe som resulterer i IHC-score av en (n = 14), 2 (n = 14), og 3 (n = 4), mens 28 pasienter som var FISH-positive (tabell 2). Vi observerte at alle IHC 0 tilfeller var FISH-negative, alt IHC 3+ og 2+ tilfeller var FISH-positive, 4 IHC 1+ tilfeller var FISH-negative, og 10 IHC 1+ tilfeller var FISH-positive. Blant de 32 Alk1 IHC-positive tilfeller, bare fire IHC 3+ oppviste en sterk cytoplasmatisk fargeintensitet, observert hos 20% til 100% av positive celler (gjennomsnittlig poengsum på 60%). IHC1 + og 2 + saker ble bare observert i 10% til 50% av positive celler (gjennomsnittlig score på 30%) (Tall 3B, 3D, 3F)
Case 1:. (A) score 3+ viser intense kornet cytoplasma farging med D5F3 antistoff; (B) score 1+ viser svak cytoplasma farging med alk 1; Tilfelle 2: (C) score 3+ viser intens kornet cytoplasma farging med D5F3; (D) score 2+ viser moderat, granulat cytoplasma farging med alk 1; Sak 3: (E) score 3+ viser intens kornet cytoplasma farging med D5F3; (F) score 1+ viser svak, knapt merkbar cytoplasma farging med alk 1.
I vår studie viste D5F3 IHC testen svært høy sensitivitet og spesifisitet for påvisning av ALK uttrykk. D5F3 immunopositivity ble identifisert i 41 tilfeller (figur 3A, 3C, 3E). Positiv farging ble funnet bare i den adenokarsinom komponenten av de 2 adenosquamous karsinomer. Blant 41 D5F3-positive tilfeller, 34 var 3+ stille sterke, cytoplasmatisk fargeintensitet, observert hos 60% til 100% av positive celler (gjennomsnittlig poengsum på 80%). Av de resterende 7 tilfeller, 2 tilfeller utstilt cytoplasma og kjernekraft positiv farging. Det var 4 IHC-positive som var 2+, som viser moderat cytoplasma flekker, og 3 IHC-positive tilfeller var 1+, viser svak cytoplasma farging. Ingen bakgrunn ble observert i stromale celler eller innenfor normal lunge. Sammenlignet immunoactivity av alk 1 antistoff, D5F3 viste mer intens farging av tumorceller. Den relative mengde av farging med D5F3 var også mye høyere. Derfor intensitetspoeng av D5F3 antistoffarging var høyere enn Alk1 antistoff (tabell 2). Interessant, D5F3 IHC resulterer i en sak illustrerer at heterogen flekker kan oppstå. Ett vevsblokk viste ingen farging til tross for gjentatt IHC testing, mens en annen blokk viste positiv farging. FISH-analyse bekreftet tilstedeværelsen av den genetiske abnormitet. Vi vurderte muligheten for at de ulike resultatene skyldes heterogenitet.
Sammenligning mellom IHC og RT-PCR
Det var 26 av 38 saker som ble RT-PCR-positive var alk 1 IHC-positive med de andre 12 sakene blir IHC negative. Følsomheten av Alk1 IHC for påvisning av ALK-omleiringen var således 68,4% (26 av 38) sammenlignet med RT-PCR. Imidlertid 36 38 RT-PCR-positive tilfeller var D5F3-positive (tabell 3). Således følsomhet av D5F3 var 94,7% (36 av 38) sammenlignet med RT-PCR (tabell 3). D5F3-positive tilfeller inkludert variant 1, 2, 3a /3b, 3b, E17; A20, ins E17 65; A20, ins E17b 39; A20, E10a /b, E13; A20, E6a /b ins 18; A20 og E6a; A19. To D5F3-negative tilfeller av 38 RT-PCR-positive tilfeller var en variant 3a /b og en E17b ins 39; A20 saken (tabell 2). Fem av 123 RT-PCR negative tilfellene var D5F3-positive.
Sammenligning mellom IHC og FISH
Det var 28 av 44 FISH-positive saker som var alk 1 IHC-positive, og 4 alk 1 IHC-positive saker som var FISH-negative. Den samlede sensitivitet og spesifisitet av det Alk1 IHC sammenlignet med fisk var 64% og 91%, respektivt. I motsetning til 40 av 44 FISH-positive tilfeller var D5F3-positive. Fire av 44 FISH-positive tilfeller var D5F3-negative. En FISH negativ sak var D5F3-positive. Samlet sensitivitet og spesifisitet av D5F3 sammenlignet med FISH var 91% og 98% (tabell 4).
Diskusjoner
Selv om
ALK
-rearranged lungekreft gjøre opp bare 5% til 7% av alle NSCLC tilfeller har de vist en imponerende respons til ALK-tyrosinkinase-inhibitor, crizotinib, og representerer et viktig terapeutisk underkategori. Tidligere studier har evaluert ALK omorganisering lungekreft, men omfattende analyse av
ALK
-rearranged lungekrefttilfellene i kinesisk har ikke godt vurdert. Vi identifiserte 44 tilfeller av
ALK
-rearranged tilfeller i 572 lungekrefttilfellene. I vår serie, disse svulstene manglet mutasjon av
EGFR, KRAS eller BRAF
, etter avtale med de tidligere observasjonene [14]. I tidligere rapporter, resultatet av detaljert clinicopathologic analyser av
ALK
-rearranged lungekrefttilfellene har variert. En grundig studie av clinicopathologic funksjonene i slike pasienter sammenlignet med de vanligste mutasjonene
EGFR Hotell og
KRAS
eller sjeldne ukjente mutasjoner er et voksende problem med klinisk interesse. Vi ønsket å sammenligne clincopathologic funksjonene til
ALK
-rearranged lungekreft med de vanlige driver mutasjoner og pan-negative tumorer
Våre hoved klinikk funnene i vår studie var som følger: (1).
ALK
-rearranged lungekrefttilfellene var hyppigere hos yngre pasienter sammenlignet med vanlig kjøring mutasjon gruppe (
p
= 0,023), i samsvar med tidligere studier [4], [15], mens det var ingen betydning forskjell sammenlignet med pasienter i pan-negativ gruppe (
p
= 0,83). (2)
ALK
-rearranged pasienter forbundet med røyking historie sammenlignet med pan-negative gruppen (
p
0,001), mens røyking historie
ALK Anmeldelser – omorganiseres pasienter var ikke forskjellig fra vanlig kjøring mutasjon gruppe (
p
= 0,828). (3) Det var ingen forskjeller i kjønn, tumorstørrelse, lymfeknutestatus, tumor grad eller stadium mellom
ALK
-positivt, vanlig driver mutasjon eller pan-negative grupper. Dette avviket kan være på grunn av lite antall tilfeller undersøkt i andre studier, eller annen eksperiment gruppering design, eller forskjeller i etnisitet. Derfor de kliniske kjennetegn alene er ikke tilstrekkelig til å velge enkeltsaker for videre testing for
ALK
omorganisering.
I vår studie, alle 44
ALK
-rearranged lungekrefttilfellene var adenokarsinomer, med 2 tilfeller ha flere knutepunkter plateepitel komponenter. Interessant, ikke i noen tilfelle var det
ALK
omorganisering stede i plateepitelkarsinom komponent, bekreftet av både fisk og IHC. Dette er i kontrast med en rapport der
ALK
omorganisering coexisted i begge komponenter [15]. Selv om de fleste
ALK
-rearranged lungekrefttilfellene er adenokarsinomer, andre histologiske typer bør ikke utelukke sin tilstedeværelse. I vår studie,
ALK
-rearranged svulster ble preget av en fast eller acinar vekstmønster og mangel på lepidic vekst. Sammenlignet med vanlige sjåfør mutasjon svulster, fast eller acinar-dominerende mønster, cribriform struktur, signet-ring celler, hepatoid utseende, fremtredende ekstracellulært slim, og noen form for slimceller ble alle signifikant assosiert med
ALK Anmeldelser – positive svulster. Dette er i samsvar med en tidligere rapport [13]. Sammenlignet med pan-negative tumorer, bare cribriform struktur, fremtredende ekstracellulære slim og alle typer slimete celler ble signifikant assosiert med
ALK
-positive lunge adenokarsinomer. Derfor våre data viste cribriform struktur, fremtredende ekstracellulære slim og alle typer slimete celler mønster er sensitiv og /eller bestemt til å forutsi
ALK
omorganisering. I de fleste
Alk-
omorganiseres svulster, svulst kjerner var relativt monomorfe, med unntak av 2 tilfeller som viser fokusområder pleomorphism. Disse tydelig morfologiske trekk
ALK
omorganisering svulster er i samsvar med tidligere rapporter fra både vestlige og asiatiske kohorter [15], [16] og kan være nyttig å velge saker for videre nøyaktig molekylær testing.
Selv p63 positivitet blir ofte brukt som en markør for plateepitelkarsinom i diagnostisk patologi, fant vi at noen
ALK
-rearranged svulster koekspresjon p63 og TTF1 i adenokarsinom komponent. Våre data er mye forskjellig fra en tidligere rapport som viste at mer enn halvparten av deres tumorer co-uttrykte TTF-1 og p63, og viser diffus farging av både [16]. Hvis p63 ble brukt som en plateepitelkarsinom markør for å lage en patologisk diagnose,
ALK
-rearranged svulster kan bli feildiagnostisert som adenosquamous cellekreft
Nøyaktig identifisering av
ALK
. – omar svulster krever en sensitiv og spesifikk testmetoden. For tiden eksisterer flere slike fremgangsmåter, slik som IHC, FISH, og RT-PCR. RT-PCR er egnet til å påvise
EML4-ALK
eller alternative fusjons transkripsjoner [14], men er ikke tilgjengelig i mange rutinemessige patologi avdelinger. I tillegg er de fleste av prøvene lagres som FFPE, i hvilket tilfelle RNA kan bli vesentlig redusert. Videre kan RT-PCR ikke oppdage alle trans involverer genet. FISH, ved hjelp av ALK break-apart sonde, var standard test for innmelding i en klinisk studie med crizotinib [6]. Men FISH testen er lav gjennomstrømning, så er ikke egnet til å påvise
ALK
rearrangements i storskala screening. IHC, derimot, er en lav pris, relativt enkel teknikk for screening og diagnostikk
ALK
-rearranged svulster i rutine kirurgisk patologi praksis, selv om noen ALK-antistoffer er rapportert å mangle spesifisitet og sensitivitet [4].
Vi har evaluert
EML4-ALK
fusjon varianter hjelp RT-PCR og identifisert som E13; A20 (variant 1), E6a /b; A20 (variant 3a /b), E20; A20 (variant 2) er de vanligste variantene. Denne frekvensen av fordelingen er ganske lik de som er rapportert [17]. I vår studie, 6 RT-PCR-negative tilfellene var FISH-positiv, noe som tyder på det nåværende andre ukjente varianter.
