Abstract
En potensiell strategi for diagnostisering av lungekreft, den ledende årsak til kreft relaterte dødsfall, er å identifisere metabolske signaturer (biomarkører) av sykdommen. Selv om data støtter hypotesen om at flyktige forbindelser kan påvises i pusten av lungekreftpasienter ved luktesansen eller gjennom Bioanalytical teknikker, er analyse av pusteprøver tungvint og teknisk utfordrende, og dermed begrense brukbarheten. Hypotesen utforsket her er at variasjoner i små molekylvekt flyktige organiske forbindelser ( «odoranter») i urinen kan brukes som biomarkører for lungekreft. For å demonstrere tilstedeværelse og kjemiske strukturer av flyktige biomarkører, studerte vi mus olfaktorisk styrt oppførsel og metabolomikk av flyktige bestanddeler av urin. Sensor mus kan trenes til å diskriminere mellom lukt av mus med og uten eksperimentelle tumorer som viser at flyktige dufter er tilstrekkelig til å identifisere tumorbærende mus. I samsvar med dette resultatet, kjemiske analyser av urin flyktige viste at mengdene av flere forbindelser var dramatisk forskjellig mellom tumor og kontrollmus. Ved hjelp av prinsipal komponent analyse og veiledet maskin-læring, vi nøyaktig diskriminert mellom tumor og kontrollgrupper, et resultat som ble kryss validert med nye testgruppene. Selv om det ikke ble delt forskjeller mellom eksperimentelle og kontrolldyr i de to tumormodeller, har vi også funnet kjemiske forskjeller mellom disse modellene, som viser tumor-baserte spesifisitet. Suksessen til disse studiene gir en roman proof-of-prinsippet demonstrasjon av lungetumor diagnose gjennom urin flyktige dufter. Dette arbeidet skal gi en drivkraft for lignende søk for flyktige diagnostiske biomarkører i urinen til humane lungekreftpasienter
Citation. Matsumura K, Opiekun M, Oka H, Vachani A, Albelda SM, Yamazaki K, et al . (2010) Urin flyktige forbindelser som biomarkører for lungekreft: En Proof of Principle Study Bruke Lukt signaturer i mus modeller av lungekreft. PLoS ONE 5 (1): e8819. doi: 10,1371 /journal.pone.0008819
Redaktør: Xiaoping Pan, East Carolina University, USA
mottatt: 15 august 2009; Godkjent: 16 desember 2009; Publisert: 27 januar 2010
Copyright: © 2009 Matsumura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Panasonic Corporation. Som angitt under konkurrerende interessen delen, en ansatt av Panasonic, Dr. H. Oka, hjalp unnfange den opprinnelige ideen og anmeldt manuskriptet. Ingen annen rolle i denne forskningen ble spilt av Dr. Oka og Panasonic
Konkurrerende interesser. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Panasonic Corporation. Forfatterne erklærer ingen andre konkurrerende interesser. Det er ingen patenter eller patenter basert på arbeidet, og det finnes ingen produkter som kommer fra arbeid under utvikling. Ingen av forfatterne, bortsett fra en medforfatter som er ansatt hos Panasonic (Dr. Oka), har noen økonomiske forhold som kan oppfattes som relevant inkludert lager eierskap, konsulentavtaler, eller reisestipend eller honorarer. Dr. Oka hjalp gravid av den opprinnelige ideen til dette arbeidet og gjennomgått manuskriptet, men de andre medforfatterne designet studien, utført det, analysert dataene og skrev manuskriptet.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall gjennom det meste av verden [1]. Den eneste behandling som som oppnår en høy grad av helbredelse er kirurgisk reseksjon av tidlig sykdom (før metastatisk spredning forekommer). Siden bare ca 25% av tilfellene er diagnostisert i en tidlig fase, er effektive tidlige diagnoseteknikker presserende behov.
Aggressiv og tidlig brystet avbildning av pasienter med høy risiko fremstår som den dominerende tilnærming til tidlig diagnose, selv om store studier å validere denne tilnærmingen er fortsatt pågående [2], [3], [4]. Dessverre, selv avbildning er ganske følsom, er det også forholdsvis ikke-spesifikk. Nyere studier har vist at mellom 5-26% av høyrisikopasienter røyk har detekterbare lunge knuter etter CT screening, men bare et gjennomsnitt på ca. 4% (med et område på 2-11%) av disse knuter er ondartet [5]. Tydelig kirurgisk reseksjon av alle disse knuter er hverken praktisk eller ønskelig. Tilnærminger for å finne ut hvilke knuter bør fjernes er dermed nødvendig. En attraktiv strategi ville være å kombinere et følsomt avbildningsteknikk med en biomarkør for lungekreft for å øke spesifisiteten [6], [7], [8]. Fordi forekomsten av lungekreft i denne «nodule befolkning» er betydelig høyere enn i nåværende eller tidligere røykere populasjoner, vil biomarkører i denne sammenheng ikke krever ekstremt høy følsomhet og spesifisitet som trengs for befolkningen screening. En annen bruk for en slik biomarkør kan være å følge løpet av svulsten etter behandling.
Med utviklingen av high-throughput teknikker for biomarkører [9], har feltet lungekreft biomarkører nylig utvidet betydelig. Nåværende biomarkør kandidater fra blod, spytt og urin omfatter mange klasser av molekyler, inkludert proteiner, tumorantigener, anti-tumor antistoffer, celletypespesifikke peptider, ulike stoffskifteprodukter, og epigenetiske fenomener som hyper-metylert DNA, RNA, og spesifikk genekspresjon [10]. Imidlertid har ingen biomarkør identifisert hittil vist seg å ha tilstrekkelig følsomhet, spesifisitet og reproduserbarhet for å bli betraktet som tilstrekkelig for anvendelse til å detektere og overvåke utvikling av lungekreft.
En annen klasse av biomarkører for lungekreft kan være liten molekylvekt flyktige organiske forbindelser. Disse molekylene, som kan oppfattes som lukt (spesielt etter dyr), har vist seg å fungere som «signaturer» som formidler sosiale, emosjonelle og helseinformasjon til andre medlemmer av arten [11]. Det kan være to kilder av flyktige markører i lungekreftpasienter. Studier har vist at lungekreft cellelinjer kan frigi spesifikke flyktige organiske forbindelser
in vitro product: [12]. Tilstedeværelsen av en voksende svulst kan også indusere spesifikke metabolske eller ernæringsmessige endringer som kan endre produksjon eller utslipp av slike forbindelser [6].
«flyktige hypotesen» for lungekreft har ført til en rekke studier undersøker nytten av å analysere disse forbindelser i utåndet pust enten ved hjelp av dyrene (for eksempel hunder) [13] eller sofistikerte biokjemiske teknikker [14], [15]. Noen av disse studiene har vist lovende. For eksempel, en nyere undersøkelse fra Chen gruppe [16] ved å bruke fastfase mikro-ekstraksjon etterfulgt av gasskromatografi viste at 1-butanol og 3-hydroksy-2-butanon ble funnet ved betydelig høyere konsentrasjoner i pusten av lungekreftpasienter sammen til kontrollene. Dragonieri et al. brukt en «elektronisk nese», og var i stand til å diskriminere pasienter med lungekreft kontra de med kronisk obstruktiv lungesykdom med relativt høy sensitivitet og spesifisitet [17].
Dessverre, innsamling, håndtering, lagring, konsentrere seg og analysere pusten prøvene er tungvint, teknisk krevende, og kan dermed ikke være lett å bruke mye. En delvis løsning på disse problemer ville være å bruke et mye mer passende kilde av flyktige forbindelser, slik som urinprøver selv om urin, som pust, vil omfatte ikke bare endogene flyktige forbindelser, men også de fra eksogene kilder som diett og miljø. I denne forbindelse, Willis et al. (2004) rapporterte at hundene kan trenes til å skille mellom pasienter med blærekreft på basis av urinlukt mer vellykket enn hva som ville forventes av en tilfeldighet alene [18]. Dessverre, en oppfølgingsstudie av Gordon ET1 al. [19] var ikke i stand til å reprodusere disse funnene i urinprøver fra pasienter med brystkreft og prostatakreft.
Basert på disse vurderingene, hypotesen utforsket i denne artikkelen er at variasjoner i liten molekylvekt flyktige organiske forbindelser ( «luktstoffer «) i urin kan brukes som biomarkører for lungekreft. En av de viktigste problemene i forsøk på å først identifisere flyktige biomarkører fra menneskelige pasienter er det store variasjoner som kan være på grunn av ukontrollerte variabler som genetiske og kostholdsforskjeller, personlig pleie bruk av produktet, og andre miljømessige variabler som kan påvirke kroppslukt flyktige stoffer. Observasjonen at hunder kan tilsynelatende filtrere ut disse potensielle distraksjoner og fokus på sykdommen signatur (se ovenfor) antyder at potensielt nyttige biomarkører kan eksistere.
I lys av disse utfordringene, har vi valgt å satse på en mer svært kontrollert dyr modellen tilnærming [20], [21] hvor mange av de variablene som gjør tålmodig arbeid så vanskelig kan kontrolleres (figur 1A). Vår strategi var å først vise at mus kan trenes til å diskriminere urinprøver fra mus med svulster fra kontrollmusene av lukt alene. Når vi hadde etablert dette var mulig, vi deretter ansatt metabolsk profilering (fast-fase-mikroekstraksjon, etterfulgt av gasskromatografi kombinert med massespektrometri) for å vise at vi kunne identifisere spesifikke mønstre av flyktige stoffer i urinen som kunne skille tumorbærende mus fra kontrolldyrene .
(A) oversikt over eksperimentell prosedyre. Vi ansatt mus lukte guidet atferd (til venstre) og metabolomic (til høyre) nærmer seg. (B) LKR-celler og LLC celler ble injisert subkutant inn i flankene av voksne mannlige mus og tumorstørrelse ble målt ukentlig deretter. Hver gang punkt viser middelverdi ± SEM tumorstørrelse. Heltrukken linje: faktiske data; Stiplet linje: kurven utstyrt med kubisk funksjon; LKR: y = 0,092 * x
3 til 2,8 * x
2 + 38 * x – 18, LLC: y = 0,16 * x
3 til 0,83 * x
2 + 3,5 * x – 4. Mouse urin ble samlet individuelt gang om dagen og ble brukt for kjemisk analyse og for bioassay i periodene angitt: for LKR – Days 15-24 og 25-37 for trening og Days 2-7, 9-14, 15-20 , og 25-37 for generalisering; For Advisor – Days 17-26 for trening og Days 1-8, 9-16 og 17-26 for generalisering. (C) Box plot av generaliserings score for bioassay og sammenhengene mellom testene. Blå boksene representerer nedre og øvre kvartil. Den røde horisontale linjen i hver boks angir medianen. Den stiplede linje representerer omfanget av observasjoner. Pluss (+) markerer ekstreme uteligger observasjoner. *;
P
0,01, **;
P
0,001, ***;
P
0,0001 i forhold til nullhypotesen av en 50% generalisering poengsum. Fra venstre, LKR trente mus urin generalisering til LKR mus urin (Trening 1, figur 1C-i); LKR- trent mus urin generalisering til LKR mus urin (Trening 2, figur 1C-ii); Advisor-trente mus urin generalisering til LLC mus urin (figur 1C-iii); LKR trente mus urin generalisering til LLC mus urin (figur 1C-iv); Advisor-trente mus urin generalisering til LKR mus urin (figur 1C-v).
Resultater
Mus modeller av Lung Cancer
lungesvulster avledet fra mus celle linjer har likheter i morfologi, histopatologi, og molekylære karakteristika med humane lunge adenokarsinomer og kan tjene som nyttige første modellene [22]. Vi brukte to mus lunge kreft cellelinjer, LKR som ble avledet fra en transgene dyr som uttrykker mutert Kras og LLC, Lewis lunge cell carcinoma som oppsto spontant. -Tumorer ble indusert ved å inokulere hver av disse cellelinjene inn i forskjellige grupper av mus (kontroll-mus ble injisert med kjøretøyet, saltvann, etter samme tidsplan). De tumorvekstkurver for disse to cellelinjene viste lignende mønstre (figur 1B). Basert på tumorvekstkurver, samlet vi urinprøver som spredte stadier av tumorvekst for bioassay og for senere kjemiske analyser.
Olfactory Påvisning av urin Lukt
Vi trente sensor mus (se metoder) for å diskriminere mellom lukt av mus urinprøver samlet inn fra LKR-injisert mus med store svulster (Dager 25-37 innlegget celle injeksjon) i forhold til genetisk identiske kontroll mus uten svulster. Når dette var vellykket, testet vi for å finne ut om denne læringen generaliseres til tidligere stadier av svulst utvikling. Som vist i figur 1C-i, trente mus vellykket distingverte mellom urinprøver innsamlet fra mus med svulster på 25-37, 15-20 og 9-14 dager etter injeksjon, men ikke generalisere til svulster på svært tidlige stadier (dager 1-7 ). Neste, vi videre trent de samme sensor mus ved bruk urin samlet på Days 15-24 etter injeksjon. Selv om disse musene generalisert denne opplæringen til nye prøver fra mus med svulster i samme størrelse, gjorde de ikke gjøre det for urinen samlet på Days 9-14 eller 1-7 (figur 1C-ii). Kontroll eksperimenter bekreftet at trent mus ikke skille mellom injisert og uninjected mus før injeksjoner, som viser at det ikke var noen skjevhet i den opprinnelige mus urin eller Y-labyrint apparat.
For å undersøke generelle i dette resultatet, vi trent en egen gruppe av sensor mus å diskriminere urin med mus med- og uten Advisor-induserte svulster. Mønsteret av resultatene var nesten identisk med den som med LKR-induserte tumorer (figur 1C-iii).
neste spurte om lukt forbundet med LKR og LLC svulster var perceptually lignende, ved å teste de trente mus på urinprøver samlet inn fra tumorbærende vs. kontroll mus fra dyremodell forskjellig fra den som de hadde blitt trent på. Det vil si, vi spurte om mus opplært til å diskriminere urin med mus med og uten LKR-induserte svulster ville anerkjenne (generalisere dette som svar på) LLC tumorbærende mus og vice versa. Svaret var bekreftende (figur 1C-VI og v). Disse resultatene viser at svulster forårsaket av disse kreftcellelinjer produsere vanlige. (Selv om ikke identisk, se nedenfor) flyktige biomarkører som kan gjenkjennes ved olfactory systemer av mus
Karakterisering av Urin flyktige forbindelser
Vi karakterisert ved siden av arten av kjemisk variasjon skille mus med svulster fra dem uten ved å analysere urin flyktige forbindelser med fast-fase-mikroekstraksjon, etterfulgt av gasskromatografi kombinert med massespektrometri. Fra de typiske totale ionekromatogrammer (tics) en stor variert sett av toppene kan skilles (figur S1). Førti sju toppene ble valgt for identifikasjon fra tics basert på at de har tilstrekkelig store topphøyder og ikke-overlappende tics som bestemt ved visuell inspeksjon. Som man kan se i tabell 1, og S1, ble toppene består av en rekke kjemiske strukturer og er potensielt er involvert i en rekke biologiske funksjoner, for eksempel i pheromonal kommunikasjon (2-heptanon, 3,4-dehydro-
ekso
-brevicomin og 2-
sek
-butyl-4,5-dihydrotiazol, 6-hydroksy-6-metyl-3-heptanon,
β
-farnesene [23]). Også identifisert var forbindelser som tidligere er rapportert i human urin (nitrometan, dimethyl sulfone,
o
-toluidine, 2-etylheksansyre [24]).
neste brukte kvantitative analyser av disse 47 topper for å bestemme om mus med og uten eksperimentelt-induserte tumorer kan skilles. Variasjon i den rå topphøyder viste tydelig forskjeller i de relative mengder av forskjellige forbindelser basert på tilstedeværelse eller fravær av tumor og krefttyper (Figur 2A og figur S2). Vi observerte relativt konsistente endringer for mange topper og for begge kreft grupper med det vanligste mønsteret er en redusert produksjon (nedregulering) i tumorgrupper og enten en økt produksjon (oppregulering) eller ubetydelig endring i placebogruppen (figur S3). For eksempel, topp 13 (5-hepeten-2-on) ble nedregulert dramatisk som en konsekvens av tumor nærvær (figur 2B). Således kan en generell nedregulering av flyktige forbindelser være et vanlig trekk ved tumorvekst. Men det var andre endringsmønstre for et mindretall av flyktige forbindelser. For eksempel, ble produksjonen av topp 37 (2-etylheksansyre) forhøyet i begge tumor grupper. Endringer i andre topper avhengig av krefttyper (og /eller mus belastning). Peak 29 (acetophenone) var nedregulering i LKR-tumor gruppe og oppregulering i Advisor-tumor gruppe, mens topp 33 var nedregule bare i LKR tumor gruppe. Bildet rekke plott (figur 2C) viser tydelig den samlede ulike effekter av tumorvekst.
(A) Sammenligning mellom tidlig og sent stadium av 4 illustrerende topper valgt fra 47 topper analysert. Vertikale aksen indikerer intensitet (mengde) av TIC; vertikale linjer rundt middelverdien indikerer SEM ved hver prøvetaking. Blå betegner tidlig stadium, mens rød representerer sent stadium. Horisontalaksen indikerer retensjonstid. (B) Bar tomt på intensitet av 4 illustrerende topper valgt fra de 47 toppene analysert. Gjennomsnittlig maksimal intensitet er plottet på hver topp. Røde søylene representerer kreft grupper; Nedbørssøylene representerer kontrollgrupper. En blek blå bakgrunn viser en betydelig forskjell på
P
0,0001 mellom tumor og kontrollgrupper. (C) Rå intensiteten av 47 analyserte topper erholdt ved å subtrahere den første perioden fra den senere tid (n = 25 for hver av de 4 grupper). Mørkere grå betyr peak økt følgende tumorutvikling, mens den lysere grå betyr peak redusert følgende tumorutvikling.
Diskriminering av Tumor og placebogruppene
neste satte å metabolomic profilering til statistisk diskriminere mellom gruppene, og for å identifisere karakteristiske topper. For å oppnå dette kombinert vi to forskjellige fremgangsmåter: prinsipal komponent analyse (PCA) og støttevektormaskin (SVM). Den første, PCA, gjør at strukturen i et datasett å diktere separasjon av prøvene i klynger basert på generelle likheten i toppverdier uten forkunnskaper i prøven identitet. Plott av PCA score beregnet fra de normaliserte verdiene av de 47 toppene viste en tydelig separering av den kjemiske profilen mellom tumorgrupper og placebogruppene i begge kreftcellelinjer (figur 3A og 3B). For det andre ble en overvåket maskinlæringsmetode som bygger på SVM anvendt for å bestemme grensen mellom tumorgrupper og placebogruppene. Denne algoritmen regnes som den første to hovedkomponenter, PC1 og PC2, for å lage beskrivelser av prøver i denne high-dimensjonale rommet, og deretter definert et hyperplan som best skiller prøver fra de to klassene. Den SVM klassifikator vellykket atskilt prøvene i tumor og placebo kategorier (vises i den fine kontur med fargen blått til rødt i figur 3A og 3B). Den SVM med hell klassifisert fleste individer som gir en klassifisering nøyaktighet på 94% med en sensitivitet på 88% og spesifisitet på 100% (LKR) og en nøyaktighet på 94% med en sensitivitet på 100% og spesifisitet på 88% (LLC). Spesielt, bare 3 av de 50 individuelle mus i vår test sett ble feilklassifisert. Dermed valgte toppene inneholder kjemiske egenskaper som skiller svulst fra placebo mus.
Separasjon av tumor og placebogruppen etter prinsippet Components Analysis (PCA) og dens grense fastsettelse av Support Vector Machine (SVM) er vist i A (LKR ) og B (LLC). Sirkler representerer individer av kreft grupper og trekanter representerer individer av placebogruppen (Support vektorer: fylte sirkler og trekanter). Bakgrunnen kontur farge, alt fra rød til blå, indikerer klassen sannsynligheten for ulike regioner i flyet.
Cross Validering og Essential Kombinasjon av Peaks
For å validere disse analysene vi ansatt en 10-fold kryssvalidering metoden ved å bruke alle 25 prøver. For ytterligere analyse, valgte vi 11 topper fra de opprinnelige 47 topper som avvek mellom tumor og placebogruppen med en
P
0,0001 (tabell 1). Vi trente SVM klassifikator ved å bruke alle logisk mulige kombinasjoner uten repetisjoner fra disse 11 topper for hver av de to modellsystemer (LKR og LLC). Den generalisering ytelsen til SVM classifiers ansette ulike sett av peak klynger ble illustrert i mottakeren opererer karakteristisk (ROC) plass. Ingen enkelt topp med hell klassifisert med en nøyaktighet på større enn 95%. Imidlertid klassifisering med flere par av topper resulterte i en nøyaktighet på opp til 98 ± 2% for LKR og 100% for LLC (Tabell 2-I, -II og Tabell S2, fig S4), som bekrefter at bedre generalisering støtter seg på en kombinasjon av topper. I videre analyser (data ikke vist) fant vi at SVM hadde overlegen ytelse til Fisher diskriminant analyse, som brukes uten tilsyn læringsformer. Dermed kan karakteristiske peak klynger pålitelig skille kreftgrupper fra placebogruppene og kan ha diagnostisk potensial.
For å vurdere generalisering kraften i rush klynger til en ny gruppe, vi opprettet uavhengige treningssett (13 av de 25 prøvene) og testsett (fortsatt 12 prøver). De SVM trenet klassifiserere med de 11 valgte topp klynger av treningssettet generert en beste kombinasjon av topper som har nøyaktigheter på 95% for LKR og 100% for LLC å teste sett (tabell 2-iii, -v og Tabell S3, S5 figur ).
Selv om LKR og LLC cellelinjer er forskjellige modellsystemer, og de ble injisert i forskjellige innavlet musestammer (som i seg selv sannsynligvis var forskjellige i kroppslukt), våre atferdsmessige studier antydet at de delte felles lukt som indikerer nærværet eller fravær av tumorer. Dette ble også funnet å være tilfelle i metabolomic analysene. Den gruppe av topper (klyngen) som best predikert LLC status fra LKR data som bestemt ved SVM (Tabell 2-iv) hadde en nøyaktighet på 98%. Motsatt, gruppen av topper som best predikerte LKR fra LLC (tabell 2-vi) hadde en nøyaktighet på 91%. Kun én topp (# 22; se tabell 2-iv, -VI) var felles for disse to sett av prediktive klynger. Klassifisering av andre topp klynger også generert diagnostisk nøyaktighet høy (95%) med betydelig diagnostisk potensial (figur S6).
Interaktiv Effekt av svulster og cellelinjer
Selv om det var fellestrekk mellom de to tumormodeller, nærmere statistiske analyser har også vist at effekten av de to tumormodellene for metabolske profiler var ikke identiske. Samspillet mellom to forskjellige cellelinjer (LKR og LLC) og tumor sammenlignet med placebo ble analysert med to-veis analyse av varians (tumor og placebogruppene for hver av de to tumormodeller) for hver av de 47 topper (figur 4 og S7 ). En signifikant interaksjon indikerer svulst spesifisitet. Av de 47 separate analyser, w’as samspillet signifikant (
P
0,05) i 11 tilfeller (tabell S3). For å kontrollere for falske positiver grunn til å teste 47 topper, begrenset vi hensyn til 4 topper (# 1, 7, 29 og 33) med
P
0,002. Disse interaksjonene er illustrert i figur 4 hvor, for eksempel, peak 29 viser ingen forskjell mellom tumor og placebo (
P
= 0,0387), men en stor forskjell mellom tumormodeller (
P
= 0,0002) . Det er tilstrekkelig spesifisitet til å skille mellom de flyktige profilene for de to tumortyper.
normalisert intensitet (på den vertikale akse) av de fire topper (A-D), hvor en to-veis ANOVA antydet signifikant (
P
0,002) interaksjoner indikerer differensiering mellom de to tumormodeller. Den horisontale aksen til hver av de 4 paneler (A-D) angir de to trinn, tidlig – før signifikant tumorutvikling til venstre, og senere – etter utvikling av signifikant tumorstørrelsen. Red: tumor, Blå: placebo, Circle: LKR, Star. Advisor
Diskusjoner
Identifikasjon av flyktige biomarkører i urin for sykdomsdiagnose er et område med store løftet, men det er basert på begrenset tidligere menneskelig forskning. Dataene i dette papir er i samsvar med hypotesen om at diagnostisk nyttige flyktige forbindelser fremstilles i pasienter med lungecancer og utskilt i urinen, og dermed gi støtte til dette diagnostiske tilnærmingen i sammenheng med lungekreft.
Spesifikt våre studier viste at dyret luktesans i arter som mus (som har en sensitiv luktesystem [25], [26]), kan ha diagnostisk suksess i å oppdage lungekreft signaturer i urinen. Enda viktigere, var vi i stand til å etterligne denne evnen ved hjelp BIOANALYTIC teknikker. Dette antyder at det vil være mulig å lage en biomimetisk sensor basert på kunnskap om olfaktoriske system for screening av diagnostiske luktstoffer som kunne være praktisk for Bruksområdene [27], [28], [29], [30]. Faktisk er genetisk konstruert gjær som uttrykker en olfaktorisk-reseptor og dens signaltransduksjon system har vist seg å være i stand til å detektere 2,4-dinitrotoluen, en forbindelse diagnostisk av sprengstoff [31]. Kunstig luktesans med en polymer epitel og modell glomeruli kunne oppdage odorants dermed etterligne en biologisk luktsystemet [32]. I siste instans kan slike sensorer føre til utvikling av kommersielt tilgjengelige testsett. Det synes imidlertid også at metabolsk profilering (fast-fase-mikroekstraksjon, etterfulgt av gasskromatografi kombinert med massespektrometri) er et levedyktig alternativ som bør videre utforsket.
Den metabolske opprinnelsen til mange av de diagnostiske biomarkører vi identifisert er ikke kjent, og vi kunne ikke identifisere felles kjemiske egenskaper. I stedet hadde de sin opprinnelse i enten en rekke endogene biokjemiske mekanismer eller fra miljø (eksogene) kilder. Disse sistnevnte forbindelser (for eksempel
o
-toluidine, og 2-etylheksansyre) er usannsynlig å være diagnostisk nyttig. Blant de endogene metabolitter, 2-heptanon, et feromon, rapportert å øke i konsentrasjon i stressede rotter, og er blitt observert i human urin [33]. 6-hydroksy-6-metyl-3-heptanon har også tidligere blitt identifisert i mus urin selv om vi finner ingen rapport av denne forbindelse i human urin. Den observerte variasjon av ketoner som en funksjon av tumorvekst antyder at ketogenesic veier kan være involvert i disse modellene av lungekreft. Videre forskning vil være nødvendig for å avgjøre hvilke av disse diagnostiske metabolitter er av tumor opprinnelse og som stammer fra normale metabolske prosesser og er enten ned- eller opp-regulert av svulster.
Den felles nedregule vi observert etter svulst utvikling i mange forbindelser er bemerkelsesverdig. De fleste biomarkører rapportert av andre forskere har blitt oppregulert. En forklaring på disse ulike funnene kan ligge med gjenkjenning strategier ansatt av andre til å identifisere biomarkører. I enkelte undersøkelser kan det være en skjevhet mot et søk etter nye (og derfor oppregulert) biomarkør forbindelser, mens våre fremgangsmåter ikke hadde noen slik skjevhet. En annen mulighet er at denne hyppige nedregule resultater fra komplekse effektene av svulsten på dyrets stoffskifte
Selv om SVM funnet klynger av toppene som spådd mellom de to modellene av kreft (LKR til LLC og vice versa. Tabell 2) med høy nøyaktighet, klasene var hovedsakelig forskjellig for forutsigelse i de to retninger. Dette resultatet synes å være uforenlig med dyrestudiene som indikerte at mus opplært til å diskriminere i en av tumormodeller gener dette lærte svaret uten videre opplæring til den andre modellen. Dette innebærer at det bør være et sett av flyktige forbindelser (odoranter) er felles for de to modeller som skiller tumor fra ikke-tumor-mus. En sannsynlig forklaring på denne tilsynelatende anomali er at kombinasjoner av flyktige komponenter som vi har identifisert med SVM classifiers er ikke de samme som musene spoler inn på under trening og testing; kanskje det er andre komponenter til felles med de to modellene som vi ennå ikke har identifisert. Dersom dette er tilfelle, vil en av de neste utfordringene er å identifisere disse nye biomarkører. Alternativt vi oppmerksom på at det var en forbindelse som var felles for prediksjon i begge retninger (# 22), og vi kan ikke utelukke at det var denne forbindelsen musene som brukes til å gjøre skillet i begge tilfeller.
En viktig faktor for enhver praktisk diagnostisk verktøy er dens evne til å diskriminere mellom forskjellige typer av sykdom. Selv om de to modellene av lungekreft har helt klart likheter i flyktige profiler, de har også tilstrekkelige forskjeller at de kan bli diskriminert i metabolomic analyser (figur 4). Denne evnen til å diskriminere mellom nært beslektede musemodeller av lungekreft innebærer at spesifikke krefttyper kan være mottakelig for diagnostisk differensiering gjennom analyser av flyktige profiler som vist i den pågående forskning.
Videre arbeid med dyremodeller kan fortsette langs tre konvergerende linjer. For det første er det viktig å overvåke den utviklingsmessige endringene i markørene på tidligere stadier av tumorutvikling. Ikke bare er denne som er relevant for å bestemme hvor tidlig diagnostiske markører kan detekteres, men det kan kaste lys over mulige mekanismer som ligger under endringer i flyktige bestanddeler som en følge av tumorprogresjon. For det andre bør en rekke forskjellige tumortyper bli undersøkt i tillegg til de to nært beslektede de som er beskrevet her. Dette kan også gi viktige ledetråder til mekanismen. Tredje, in vitro-studier på kreftceller vil være avgjørende for å forstå mekanismene.
I sammendraget, vi var i stand til for første gang å identifisere flyktige kjemiske signaturer i urin hos musemodeller av lungekreft ved hjelp av grundige eksperimentell atferds og analytisk teknikker. Betydningen av denne studien er at den etablerer muligheten for å bruke urin flyktige til å oppdage lungekreft. Muligheten til enkelt å samle inn og lagre urinprøver vil være en stor fordel med denne tilnærmingen i løpet analysere volatile i utåndet pust. Selv om denne studien har reist mange spørsmål om identitet og kilde av forbindelsene påvist i våre musemodeller, er vi ikke planlegger å forfølge denne retningen. I stedet ser vi denne studien som en viktig bevis for prinsippet for verdien av å studere urin flyktige bestanddeler ved hjelp av biokjemiske og bioinformatiske teknikker i diagnostisering av human lungekreft (og kanskje andre kreftformer). Derfor har vi begynt kliniske studier med humane pasienter. Disse studiene vil håndtere viktige spørsmål om følsomhet, spesifisitet, størrelsen på svulster som kan være nøyaktig oppdaget, mekanismene bak de observerte endringene i flyktige profiler, evnen til å generalisere mellom ulike typer av lungekrefttilfellene, og virkningen av nåværende eller tidligere røyking .
Materialer og Metoder
Lung cancer Cell linjer
Kras-indusert murine lungekreft (LKR) og Lewis lungecellekreft (LLC) cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA).
