Abstract
Velge kolorektal kreft (CRC) pasienter sannsynlig å svare på behandlingen fortsatt en klinisk utfordring. Formålet med denne studien var å finne ut hvilke gener ble uttrykt forskjellig med hensyn til behandling følsomhet og relatere dette til kopitall i et panel av 15 CRC-cellelinjer. Kopier nummer varianter av de identifiserte gener ble vurdert i en kohort av CRC. IC
50-årene ble målt til 5-fluorouracil, oksaliplatin og Bez-235, et PI3K /mTOR-hemmer. Cellelinjer ble profilert bruker matrise komparativ genomisk hybridisering, Illumina genekspresjonsanalyser, reverse fase protein matriser og målrettet sekvensering av
KRAS
hotspot mutasjoner. Hyppige gevinster ble observert ved 2p, 3Q, 5p, 7p, 7q, 8Q, 12p, 13q, 14q, og VED BETJENING 17Q og tap ved 2q, 3p, 5q, 8p, 9 p, 9q, 14q, 18q, og 20p. Vanlige fått regioner inneholdt
EGFR
,
PIK3CA
,
MYC
,
SMO
,
TRIB1
,
FZD1
og
BRCA2
, mens ofte tapt regioner inneholdt
FHIT Hotell og
MACROD2
.
TRIB1
ble valgt for videre studier. Gene berikelse analyse viste at differensielt uttrykte gener med hensyn til behandlingsrespons var involvert i Wnt signal, EGF reseptor signalisering, apoptose, cellesyklus, og angiogenese. Trinnvis integrering av eksemplar nummer og genuttrykk data ga 47 kandidatgener som ble signifikant korrelert.
PDCD6
ble uttrykt forskjellig i alle tre behandlingstiltak. Microarray ble konstruert for en kohort av 118 CRC pasienter og
TRIB1 Hotell og
MYC
presiseringer ble målt ved bruk av fluorescens
in situ
hybridisering.
TRIB1 Hotell og
MYC
ble forsterket i 14,5% og 7,4% av kohorten, henholdsvis, og disse presiseringer ble signifikant korrelert (p≤0.0001).
TRIB1
protein uttrykk i pasientens kohorten var signifikant korrelert med ekstra fordel, Akt, og caspase 3 uttrykk. I konklusjonen, er et sett av kandidat prediktive biomarkører for 5-fluorouracil, oksaliplatin og BEZ235 beskrevet som garanterer videre studier. Forsterkning av den antatte onkogen
TRIB1
har blitt beskrevet for første gang i en kohort av CRC pasienter
Citation. Briffa R, Um jeg, Faratian D, Zhou Y, Turnbull AK, Langdon SP, et al. (2015) Multi-Scale Genomisk, Transcriptomic og proteomikk analyse av tykktarmskreft cellelinjer for å identifisere Novel biomarkers. PLoS ONE 10 (12): e0144708. doi: 10,1371 /journal.pone.0144708
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 16 juni 2015; Godkjent: 23 november 2015; Publisert: 17.12.2015
Copyright: © 2015 Briffa et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis finansiert av Strategic utdanningsløp stipend (Malta). Stipendet er delfinansiert av EU – European Social Fund (ESF) under Handlingsprogrammet II – utjevningspolitikken for 2007-2013, «Empowering People for flere arbeidsplasser og en bedre livskvalitet». Dette prosjektet ble i tillegg finansiert av medisinsk forskning Scotland
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) står for 8 % av alle kreftdødsfall [1], med variabel overlevelse på mellom 39% og 65%, avhengig av stadiet i diagnose [2]. Risikoen for å utvikle CRC er avhengig av både genetiske og livsstilsrelaterte faktorer og øker markant med alderen [2]. Selv om behandlingen kan være helbredende, en betydelig andel av CRC-pasienter har en høy risiko for tilbakevendende sykdom etter kirurgi og kjemoterapi [3].
De viktigste trasé innblandet i kolorektal kreft omfatter, men er ikke begrenset til, PI3K /mTOR vei, den mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) reaksjonsveien, og de Wnt sti [4], med JAK /STAT vei, pinnsvin reaksjonsvei, og NFkB sti også involvert [5]. Disse banene styres via komplekse crosstalk, negative tilbakemeldinger, og andre kompenserende mekanismer. Aktivering av disse banene skjer via mutasjoner i å delta onkogener og tumorsuppressorgener, henholdsvis av 80 somatiske mutasjoner i ethvert individ CRC, bare 15 eller muligens mindre sannsynligvis vil være viktige drivere av startfasen, progresjon og /eller vedlikehold [ ,,,0],6]. De hyppigst muterte gener i CRC er
APC product: (70-80%),
TP53 product: (50%),
KRAS product: (35-45%),
PIK3CA product: (25-32%),
BRAF product: (10-17%) og
PTEN product: (4-5%) [7-12].
Første linje terapi for CRC er vanligvis fluoropyramidine monoterapi og oksaliplatin eller irinotekan-basert kjemoterapi [13]. Mer nylig har monoklonale antistoffer som cetuximab, panitumumab, og bevacizumab blitt lisensiert i kombinasjon med kjemoterapi for metastatisk CRC (mCRC) [14] som selektive og spesifikke legemidler mot kreft med en høy terapeutisk indeks og lavere toksisitet enn konvensjonell terapi [15]. Men respons på behandling er variert, med mindre enn en tredjedel av pasienter som responderte på 5-fluorouracil [16]. Selv
KRAS Hotell og
BRAF
mutasjoner viser motstand mot EGFR-målrettede terapier, ca 40-70% av vill type
mCRC pasienter KRAS
utlede lite eller ingen nytte av EGFR målrettet terapi [17]. Det er fortsatt mangel på prediktive markører som tillater leger å velge pasienter som mest sannsynlig å dra nytte av en spesifikk terapi.
Her søkte vi systematisk karakterisere et panel av CRC cellelinjer, valgt å gjenspeile mangfoldet i denne sykdommen , ved hjelp av high-throughput analyser for å identifisere biomarkører for motstand mot både målrettede og ikke-målrettet terapi.
Metoder
CRC cellelinje panel
Femten CRC cellelinjer var studert: de nære diploid cellelinjer DLD-en, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, og LoVo (alle fra ECACC unntatt HCT116p53 – /- som var en gave fra Dr G Smith, Universitetet i Dundee, UK [18]) og de aneuploide cellelinjer SW480, SW837, HT29, T84, Colo 201, Colo 320DM, LS411N, SK-CO-1, NCI H508 og NCI H716 (alle fra ATCC) bortsett fra Colo 320DM, T84, og SW837 (alle fra ECACC) .
celle~~POS=TRUNC linjene~~POS=HEADCOMP ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Gibco
®, Cat no 31 885..) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; PAA, Cat no.. A15-101) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco
®, Cat. No.15140-122). Cellelinjene ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C inneholdende 5% CO
2. Alle cellelinjer ble testet for mycoplasma ved hjelp av Venor
™ perle Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich, Cat. Nr. MP0025). Når cellelinjene nådd 70-80% konfluens, ble de trypsinert bruker 0,05% trypsin-EDTA (1X) med fenol rød (Gibco
®, kat. Nr. 25300).
Kliniske prøver
Personformalinfiksert, parafin-embedded (FFPE) vevsprøver ble hentet fra reseksjon prøver fra pasienter som bor i Skottland som ble diagnostisert med CRC mellom 1996 og 2003 og var under 55 år ved diagnosetidspunktet (se til S1 tabell). Totalt 870 pasienter hadde blitt rekruttert som tidligere beskrevet [19]. Alle tilfeller ble gjennomgått av en gastrointestinal histopathologist før TMA konstruksjon for å sikre at vevet var består hovedsakelig av tumor. Alle kreftformer ble iscenesatt Dukes «A og B. Kohort materiale og kliniske poster tilgang ble gitt av Tissue-komiteen, Edinburgh Experimental Cancer Medicine (Ref: TR029), Lothian forskningsetiske komité (Ref: 08 /S1101 /41) og South East Scotland HSS (SAHSC) Bioresource. (Ref: SR117)
Drug følsomhetsanalyser
5-fluorouracil (5-FU) 50 mg /ml injeksjonsvæske, oppløsning ble kjøpt fra medac GmbH. Oksaliplatin (L-OHP) 5mg /ml konsentrat til infusjonsvæske (Fresenius Kabi Oncology plc, UK) ble hentet fra Western General Hospital Pharmacy, Edinburgh. Den målrettede inhibitor BEZ235 (kat. Nr. S1009) ble kjøpt fra Selleck Chemicals. Hver 96-brønns plate besto av seks brønner inneholdende celler i DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, som tjente som en kontroll. Cellene ble sådd ut i 48 timer før tilsetning av medikamenter. Åtte forskjellige konsentrasjoner ble anvendt pr medikament som strekker seg mellom 5 uM til 100 uM (5-FU, L-OHP) og mellom henholdsvis ekstra med 2,5 Nm og 80nM, (BEZ235). Cellene ble inkubert med legemidler for 96h. For å bestemme celleviabilitet, ble 20 pl av Alamar blå tilsatt i hver brønn i 6 timer før du leser platene ved hjelp Fluoroskan Ascent FL. Alle medikament følsomhetsanalyser ble replikert minst to ganger og seks brønner ble sådd ut ved hver medikamentkonsentrasjon.
En gjennomsnittlig RFU avlesning ble tatt for hver medikamentkonsentrasjon og cellelevedyktigheten ble beregnet som en prosent av den ubehandlede kontroll. Feilfelt ble beregnet ved bruk av det korrelerte standardavviket av gjennomsnittet. IC
50s for 5-FU, L-transparenter og BEZ235 ble bestemt ved hjelp av programvarepakken XLfit 5.0 (ID Business Solutions, UK). Ingen ekstrapolering ble utført når du definerer IC
50 verdier og uteliggere ble beregnet til å ha et sikkerhetsnivå som er større enn 0,05.
DNA, RNA og protein utvinning
Genomisk DNA ble ekstrahert fra hver cellelinje ved hjelp DNeasy blod og vev Kit (Qiagen, Art.nr. 69504) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA-konsentrasjoner ble bekreftet ved hjelp av Nanodrop 2000 mikro-volum spektrofotometer (Thermo Scientific). Tilfredsstillende renhet DNA ble ansett som er større enn eller lik en 260/280-forhold på 1,8, noe som sikrer minimal protein forurensning av prøven. Kvaliteten av DNA-prøvene ble ytterligere analysert ved hjelp av agarosegel-elektroforese. Etter elektroforese ble gelen forsiktig fjernet og DNA-båndene ble visualisert ved hjelp av Gel dokumentasjonssystemet.
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer i duplikat ved å bruke RNeasy MinElute oppryddings Kit (Qiagen, kat. Nr. 74204 ) og miRNeasy Mini Kit (Qiagen, kat. nr. 217004). Konsentrasjonen av RNA ble bekreftet ved hjelp av Nanodrop 2000 spektrofotometer. Tilfredsstillende renhet RNA ble betraktet som en 260/230-forhold på ca. 2,0.
Protein lysater ble fremstilt ved cellelinjene var tilnærmet 80% konfluens, som beskrevet i detalj andre steder [20]. Proteinkonsentrasjonen av lysatene ble bestemt ved hjelp av bicinchoninic syre (BCA) analyse (Sigma-Aldrich, kat. Nr. C2284-25ML, Art.nr. B9643-1L).
KRAS
mutasjon analyse av Sanger-sekvensering
Hotspot mutasjoner i kodon 12 og 13 ble analysert. Primeren settet ble utviklet ved hjelp av Primer Premier
® V6.0 programvare (PREMIER Biosoft International). Primersekvensene (5 «til 3») for
KRAS
01 var som følger: GGT ACT GGT GGA GTA TTT GAT AGT GT (fremover) og TGA ATT AGC TGT ATC GTC AAG GCA CT (bakover).
KRAS
exon 2 forsterkning ble utført ved hjelp av HotStar Hi Fidelity Polymerase Kit (Qiagen Quality
®, kat. Nr. 202602). PCR reaksjonen ble utført i DNA Engine Opticon to Real-Time sykler (GMI, Inc). Den forventede lengden av PCR-produktet ble bekreftet ved nærværet av et enkelt bånd på et passende molekylvekt. Sanger-sekvensering ble utført ved Medical Research Council Human Genetics Unit (MRC-HGU), Edinburgh. Produktene ble sekvensert ved bruk av ABI Prism
® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) og data ble analysert ved hjelp av Mutation Surveyor
® DNA Variant Analyse V3.97 programvare.
Mikromatrise analyser
Array komparativ genomisk hybridisering.
Comparative genomisk hybridisering (CGH) ble utført ved hjelp av NimbleGen microarray (Roche). Prøve merking ble utført med NimbleGen Dual-Color DNA Merking Kit (Roche, kat. Nr. 06 370 250 001). Hybridisering ble utført i MRC-HGU, Edinburgh ved hjelp av en NimbleGen hybridisering Kit (Roche, kat. Nr. 05 583 683 001), NimbleGen Sample Sporing Kontroll Kit (Roche, kat. Nr. 05 223 512 001) og to Menneskelig CGH 12 x 135K Hel-Genome teglstein Arrays V3.0 (Roche, kat. nr. 05 520 878 001). NimbleScan programmet ble brukt til å generere paret rapporten filer som brukes for kopiantall dataanalyse. Dataene er blitt deponert ved Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI) Gene Expression Omnibus med tiltredelse antall GSE72296.
Gene uttrykk profilering.
Tre sett med RNA prøver ble fremstilt for Illumina
® Whole Genome Gene Expression Profilering, hvor 48,804 transkripsjoner per prøve ble generert. De tre sett besto av to sett av biologiske replikater og ett sett av tekniske replikater. Alle RNA-prøvene ble fortynnet til en konsentrasjon på 500 ng /11μl. Den Illumina
® TotalPrep
™ RNA Amplification Kit (Ambion
®, cat. No. AMIL1791) ble brukt til å generere biotinylert, forsterket RNA for hybridisering med Illumina
® Menneskelig HT-12 v4. 0 BeadChip. Før progresjon med utarbeidelse av RNA prøver for mikromatriseanalyse ble RNA integritet videre undersøkt med Agilent
® 2100 Bioanalyzer hjelp av Agilent
® RNA 6000 Nano Kit (Agilent, kat. Nr. 5067-1511) . Prøver med et RNA Integrity Number (RIN) på 7 eller bedre ble ansett akseptabelt for hybridisering.
Prøvene ble analysert ved Wellcome Trust Clinical Research Facility, Edinburgh (Gene Expression Prosjekt-CRF E11960), hvor de var fortynnet til en konsentrasjon av 150ng /mikroliter og hybridiserte på tre menneske HT-12 v4 Expression BeadChip arrays. To tekniske replikater ble hybridisert på hver matrise for å tjene som en intern kvalitetskontroll. Prøvene ble tilfeldig hybridisert langs tre Illumina
® HumanHT-12v4 Expression BeadChip arrays.
Post-hybridisering, arrays ble skannet med Illumina HiScan
® Platform (Illumina
®, kat. nr. SY-103-1001). De BeadArray datafiler ble eksportert fra Illumina skanneprogramvare og importert til genuttrykk modul av GenomeStudio programvare (Illumina
®), hvor deretter datafilene ble forvandlet til tabulatordelt filer. Dataene er blitt deponert ved Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI) Gene Expression Omnibus med tiltredelse antall GSE72544 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72544).
revers-fase protein matriser
revers-fase protein arrays (RPPA) er et medium-throughput teknikk som gjør det mulig for screening av prøver med et stort panel av proteiner av interesse i en forholdsvis kort tid , mens ved bruk av minimale mengder av både prøven og antistoff [21]. De denaturert og redusert proteinprøver av de 15 CRC prøvene ble oppdaget i tre eksemplarer på hver pute av en to-Pad FAST
® nitrocellulose belagt glass-slide (Whatman Ltd., kat. Nr. 10485317) ved hjelp av en BioRobotics MicroGrid MG II Biobank (Isogen Life Science). Deretter ofret probet med et panel av 31 optimalisert, in-house validert, total og fosfo-antistoffer som tidligere beskrevet (S2 tabell) [20]. Disse antistoffer ble valgt for å målrette viktige proteiner involvert i celle-proliferasjon og overlevelse, invasjon, metastase, angiogenese, DNA-skade, og apoptose ble optimalisert og validert via Western blotting. De RPPA flekker ble kvantifisert ved hjelp MicroVigene
™ RPPA Analysis Module programvare (VigeneTech Inc.). Dataene ble analysert som tidligere beskrevet [22].
RPPA flekker ble kvantifisert ved hjelp MicroVigene
™ RPPA Analysis Module programvare (VigeneTech Inc.).
Dataanalyse
Genomisk dataanalyse.
Sanger-sekvensering av data ble analysert ved hjelp av Mutation Surveyor
® DNA Variant Analysis Software V3.97 (Soft genetikk
®, USA). Den rå datafiler .ab1 generert av ABI Prism
® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) ble importert inn i programvaren og standardanalyseinnstillingene ble brukt. Genbank merknads filene ble automatisk lastet ned og referanse filer som brukes for mutasjonsdeteksjon ble automatisk syntetisert.
aCGH data ble analysert ved hjelp Partek
® Genomisk Suite
™ Versjon 6.6 (Partek Inc.). Dataene ble først normalisert ved hjelp Loess Normalisering og Genomisk segmentering algoritme ble brukt til å analysere kopi nummer presiseringer og slettinger. Den tilpassede segmentering parametere var som følger: minimums genomiske markørene var 10, p-verdien var 0,001, og signal-til-støy-forholdet var 0,03. En region ble rapportert som tapt hvis log2 kopiantallet forholdet var under -0,3 og fått hvis loggen to eksemplar nummer forholdet var over 0,15. Tre forskjellige regionens listene ble opprettet: (1) regioner som ble oppnådd i syv eller flere cellelinjer; (2) regioner slettet i syv eller flere cellelinjer; (3) de som inneholder de høyeste amplifikasjoner, dvs. log2 forhold lik eller større til 1,0 (ekvivalent med et kopiantall på 2). I tillegg ble genomisk segmentering clustering utført ved hjelp Euklidsk avstand og gjennomsnittlig kobling. Kopien nummer analyse ble utført på kromosom 1 til kromosom 22 og ekskludert de to kjønnskromosomer.
Transcriptomic dataanalyse.
Prøven genet profilfilen genereres fra genekspresjonsanalyser var quantile normalisert og filtrert for de prober hvor påvisning p-verdi ≤ 0,05. Dataene ble deretter transformert log2 og bety sentrert for å oppnå relative verdier mellom cellelinjer. Prøven genet profilfilen ble deretter merket ved hjelp Hg18 før differanse genekspresjonsanalyser (DGEA).
DGEA ble utført ved hjelp ArrayMining, en online microarray data mining programvarepakke [23]. Differensial genekspresjon ble utført ved bruk av SAM-analyse for å liste gener forskjellig uttrykt med hensyn til behandlingsrespons. Tre forskjellige analyser ble utført: (1) 5-FU svært sensitive cellelinjer
vs
. 5-FU mindre sensitive cellelinjer, der svært sensitive cellelinjer ble definert som å ha en IC
50 ≤ 30 pm; (2) L-OHP svært sensitive cellelinjer
vs
. L-OHP mindre sensitive cellelinjer, der svært sensitive cellelinjer ble definert som å ha en IC
50 ≤ 10 uM; (3) BEZ235 sensitive cellelinjer
vs
. BEZ235 ufølsom cellelinjer, hvor sensitive cellelinjer ble definert som å ha en IC
50 80nM.
Tolkning av data ble utført ved hjelp av funksjonell annotering Clustering på ressurser DAVID bioinformatikk [24].
Integrering av ofte forsterkede områder med genuttrykk data.
genuttrykket data for de genene som ligger i de ofte fått regionene ble filtrert ut. Ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisienter med Bonferroni korreksjon, ble en liste av gener som hadde en signifikant sammenheng mellom log2 kopitallverdi og genuttrykk generert. De genuttrykk data for cellelinjer ble analysert med hensyn til behandlingsrespons ved hjelp av Mann-Whitney U test ved hjelp GraphPad Prism 6.
proteomikk dataanalyse.
Data generert fra RPPA ble normalisert ved hjelp Cluster 3.0 , en åpen kildekode clustering verktøy [25]. Data ble log-transformeres, mener sentrert i Cluster 3.0, og gruppert etter korrelasjon sentre og gjennomsnittlig leddet med MeV 4.8 [26]. RPPA resultater for den 15 CRC panel ble analysert med hensyn til behandlingsrespons ved bruk av Mann Whitney U test ved hjelp GraphPad Prism 6.
Tissue microarray (TMA), automatisert kvantitativ analyse (AQUA), og FISH
Fem-micron haematoxylin og eosin-farget lysbilder ble fremstilt fra FFPE- blokker, og svulst områder var preget av en patolog og utdannet forskning tekniker. Etter histopatologisk undersøkelse ble 118 tilfeller valgt ut av den opprinnelige kohorten og en vev microarray (TMA) ble konstruert av en kvalifisert tekniker. Fire biologiske replikater (TMA000034A-D) ble konstruert som beskrevet i detalj et annet sted [27] og skåret i 5 pm seksjoner ved hjelp av en mikrotom og montert på glassplater. Kliniske og patologisk parametrene i denne kohorten er oppsummert i S1 tabell.
Protein uttrykk for TRIB1 ble vurdert med anti-TRIB1 kanin polyklonale antistoff i CRC TMA bruker Automated kvantitativ analyse (AQUA), beskrevet i detalj andre steder [28 , 29]. TRIB1 ekspresjon i både den cytoplasmiske og kjernefysiske kamrene ble deretter korrelert med andre proteiner som tidligere er målt i denne kohort. TRIB1 uttrykk ble også undersøkt med hensyn til pasientens overlevelse, som beskrevet nedenfor.
TRIB1 Hotell og
MYC
forsterkning i barnekonvensjonen pasienten kohorten ble undersøkt med fluorescens
i situ
hybridisering (FISH). En MYC /CEN8p probe ble kjøpt fra Abnova (kat. Nr. FG0065) og TRIB1 /CEN8p probe var tilpasset designet av Abnova. Den protease behandlingstiden ble variert for å optimalisere fordøyelse og sikre god kvalitet hybridisering. Visualisering ble utført ved hjelp av DAPI (4,6-diamidino-to-phenylindole-to-hydroklorid (Abnova) å farge kjerner.
Klar til bruk dual-merkede prober for
MYC Hotell og
TRIB1
ble kjøpt fra Abnova. Den MYC /CEN8p FISH probe besto av en ~ 160kb
MYC
sonde plassert på 8q24.12-q24.13 med en Texas Red fluorophore sammen med en ~ 520kb CEN8p sonde plassert på 8p11.21 med en FITC fluorophore. Den TRIB1 /CEN8p FISH probe besto av en ~ 260kb
TRIB1
sonde plassert på 8q24.13 med en Texas Red fluorophore sammen med en ~ 520kb CEN8p sonde plassert på 8p11.21 med en FITC fluorophore.
Skåring ble utført av en tekniker og en konsulent patolog. Glassene ble scoret ved hjelp av en Leica DMLB fluorescerende mikroskop bruker 100X olje nedsenking linse. De Colorado scoring kriterier ble brukt [ ,,,0],30] for å score TMA skred. maksimalt tjue kjerner per kjerne ble scoret i de fleste tilfeller, men i enkelte tilfeller minimum ti kjerner ble scoret på grunn av ikke å ha tjue scorable kjerner. Summen av de røde og grønne fluoroforer, ble notert for hver kjerne, og sluttresultatet besto av forholdet mellom den røde fluoroforen til den grønne fluoroforen. FISH scorer mindre enn 1,8 ble tolket som negative [31].
Statistiske analyser
TRIB1 protein uttrykk data generert fra AQUA analyse ble korrelert med AKT, caspase 3, cyclin B1, ERK, Ki67, MYC, S6, PTEN, Pakt, Perk, pHistone H3, pMEK, og PS6 protein uttrykk. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Pearsons korrelasjon, og p-verdier ble justert for multippel testing med Bonferroni korreksjon. En åpen kildekode-program TMA Navigator (https://www.tmanavigator.org/) ble brukt for statistisk analyse. Overlevelsesanalyse for
TRIB1 Hotell og
MYC
forsterkning i barnekonvensjonen kohorten ble gjennomført ved hjelp GraphPad Prism 6.
Resultater
Enkelt genet mutasjonsanalyse er utilstrekkelig for lagdeling av tumorer med hensyn til terapi
etter behandling med 5-fluoruracil (5-FU) i 96 timer, tretten CRC cellelinjer viste varierende grad av følsomhet ved behandling med medikament konsentrasjoner varierende fra 100 uM til 2.5μM ( fig 1A). To CRC-cellelinjer (Colo320DM, T84) var ufølsom for 5-FU i en konsentrasjon på 100 uM. IC
50 verdier for 5-FU varierte fra 3,1 til 100 uM med en median på 19.6μM. De mest sensitive cellelinjer var HT29, LS411N, og HCT116. DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, og LoVo er rapportert å være mismatch reparasjon mangelfull [32]. Denne profilen til mismatch reparasjon status korrelerte ikke med 5-FU følsomhet (p = 0,713, Mann-Whitney U-test). I motsetning til en studie av Bracht og kolleger [33]
A. Foss tomt for 5-fluorouracil IC
50 (um) verdier. B. Foss tomt for oksaliplatin IC
50 (um) verdier. C. Foss tomt for BEZ235 IC
50 (NM) verdier. D. Unsupervised hierarkisk clustering for IC
50 verdier for 5-FU, L-transparenter og BEZ235 bruker Pearsons korrelasjon med komplett kobling.
Selv om en rekke
in vitro
studier har antydet at
TP53
mangel bidrar til resistens [34], vi klarte å se en sammenheng (p = 0,238, Mann-Whitney U-test). HT29, LS411N, HCT116 p53 – /-, SW837, NCI H508, NCI H716 er alle
TP53
mangel (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/), men de var fortsatt følsomme for 5-FU i denne studien. Mariadason et al., Rapporterte imidlertid ingen forskjell i 5-FU-indusert apoptose i muterte og villtype p53-cellelinjer [35].
Etter behandling med oksaliplatin (L-OHP) i 96 timer, CRC cellelinjer som viste varierende grader av følsomhet når de ble behandlet med økende konsentrasjoner av L-OHP som strekker seg fra 2.5μM til 100 uM (figur 1B). IC
50 verdier for L-OHP varierte fra 3,0 til 31.1μM, med en median på 8,0 mikrometer, viser en ti-fold spekter av følsomhet. De mest sensitive cellelinjer var HT29, LS411N, og SW837, mens den minst følsomme var Colo320DM, NCI H716, og Colo201. Ingen statistisk signifikans (p = 0,462; Mann-Whitney U-test) ble observert ved sammenligning av L-OHP IC
50 verdier mellom dMMR cellelinjer og pMMR cellelinjer, som er i overensstemmelse med en tilsvarende studie av Fink et al. . [36]
Det var ingen sammenheng mellom p53 status og L-OHP IC
50-verdier (p = 0,187; Mann Whitney U test), i motsetning til en tidligere rapport [37]. Men en fersk undersøkelse utført i 51 avanserte CRC pasienter konkluderte med at
TP53
mutasjonsstatus var ikke forbundet med nytte førstelinje oksaliplatinbasert behandling [38].
Syv CRC cellelinjer var følsom og åtte CRC cellelinjer var ufølsom for behandling med ulike konsentrasjoner (ekstra med 2,5 Nm og 80nM) av BEZ235 i 96 timer (figur 1C). IC
50 verdier for BEZ235 varierte fra 13,4 til 80nM, med de følsomme cellelinjer med en median følsom konsentrasjon av 23.6nM. De mest sensitive cellelinjer var HT29, Colo201, og NCI H716, mens NCI H508, T84, SW48, SW480, Colo320DM, HCT116, HCT116 p53 – /-, og LoVo var ufølsomme ved en konsentrasjon på 80nM. Ingen statistisk signifikant forskjell ble observert (p = 0,346, Mann-Whitney U-test) mellom IC
50 verdier for BEZ235 behandling og
PIK3CA
mutant og vill type grupper. Alle
PI3KCA
mutantcellelinjer hadde enten en
BRAF
eller en
KRAS
co-mutasjon. Ingen COSMIC data var tilgjengelig for
mTOR
mutasjoner i disse cellelinjene (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Serra et al. fastslått at BEZ235 arrestert spredning i alle 21 kreftcellelinjer som benyttes i sin studie, uavhengig av PI3K veien mutasjonsstatus [39], og at cellelinjer med en
BRAF
eller
KRAS
mutasjon eller
EGFR
forsterkning var litt mindre følsom for BEZ235 forhold til de andre cellelinjer [39].
av de 15 CRC cellelinjer, åtte cellelinjer besatt
KRAS
ekson 2 mutasjoner . Den DLD-1, HCT116, HCT116 p53 – /-, og LoVo cellelinjer hadde en 5574 G A substitusjon i samsvar med et G13D missense mutasjon; SK-CO-1 og SW480 cellelinjer hadde en 5571 G T substitusjon i samsvar med et G12V missense mutasjon; SW837 hadde en 5570 G T substitusjon forenlig med en G12C mutasjon; og T84 hadde en 5574 G En substitusjon forenlig med en G13D mutasjon. Dette er i samsvar med publiserte sekvense data og data i den kosmiske database (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i respons til 5-FU, L-OHP, og BEZ235 med hensyn til
KRAS
mutasjonsstatus (p = 0,98, p = 0,60 og p = 0,17, henholdsvis).
Unsupervised hierarkisk clustering for IC
50-verdier for 5-FU, L-OHP, og BEZ235 bruker Pearsons korrelasjon med komplett sammenhengen viste at cellelinjene ikke klynge i henhold til en bestemt mutasjon. Det var forskjell i respons på de tre ulike behandlinger (fig 1D).
Kromosom regioner ofte fått og mistet i tykktarmskreft cellelinjer
Panelet av cellelinjer ble neste evaluert av aCGH til identifisere felles kromosomale regioner av gevinst og tap. Tjuefire regioner ble ofte fått i minst 7/15 CRC cellelinjer. Hyppige gevinster ble observert ved 2p, 3Q, 5p, 7p, 7q, 8Q, 12p, 13q, 14q, og VED BETJENING 17Q (fig 2) (tabell 1). På den annen side, ble totalt 14 regioner tapt i det minste 7/15 CRC cellelinjer (tabell 2). Hyppige tap ble observert ved 2q, 3p, 5q, 8p, 9p, 14q, 18q, og 20p (fig 2). Disse regionene gevinst og tap var lik de tidligere rapportert [32, 40-44].
hierarkisk clustering av segmenterte kopi talldata ved hjelp Euklidsk avstand gjennomsnittlig kobling resulterte i to store klynger: en klynge inneholdt NCI H716 mens den andre gruppen inneholdt de øvrige 14 cellelinjer (fig 3). En av de sub-klynger inneholdt HT29, SW48, LS411N, LoVo, HCT116 og HCT116p53 – /-. HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, og LoVo er nær-diploid og kjent for å ha mutasjoner i MMR gener
MLH1 Hotell og
MSH2 product: [45, 46]. De andre nær-diploid cellelinje, DLD-1, også gruppert separat. Denne cellelinjen er MMR mangelfull i MSH6 [47].
Differensial genuttrykk i forhold til narkotika følsomhet
Gener forskjellig uttrykt i forhold til 5-FU følsomhet er oppført i S3 tabell og avbildet i et varme kart i fig 4A. Funksjonell merknad med David [24] viste at disse genene var hovedsakelig involvert i cellesyklus (
TAF2
,
CHFR
,
CCND2
,
OSGIN2
,
TERF1
,
TBRG4
), brennvidde heft (
ABCB1
,
SH3KBP1
,
EBAG9
), apoptose (
SHRKBP1
,
EBAG9
,
TERF1
,
TBRG4
), og regulering av transkripsjon (
LASS2
,
LMCD1
MAF1
,
TAF2
,
THAP11
,
CHURC1
,
MED14
,
PIAS3
,
PURB
,
TERF1
,
ZNF239
,
ZNF7
). Viktige KEGG trasé i forbindelse med 5-FU virkningsmekanisme og senere beriket i listen stammer fra denne studien inkluderte purinmetabolismen (
NT5C2
,
POLR2J2
), pyrimidin metabolisme (
NT5C2
,
POLR2J2
), legemiddelmetabolisme (
GSTO2
), ABC transportører (
ABCB1
), og oksidativ fosforylering (
NDUFA9
).
A. En heatmap skildrer SAM analyse for gener differensielt uttrykt mellom 5-FU følsomme og mindre følsomme CRC cellelinjer; B. En heatmap skildrer SAM analyse for gener uttrykt forskjellig mellom L-OHP følsomme og mindre følsomme CRC cellelinjer; C. En heatmap skildrer SAM analyse for genene forskjellig uttrykt mellom BEZ235 følsomme og mindre følsomme CRC cellelinjer.
Gener forskjellig uttrykt i forhold til L-OHP følsomhet var involvert med DNA-bindende (
GLI2
,
GLI4
,
SETDB2
,
NFXL1
,
POLE4
,
PURA
,
TSNAX <
