Abstract
Den anti-inflammatoriske protein annexin A1 (ANXA1) er forbundet med progresjon av kreft og metastase, hvilket antyder dets rolle i regulering av tumorcelle-proliferasjon. Vi undersøkte mekanismen for ANXA1 interaksjon med formylerte peptid reseptor 2 (FPR2 /ALX) i kontroll, peritumoral og tumor strupehode vevsprøver fra 20 pasienter, for å kvantifisere nøytrofile granulocytter og mastceller, og å evaluere protein uttrykk og samlokalisering av ANXA1 /FPR2 i disse betennelsesceller og strupehodet plateepitel celler ved immunocytochemistry. I tillegg, utførte vi in vitro forsøk for ytterligere å undersøke den funksjonelle rollen til ANXA1 /FPR2 i proliferasjon og metastasering av Hep-2-celler, en cellelinje fra strupehode epidermoid karsinom, etter behandling med ANXA1
2-26 (annexin A1 N-terminal-avledet peptid), Boc2 (antagonist av FPR) og /eller deksametason. Under disse behandlingene, ble nivået av Hep-2 celleproliferasjon, proinflammatoriske cytokiner, ANXA1 /FPR2 samlokalisering, og prostaglandin signale analysert ved hjelp av ELISA, immunocytochemistry og real-time PCR. En strøm av nøytrofile og degranulated mastceller ble oppdaget i tumorprøver. I disse inflammatoriske cellene peritumoral og tumorprøver, ble ANXA1 /FPR2 uttrykk markert forsterket, men i strupehodet karcinomceller, dette uttrykket ble nedregulert. ANXA1
2-26 behandling redusert spredning av Hep-2 celler, en effekt som ble blokkert av Boc2, og oppregulert ANXA1 /FPR2 uttrykk. ANXA1
2-26 behandling også reduserte nivåene av pro-inflammatoriske cytokiner og påvirket ekspresjon av metalloproteinaser og EP-reseptorer, som er involvert i prostaglandin signalering. Samlet denne studien identifiserte potensielle roller for den molekylære mekanismen av ANXA1 /FPR2 samhandling i strupekreft, herunder forholdet til prostaglandin veien, og gir lovende utgangspunkt for fremtidig forskning. ANXA1 kan bidra til regulering av tumorvekst og metastasering gjennom paracrine mekanismer som er mediert av FPR2 /ALX. Disse dataene kan føre til nye biologiske mål for terapeutisk intervensjon i menneskets strupekreft
Citation. Gastardelo TS, Cunha BR, Raposo LS, Maniglia JV, Cury PM, Lisoni FCR, et al. (2014) Betennelse og kreft: Role of Annexin A1 og FPR2 /ALX i spredning og metastaser i Human Strupe Plateepitelkarsinom. PLoS ONE 9 (12): e111317. doi: 10,1371 /journal.pone.0111317
Redaktør: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 06.12.2013; Godkjent: 30 september 2014; Publisert: 09.12.2014
Copyright: © 2014 Gastardelo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (tilskudd 2008 /08187-4 til SMO og 2008 /01655-2 til TSG) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (tilskudd 302 768 /2010- 6 til SMO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Strupekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste typene av hode og nakke svulster som har en høy dødelighet og en dårlig prognose [1]. Mer enn 12.500 nye tilfeller av strupekreft er diagnostisert årlig og 3,560 årlige dødsfallene skjer [2]. Utviklingen av bedre behandling samt bedre diagnostikk og forebyggende tilnærminger krever en bedre forståelse av den komplekse prosessen med strupe tumorigenesis.
Bare 5% til 10% av alle krefttilfeller er forårsaket av arv av muterte gener, mens de resterende 90% til 95% av tilfellene har vært knyttet til genetiske og epigenetiske forandringer forårsaket av livsstil og miljøfaktorer som røyking og alkoholbruk [3], [4]. Det er nå velkjent at betennelse er en risikofaktor for de fleste typer kreft, inkludert strupehodet karsinomer [5], [6]. Kronisk betennelse har vært knyttet til ulike trinnene involvert i tumordannelse, inkludert mobil transformasjon, markedsføring, spredning, invasjon, angiogenese og metastase [7], [8]. Hanahan og Weinberg, i sin siste gjennomgang [9], anerkjent betennelse som en ny kjennetegn på kreft som fremmer flere kreft funksjoner.
betennelsesceller skiller ut en rekke cytokiner, kjemokiner og vekstfaktorer som kan stimulere spredning, hemme apoptose, indusere morfogenese og generere DNA-skadende reaktive oksygenforbindelser [7], tilrettelegging genomiske ustabilitet [10]. Videre har disse cellene syntetisere vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), angiopoetin, metalloproteinases og andre proteiner som kan stimulere vaskulær endotelial celle mitose og ekstracellulær matriks ombygging [11]. Derfor genererer betennelse ikke bare endringer i mikromiljøet for å fremme kreft, men også endringer som stimulerer neoplastisk progresjon.
Det er blitt vist at mastceller og neutrofiler kan rekrutteres ved tumorceller. Økt antall mastceller har blitt rapportert i mammary [12] og lungekarsinomer [13], blant andre svulster. Eksperimentelle bevis har indikert at aktiverte mastceller slipper angiogene vekstfaktorer og regulatorer, prostaglandin, metalloproteinaser og cytokiner [14], og kan spille en dobbel rolle i å fremme eller hemme tumorvekst, avhengig av de lokale stromal forhold [15], [16]. Av de celletyper som er bosatt i svulsten mikromiljøet, har tumor-assosiert nøytrofile (Tans) fått liten oppmerksomhet [17]. Selv om det er tegn som tyder på en rolle for neutrofiler i økt sykdomsutvikling i bestemte humane tumorer, forholdet mellom neutrofil infiltrering og prognose i human cancer er ikke systematisk undersøkt [18]. Rollen av nøytrofiler i tumorprogresjon fremdeles kontroversiell [19] i stor grad fordi disse cellene har både tumorfremmende og tumorici-dal funksjoner avhengig av tilstedeværelsen av transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) [20], [21].
Fra disse studiene, er det klart at forskjellige inflammatoriske mediatorer blir uttrykt forskjellig i flere typer kreft, og kan stimulere utvikling av sykdommen [22]. Således, midler som hemmer disse inflammatoriske mediatorer representere potensielle mål for behandling av kreft. Den anti-inflammatoriske protein annexin 1 (ANXA1), et 37-kDa medlem av annexin-superfamilien, er en steroid-regulert protein som er implisert i mediering noen av de fordelaktige aktivitetene til glukokortikoider [23], inkludert regulering av celleproliferasjon [ ,,,0],24], differensiering [25] og metastasering [26].
feilregulering av ANXA1 har blitt rapportert i flere svulster, noe som tyder på at dette proteinet kan spille viktige roller i tumor utvikling og progresjon [27]. ANXA1 er overuttrykt i brystkreft [28] og leverkreft [29], men er markert nedregulert i esophageal [30], [31] og hode og nakke Kreftsvulster [32]. Men de molekylære mekanismer som ANXA1 modulerer cellulære responser er ikke helt klarlagt.
Fremskritt i dette området har vist en funksjonell kobling mellom de anti-inflammatoriske egenskaper ANXA1 og reseptor for formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) FPR [33], en spesifikk klasse av G-protein-koblede syv-transmembran-reseptorer [34]. Hos mennesker har tre familiemedlemmer blitt identifisert, FPR1, FPR2 /ALX (FPRL1) og FPR3 (FPRL2) [35]. Noen av effektene av eksogen ANXA1 kan dempes ved Boc2, en antagonist av både FPR1 og FPR2 [33]. Nylig har det blitt vist at den ANXA1 N-terminalt peptid, ANXA1
2-26, fremmer migrasjon av WS1 humane hudfibroblaster [36], og invasivitet av SKCO-15 kolorektal adenokarsinom-celler [24] gjennom interaksjon med FPRs. Men ingen data er tilgjengelig om rollen ANXA1 og FPRs i strupe plateepitelkarsinom.
Flere signalveier mekle betennelse-assosiert tumorigenesis. For eksempel er cyklooksygenase-2 (COX-2), et enzym som er involvert i omdannelsen av arakidonsyre til prostaglandiner, synes å spille en viktig rolle i utvikling av kreft ved å modulere celleproliferasjon og andre viktige biologiske prosesser via deres metabolitter, G-protein-koblet reseptorer og nedstrøms effektbokser [37]. COX-2 er oppregulert i flere maligniteter [38] – [40], inkludert hode og nakke Kreftsvulster [41]. Egentlig Abrahao et al. (2010) har vist at den pro-inflammatoriske COX-2 metabolitt prostaglandin E2 og dets EP3 reseptor kan aktivere hode- og hals-karsinomceller til å formere seg, og er et potensielt mål for forebyggende metoder. Tatt i betraktning at glukokortikoider er meget effektive inhibitorer av COX-2 ekspresjon [42], steroid-regulerte protein annexin A1, som er implisert i mediering noen av aktivitetene av glukokortikoider, også kan være involvert i den inflammatoriske nettverk knyttet til COX-2.
Gitt den potensielle rolle for ANXA1 i flere svulster som regulering av celleproliferasjon, differensiering og metastasering, vi fokusert på de molekylære mekanismer som ANXA1 modulerer disse cellulære responser. I denne rapporten viste vi at ANXA1 protein er nedregulert i menneskets strupekreft og kan regulere tumorvekst i en parakrint måte som formidles av reseptoren FPR2 /ALX. Undersøkelsen viser mulighetene betydningen av dette ANXA1 /FPR2 samhandling i tumorigenesis. Samlet denne studien identifiserte potensielle roller for den molekylære mekanismen for dette proteinet interaksjonen i strupekreft, herunder forholdet til prostaglandin sti, som gir bevis for potensialet for ANXA1 som et terapeutisk mål og lovende utgangspunkt for fremtidig forskning.
Materialer og metoder
vevsprøver
Menneskelige invasive strupekreft vev ble oppnådd fra 20 pasienter med strupe plateepitelkarsinom som ble behandlet på sykehuset de Base i São José do Rio Preto, Brasil . Pasientene var menn, alkohol røykere, deres alder varierte fra 50 til 80 år, og ingen av dem hadde fått strålebehandling eller cellegift før intervensjon. I hver pasient (n = 20), ble den kirurgiske tumorprøver samlet opp fra sentrum av den laryngeale tumor, ble peritumoral prøvene samlet opp fra tumor periferi, og kontrollprøver ble samlet fra regionen fri for tumorceller. På grunn av den høye heterogenitet for strupekreft, ble tumorvev dissekert og gjennomgått av en senior patolog og ble karakterisert som moderat differensierte, invasive karsinomer. Disse vevsprøver ble brukt i en tidligere undersøkelse som ble utført i vårt laboratorium, og antall pasienter som var tilstrekkelig til å oppnå statistisk signifikante data [32]. Studien protokollen ble godkjent av komiteen for etikk i forskning av føderale universitetet i São Paulo, School of Medicine, Brasil (CEP-0300/08), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene som er involvert.
Cell Culture
Hep-2 cellelinje, som opprinnelig ble etablert fra en epidermoid carcinoma i strupehodet, ble brukt i denne studien (ATCC, Rockville, Maryland, USA). Cellelinje autentisering ble utført ved hjelp av AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Life Technologies) ved spesielle teknikker Laboratory, Hospital Israelita Albert Einstein (LATE -HIAE), Sao Paulo. Vi har funnet 100% identitet av vår cellelinje sammenlignet med databasen American Type Culture Collection (ATCC). Cellene ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
6-celler i en 75-cm
to kulturflaske (Corning, NY, USA) og inkubert i MEM-Earle medium (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) , pH 7,5, supplert med 20% føtalt kalveserum (Cultilab), 1% ikke-essensielle aminosyrer, og 0,1% antibiotisk /antimykotisk oppløsning (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), ved 37 ° C i en fuktig atmosfære av 5% CO
2 [43].
Drug Treatment
For de farmakologiske forsøk, ble Hep-2 celler seeded som tidligere beskrevet. Tjuefire timer senere, etter at cellene hadde allerede fulgt, ble de inkubert i serumfritt medium for å synkronisere cellesyklusen. Etter ytterligere 24 timer ble mediet erstattet med komplett vekstmedium inneholdende det følgende: (a) 1 uM av ANXA1
2-26 peptid (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (Invitrogen); (B) 1 uM av ANXA1
2-26 peptid og 10 uM Boc2, et ikke-selektivt FPR antagonist (N-t-BOC-MET-LEU-PHE) (MP Biomedicals, Aurora, OH); (C) 0,01 mikrometer deksametason (et glukokortikoid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); (D) 0,01 mikrometer deksametason og 10 mikrometer Boc2; eller (e) 10 uM Boc2 alene. Medikamentene ble først oppløst i små mengder av dimetylsulfoksyd (DMSO) og deretter fortynnet i medium (sluttkonsentrasjonen av DMSO oversteg aldri 1%). Konsentrasjonene av stoffene ble valgt basert på foreløpige eksperimenter og litteraturdata [32], [44]. Kontrollcellene ble behandlet med komplett medium med den samme konsentrasjon av DMSO anvendt for å fortynne narkotika. 2 dager, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende de stoffer ved samme dose; cellen morfologi ble observert hver dag [43]. Etter 6, 24, 48, 72 og 96 timer, kontroll og behandlede celler ble høstet og telt ved bruk av grevinnen Automated celleteller (Invitrogen).
Fiksering, Processing, og bygge for Light og elektronmikroskopi
Laryngeal prøver og Hep-2-celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd, 0,5% glutaraldehyd, og 0,1 mol /l natrium-kakodylat-buffer (pH 7,4) i 24 timer ved 4 ° C, vasket i natriumkakodylat, dehydrert gjennom gradert prosenter etanol, og innebygd i LRGold (London Resin Co, Reading, UK). For histopatologiske og morfologiske analyser, ble vevssnitt (0,5-mikrometer tykk) kuttet på en ultramicrotome (Reichert ULTRACUT, Leica, Østerrike), farget med 1% toluidinblått i 1% boraks løsning (TAAB Laboratories, Aldermaston, UK) og undersøkt ved hjelp av en AXIOSKOP 2-Mot Plus ZEISS mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). For elektronmikroskopi, seksjoner (~90 nm) ble kuttet på en ultramicrotome og plassert på nikkel nett for immungullmerkings [45].
immungullmerkings av Post-innvevde vev
Immunocytochemistry reaksjon (dobbel merking) ble brukt til å påvise ekspresjon og samlokalisering av ANXA1 og FPR2 /ALX i mastceller, nøytrofile, og kontroll- og tumorceller fra strupehodet vev og Hep-2 celler.
de Hep-2 celler inkubert med kontroll medium, ANXA1
2-26 og ANXA1
2-26 + Boc2. Etter 48 timer ble kulturen høstet, og cellene ble innleiret i LRGold harpiks for immunocytokjemisk analyse. Ultratynne deler av laryngeale vev og Hep-2-celler ble inkubert i en trinn-for-trinn måte ved anvendelse av følgende reagenser og /eller betingelser ved værelsestemperatur: 1) Destillert vann; 2) 0,1 mol /l fosfatbuffer inneholdende 1% egg-albumin (PBEA); 3) 0,1 mol /l PBS inneholdende 5% PBEA i 30 minutter; 4) sau polyklonalt antistoff LCPS1, frembrakt mot den N-terminale segment av ANXA1 (1:500 i PBEA) og kanin-polyklonalt antistoff FPR2 /ALX (Abcam, Cambridge, UK) (1:500 i PBEA) i 2 timer; normal sau og kaninsera ble anvendt som kontroll (1:500); 5) tre vaskinger i PBEA inneholdende 0,01% Tween 20; 6), esel anti-sau IgG (Fc-fragment-spesifikke) antistoffer (1:100 i PBEA) konjugert til 15 nm kolloidalt gull (britisk Biocell, UK) ble tilsatt for å påvise ANXA1, og geite-anti-kanin-IgG (Fc-fragment -spesifikk) antistoff (1:100 i PBEA) konjugert til 10 nm kolloidalt gull (britisk Biocell) ble tilsatt for å påvise FPR2 /ALX). Etter 1 time, ble seksjonene vasket i PBEA inneholdende 0,01% Tween 20, og deretter i destillert vann [46]. Seksjonene ble farget med uranylacetat og føre citrate før eksamen på en ZEISS LEO 906 elektronmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).
Multiplex Analyser
For å kvantifisere proinflammatoriske cytokiner interleukiner 6 (IL-6) og IL-8 samt monocytt kjemotaktisk protein-1 (MCP-1), i Hep-2 cellekultursupernatanter brukte vi multiplex instrument Luminex Xmap MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) . Cellene ble inkubert med kontroll medium, ANXA1
2-26, ANXA1
2-26 + Boc2, Dexa, Dexa + Boc2 eller Boc2. Etter 48 timers behandling, ble kultursupernatantene fjernet, sentrifugert og lagret ved -20 ° C. Antistoff perler, kontroller, vaskebuffer, serum matrise og standarder ble fremstilt ved å følge produsentens instruksjoner (MILLIPLEX HCYTOMAG-60K kit). Deretter ble det tilsatt 200 ul vaskebuffer tilsatt til hver brønn av en magnetisk 96-brønns plate og blandet på en ristemaskin i 10 min. Vaskebufferen ble dekantert, og 25 ul av standarder, kontroller og prøver ble tilsatt til brønnene. Deretter ble 25 ul av analysebuffer tilsatt til prøvene, og 25 ul av serum matrise ble tilsatt til standarder. Til slutt ble 25 ul av magnetiske kuler (belagt med et spesifikt fangst-antistoff) tilsatt til alle brønner og inkubert over natten ved 4 ° C på en ristemaskin. Den neste dag ble platen vasket med vaskebuffer og inkubert med 25 ul av deteksjons antistoffer i 1 time på et risteapparat. Deretter ble 25 ul streptavidin-phycoerythrin tilsatt til hver brønn og inkubert i 30 minutter på en rister. Platen ble vasket og inkubert med 150 ul av drivfluid i 5 minutter på en rister. Endelig platen ble analysert ved hjelp MAGPIX med Xponent programvare [47].
Real-time PCR
De Hep-2 celler ble inkubert med kontroll medium, ANXA1
2-26 eller ANXA1
2-26 + Boc2 og høstet etter 48 timer. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol Reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Det genomiske DNA ble fjernet ved DNase-behandling i henhold til produsentens beskrivelse (Promega). Alikvoter (2 ug) av total RNA fra kontroll og behandlede celler ble anvendt for dobbeltkjedet cDNA-syntese ved bruk av en høykapasitets-cDNA-arkiv kit (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Fire forskjellig uttrykt gener (
EP3
eller
PTGER3
,
EP4
eller
PTGER4
,
MMP2 Hotell og
MMP9
) ble valgt for kvantitativ real-time PCR eksperimenter i henhold til deres direkte eller indirekte involvert i inflammatoriske og metastatiske prosesser basert på Gene ontologi database (https://www.geneonthology.org/). Real-time PCR ble utført i tre eksemplarer ved hjelp av en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaksjonsblandingen besto av en 20-pl totalt volum oppløsning inneholdende 10 ul av strøm SYBR grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems), en 1 mM oppløsning av hver primer og 20 ng cDNA. PCR-betingelsene var 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Smelting kurve analyse ble utført for hvert gen for å kontrollere spesifisiteten og identiteten av RT-PCR-produktene. For hver primer sett, ble real-time PCR effektivitet (E) målt i tre eksemplarer på serielle fortynninger av samme cDNA prøven ved hjelp av formelen E = [10 (-1 /skråning)]. De resulterende verdiene varierte 1,96 til 2,02. Hvert nivå-transkript ble normalisert til den indre standard
GAPDH
, og verdiene ble log2-transformert (y-aksen), slik at alle verdiene nedenfor -1 indikert ned-regulering i genekspresjon, mens verdier over 1 representert oppregulering sammenlignet med kontrollceller [43].
Statistical Analysis
verdiene gjelder kvantifisering av mastceller og neutrofiler i de vevsprøver in vivo ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av antall celler pr mm
2 i tre deler av 0,5 um (later et mellomrom på 40 um mellom hver seksjon) for hver enkelt pasient (n = 20 pasienter).
Hep-2-celler ble tellet ved bruk av grevinnen Automated celleteller (Invitrogen). Konsentrasjonen av cytokinene ble bestemt ved bruk MAGPIX Xponent programvare (Millipore Corporation). Den in vitro-analyser ble gjentatt minst tre ganger.
ultra og immunocytokjemi ekspresjon av ANXA1 og FPR2 ble bestemt ved anvendelse av ti celler for hver gruppe undersøkt. Arealet av hver cellerommet ble bestemt ved bruk Axiovision bildebehandling (Zeiss). I kjernen og cytoplasmaet, ble tettheten av kolloidale gullpartikler beregnet som gjennomsnitt ± SEM for antall partikler per um
2. I plasmamembranen, ble tettheten av kolloidale gullpartikler beregnet som gjennomsnitt ± SEM for antall partikler pr um.
signifikante forskjeller mellom de midler ble bestemt ved hjelp av analyse av varians. Denne testen ble etterfulgt av Bonferroni post-hoc test på utvalgte eksperimentelle grupper som bruker Graph-Pad Prism 4.0 (Graph-Pad, San Diego, CA, USA). En sannsynlighet verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
The Presence of Degranulated mastceller og en Tilstrømningen av nøytrofile Indikerer Betennelse i svulstens mikromiljø
Å verifisere samspillet av betennelsesceller med strupehodet tumorceller, utførte vi histologisk analyse i strupehodet vevsprøver å kvantifisere mastceller og nøytrofile, viktige celler av den inflammatoriske respons. I kontrollprøver, observerte vi intakte mastceller med metachromatic granulat i umiddelbar nærhet til blodårer (Fig. 1a). I peritumoral og tumor stroma, vi bekreftet nærværet av degranulated mastceller (Fig. 1, B og C). I tillegg observerte vi nøytrofiler som hadde transmigrated inn i tumorsnitt (fig. 1 D).
(A-D) Representative bilder (opprinnelig forstørrelse, × 63) av toluidinblått-fargede vevssnitt fra strupehodet prøver. (A) Kontroll laryngeal prøven viser intakte mastceller (kurve piler) i nærheten blodkar. Peritumoral (B) og tumor (C) prøver med degranulated mastceller (åpen kurve piler). (D) Tumorceller med mitotisk aktivitet (åpen pil) og inflammatoriske celler, som ekstravaskulære neutrofiler (piler). (E) Totalt antall mastceller. (F) Intakte og degranulated mastceller. (G) Totalt antall nøytrofile. (H) Ekstra og intravaskulære nøytrofile. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av celletallet pr mm
2 (n = 20 pasienter pr gruppe). Enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni-test viste en signifikant forskjell mellom gruppene. ***
P
0,001
vs
kontroll, ###
P
. . 0.001
vs
peritumoral. Skala barer:. 5 mikrometer
Statistisk analyse viste at det var høyt antall mastceller i kontroll deler av strupehodet og betydelig færre mastceller i peritumoral og svulst regioner (
P
0,001 fig. 1E). Videre intakte mastceller var mer rikelig i kontrollprøver og betydelig lavere i peritumoral og tumorsnitt (
P
0,001 Fig. 1F). Ved hjelp av kvantitativ analyse av de nøytrofile celler, har vi bekreftet at det var en signifikant økning i disse cellene i tumorvevet (
P
0,001) sammenlignet med kontroll og peritumoral vev (figur 1G.). Undersøkelse av nøytrofiler i kontroll og peritumoral seksjoner viste at de fleste av disse celler ble lokalisert i blodkar (fig. 1 H). I motsetning i tumorprøver, observerte vi et betydelig antall transmigrated nøytrofile i stroma (
P
0,001 sammenlignet med kontroll og peritumoral prøver). (Fig. 1 H)
Up -Regulation av ANXA1 /FPR2 i betennelsesceller of human Strupe Svulster
ultrastructural immunocytochemistry viste for første gang uttrykk for FPR2 /ALX og dens samlokalisering med ANXA1 i mastceller (fig. 2, A- C). De mastceller og nøytrofile vises ANXA1 og FPR2 /ALX immunoreaktivitets i plasmamembranen, cytoplasma og cellekjernen (fig. 2, A-F). Ingen immungull merking ble påvist i seksjoner som ble inkubert med ikke-immune serum (data ikke vist). I disse inflammatoriske celler, verifisert vi en betydelig oppregulering av ANXA1 og FPR2 /ALX uttrykk i peritumoral og tumorprøver sammenlignet med tilsvarende kontroll vev (fig. 2, G-L).
Immunolabeling med 10 -Nm (FPR2 /ALX) og 15-nm (ANXA1) kolloidale gull partikler. Mastceller (A-C) og neutrofiler (D-F) viser subcellulære lokalisering av ANXA1 (piler) og FPR2 /ALX (pilhoder), og ko-lokalisering (kurve piler) i plasmamembranen, cytoplasma og kjernen (N) av kontroll, peritumoral og tumorvev. Tetthet av gullpartikler konjugert med ANXA1 og FPR2 /ALX i mastceller (G-I) og nøytrofile (J-L). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av kolloidale gull-partikler pr pm i plasmamembranen og pr um
2 i cytoplasma og cellekjernen (n = 10 celler per gruppe). Enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni-test viste en signifikant forskjell mellom gruppene. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001
vs
kontroll, ##
P
0,01, ###
P
. 0,001
vs
peritumoral. Farget med uranylacetat og føre citrate. Skala barer: 1 um
Kvantitativ analyse viste at det ikke er høyere ekspresjon av ANXA1 og dens reseptor i cytoplasma og cellekjernen, sammenlignet med det i plasmamembranen (fig 2, G-L.).. Ko-lokalisering av ANXA1 og FPR2 /ALX ble observert i plasmamembranen, cytoplasma og cellekjernen av mastceller og neutrofiler (figur 2, G-L.); men det var signifikant forskjell bare i plasma membran av peritumoral nøytrofile (Fig. 2J).
ANXA1
2-26 hemmer FPR2 /ALX Receptor-mediert spredning av Hep-2 strupekreft Cells
Omtrent 87% til 97% av Hep-2 celler var levedyktig under eksperimentelle forhold (kontroll, ANXA1
2-26, ANXA1
2-26 + Boc2, Dexa, Dexa + Boc2 og Boc2) ( S1 figur). Imidlertid vekstkurven til disse cellene viste signifikante forskjeller mellom de betingelser undersøkt (Fig. 3).
Behandling med ANXA1
2-26 redusert cellevekst. Den antagonist Boc2 delvis hemmet anti-proliferativ effekt av ANXA1
2-26. Cellene ble behandlet med Boc2 alene viste en grad av spredning lik den for kontrollen. De Hep-2-celler ble sådd ut i MEM-Earle medium ved en tetthet på 2 x 10
6-celler i 75-cm
to kulturflaske, og deretter ble inkubert med serumfritt medium 24 timer før tilsetningen av ANXA1
2-26 (1 mm), ANXA1
2-26 (1 mm) + Boc (10 mm) eller Boc (10 mm) alene. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer for å bekrefte resultatene. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av celletallet x 10
6. **
P
0,01 og ***
P
0,001
vs
kontroll, ##
P
. 0,01 og # ##
P
0,001
vs
ANXA1
2-26 + Boc
Behandling med peptidet ANXA1
2-26.. betydelig redusert spredning av Hep-2 laryngeale kreftceller sammenlignet med kontrollceller (
P
0,001 ved 48 og 96 timer, og
P
0,01 til 72 timer). Lignende resultater ble oppnådd etter behandling med Dexa og Dexa + Boc2 (S2 figur). Men kombinasjonsbehandling med ANXA1
2-26 og Boc2 (ANXA1
2-26 + Boc) betydelig utvidet cellevekst sammenlignet med ANXA1
2-26-behandlede celler (
P
0,001 på 96 timer), som viser at Boc2 dempes den antiproliferative aktivitet av ANXA1
2-26. Boc2-behandlede celler hadde en proliferativ sats som var lik som kontrollceller (Fig. 3).
Tap av ANXA1 /FPR2 Protein i Laryngeal tumorvev og oppregulering etter
In Vitro
Behandling med ANXA1
2-26 Peptide
de epitelceller av kontroll, peritumoral og kreft laryngeal vev vises immunoreaktivitets til ANXA1 og FPR2 /ALX, samt co-lokaliseringer av proteiner, i plasmamembranen, cytoplasma og cellekjernen (fig. 4, A-C). I de peritumoral og tumorprøver, ble det observert en markert reduksjon av ANXA1 og FPR2 /ALX protein ekspresjon sammenlignet med de tilsvarende kontroll vev (Fig. 4, H og I). Kvantitativ analyse viste at det ikke var høyere ekspresjon av ANXA1 og dens reseptor i cytoplasma og cellekjernen og lavere ekspresjon i plasmamembranen (fig. 4, G-I). Forskjeller i graden av ANXA1 /FPR2 samlokalisering nådde ikke statistisk signifikans blant strupehodet prøver (Fig. 4, G-I).
Immunolabeling med 10-nm (FPR2 /ALX) og 15-nm (ANXA1) kolloidale gull partikler. (A-C) Epithelial kontroll, peritumoral og tumorceller fra strupehodet vev. (D-E) Hep-2-celler som viser immunoreaktiviteten til ANXA1 (piler), FPR2 (pilhoder), og ko-lokalisering (kurve piler) i plasmamembranen, cytoplasma og kjernen (N). Desmosomes (åpen kurve piler) blir oppdaget mellom disse cellene. (F) Fraværet av immunoreaktivitets til ANXA1 og FPR2 /ALX i celler inkubert med ikke-immune serum. Tetthet av gullpartikler konjugert med ANXA1 og FPR2 /ALX i epitelceller (G-I) og Hep-2 celler (J-L). Hep-2-celler ble sådd ut i MEM-Earle medium ved en tetthet på 2 x 10
6-celler i 75-cm
2 kulturflasker, og deretter ble inkubert med serumfritt medium 24 timer før tilsetningen av ANXA1
2-26 (1 mm) og ANXA1
2-26 (1 mm) + Boc2 (10 mm). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av kolloidale gull-partikler pr pm i plasmamembranen og pr um
2 i cytoplasma og cellekjernen (n = 10 celler per gruppe). Enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni-test viste en signifikant forskjell mellom gruppene. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001
vs
kontroll, #
P
0,05, ##
P
0,01, ###
P
0,001
vs
ANXA1
2. 26. Farget med uranylacetat og føre citrate. Skala barer:. 1 mikrometer
Hep-2 celler som ble behandlet med ANXA1
2-26 eller ANXA1
2-26 pluss Boc2 viste immunoreaktivitets for ANXA1 og FPR2 /ALX (Fig . 4, D og E). Ko-lokalisering av de to proteiner ble påvist i plasmamembranen, cytoplasma og cellekjernen av disse cellene, men ikke i Boc2-behandlede celler (Fig. 4, D og E). Ingen gull merking ble påvist i celler som ble inkubert med ikke-immune serum (fig. 4 F). ANXA1 /FPR2 ekspresjon ble nedregulert i plasmamembranen, men ble øket i cytoplasma og cellekjernen av Hep-2-celler (fig. 4, J-L). Behandling med ANXA1
2-26 vises oppregulering av ANXA1 og FPR2 i cytoplasma og cellekjernen sammenlignet med tilsvarende kontrollcellene (fig. 4, J-L). Videre har vi oppdaget markert reduksjon av ANXA1 protein og dets reseptor etter ANXA1
2-26 + Boc2 behandling sammenlignet med ANXA1
2-26-behandlede celler (Fig. 4, J-L).
