Abstract
DRAM er en lysosomal membranprotein og er kritisk for p53-mediert autofagi og apoptose. DRAM har et potensial tumor-undertrykkende funksjon og er nedregulert i mange humane krefttyper. Imidlertid er regulering av DRAM ekspresjon dårlig beskrevet så langt. Her viste vi at serum deprivasjon sterkt induserer DRAM uttrykk i leverkreftceller og en kjerne DNA sekvens i DRAM promoter er avgjørende for sin respons til serum deprivasjon. Vi har videre observert at eukromatin markører for aktive transkripsjonene representert ved diacetyl-H3, tetra-acetyl-H4 og den trimetyl-H3K4 i kjernen promoter-regionen i DRAM-genet er tilsynelatende økes i en tidsavhengig måte ved serum deprivasjon, og samtidig det dimetyl -H3K9, en herterochromatin markør assosiert med forstummet gener, var tidsavhengig redusert. Videre er kromatin remodeling faktor Brg-en anriket i kjernen promoter regionen av DRAM-genet og er nødvendig for serum deprivasjon indusert ekspresjon DRAM. Disse observasjonene legge grunnen for videre undersøkelse av DRAM genuttrykk
Citation. Ni P, Xu H, Chen C, Wang J, Liu X, Hu Y, et al. (2012) Serum Sult induserer DRAM Expression i leveren kreft celler via histonmodifikasjonene innen Dens Arrangøren Locus. PLoS ONE 7 (12): e50502. doi: 10,1371 /journal.pone.0050502
Redaktør: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 27 mars 2012; Godkjent: 24 oktober 2012; Publisert: 12.12.2012
Copyright: © 2012 Ni et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science and Technology Committee of Shanghai Metropolitan (11ZR1423100); Foundation National Science of China (gi No .: 30772233, 30873057 til Y. Lu, og 81.172.028 til Z. Hou); Key Basic Prosjekt av Shanghai Science and Technology Commission (No .: 08JC1413600); Shanghai Committee of Science and Technology (11DZ2260200); og 985 Tumor Joint Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Inaktivering av celledødsveier er en sentral del av kreft progresjon [1]. Forskjellige mekanismer eksisterer i normale humane celler for å påkalle celledød og fjerne skadede celler som kan vokse abnormt å danne svulster [2] – [4]. Under normale forhold macroautophagy (heretter omtalt som «autofagi») er en strengt regulert membran-trafficking prosess for nedverdigende og gjenvinning av cytosoliske proteiner og organeller på basalnivåer. Det kan induseres over basalnivået som respons på forskjellige stimuli, inkludert nærings sult, infeksjon, genotoksiske midler eller cytokiner [5] – [8]. Autophagy kan fungere i ulike sammenhenger til enten fremme eller hemme celleoverlevelse [1], [5], [7], [9] – [11], som tyder på at den kan spille en viktig patologisk rolle i karsinogenese
human
DRAM
(skade regulert autofagi modulator) genet ble identifisert som et p53-aktivert gen som koder for en høyt konservert lysosomale membranprotein, og består av 238 aminosyrer i lengde [12]. DRAM er ikke bare viktig for evnen av overuttrykt p53 eller DNA-skade-aktivert p53 for å modulere autofagi [13], men også for p53 evne til å indusere apoptose [9]. DRAM er spesifikt lokalisert til lysosomer, et organeller som deltar i det siste trinnet av autophagy [12]. Derfor er det sannsynlig at DRAM kan regulere autophagosome-lysosomet fusjon, en prosess som er nødvendig for generering av autophagolysosomes.
Det har vist seg at DRAM har en potensiell tumor-undertrykkende funksjon og er nedregulert i mange humane cancere [ ,,,0],12]. Den nedregulering av DRAM-mRNA i disse kreftceller skjer både ved direkte hypermethylation innenfor CpG øy i promoterregionen av dette gen og ved andre, som ennå uidentifiserte, mekanismer for eksempel epigenetiske modifikasjoner av kjerne histoner i nærheten av DRAM-genet [12]. I denne rapporten karakteriseres vi den menneskelige DRAM genet promoter og identifisert DNA sekvenser avgjørende for reguleringen.
Resultater
Serum sult stimulerer DRAM uttrykk i leverkreftceller
deprivasjon av serum induserer apoptose og autofagi i mange celletyper, inkludert HepG2 og HepB3 celler. Disse observasjonene bedt oss om å undersøke om serum sult kan indusere DRAM uttrykk i leveren kreftceller. HepG2 og Hep3B celler ble dyrket til 70% konfluens i DMEM inneholdende 10% FBS. Disse cellene ble vasket med PBS tre ganger, og ble foret med media utelate FBS i forskjellige tidsperioder. De resulterende cellene ble høstet og de totale RNA ble ekstrahert. Ekspresjon av DRAM mRNA ble undersøkt ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR). I begge HepG2 og Hep3B celler mRNA av DRAM ble signifikant indusert 24 timer etter serum deprivasjon, og nådd det høyeste nivå etter 48 timer (figur 1A, B) på en lignende måte, noe som tyder på at serum deprivasjon induserer DRAM ekspresjon i leverkreftceller . Nivået av DRAM-proteiner i HepG2 celler ved forskjellige tidspunkter ble undersøkt ved Western blot analyser. Konsekvent til uttrykk av DRAM mRNA observert av QRT-PCR, ble DRAM protein svakt detektert på 3 timer etter serum deprivasjon og nådde høyt nivå ved 24 og 48 timer etter serum savn (figur 1C).
(A) mRNA nivået av DRAM-genet ved serum mangel ved forskjellige tidspunkter ble kvantifisert ved sanntids RT-PCR i HepG2-celler. (B) DRAM uttrykk i Hep3B celler er lik den som er observert i HepG2 celler. (C) Analyse av DRAM protein ekspresjon i HepG2-celler. CD166 fungert som en positiv kontroll for serum sult indusert protein uttrykk. Celler ble dyrket til 70% konfluens i DMEM inneholdende 10% FBS. Disse cellene ble vasket med PBS og foret med DMEM media utelate FBS for forskjellige tidspunkter. De resulterende cellene ble høstet og de totale RNA og hele cellelysater ble ekstrahert og ekspresjon av DRAM-mRNA og protein ble undersøkt ved QRT-PCR eller western blot. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (D) Inhibering av proteinsyntese ikke påvirker serum sult-indusert DRAM ekspresjon i HepG2-celler. Celler ble behandlet med CHX (10 mM) under serum-deprivasjon i 24 timer, og total RNA ble ekstrahert for analyse av DRAM-ekspresjon ved sanntids-PCR. Alle resultater er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. **,
p
. 0,01 nivå ved hjelp av t-test
For å avgjøre om nye proteinsyntese var nødvendig for serum deprivasjon å indusere DRAM uttrykk, Cycloheximide (CHX) ble påført til serumfritt medium i 30 minutter for å inhibere ny proteinsyntese. Forbehandling av HepG2-celler med CHX hemmet ikke serumet berøvelse indusert ekspresjon DRAM (figur 1D), noe som tyder på at oppregulering av DRAM uttrykk er uavhengig av proteinsyntese i HepG2 celler.
Den proksimale delen av DRAM-promoteren er følsom for Nukleasefordøyelse
for å identifisere de regulatoriske elementer som respons på serum deprivasjon i DRAM arrangøren, vi først satt ut for å bestemme transkripsjon start hotellet (TSS) av DRAM-genet ved å bruke 5 «RACE analyser . DNA-sekvensering bekreftet at tre PCR-produktene betegnet som produkt 1 (~216 bp), produkt 2 (~172 bp), og produkt 3 (~106 bp) var direkte presiseringer fra 5»-UTR av DRAM-genet (figur 2A). Den nederste band (~47 bp) i gelen var ikke-spesifikk amplifikasjon av primerne selv. De første nukleotider for produkt 1, 2 og 3 ble identifisert som henholdsvis A, T og A (figur 2B). Produkt 1 og produkt 2 var 65 bp og 20 bp oppstrøms, mens produktet 3 var 107 bp nedstrøms for første nukleotid av DRAM cDNA sekvens funnet i Gene Bank of National Center for Biotechnology Information (Gene ID: 728655). For praktisk beskrivelse heretter, vi vilkårlig referert nukleotidet A i produktet en som TSS (1).
(A) agarosegel viste flere 5’RACE PCR-produkter. (B) Kartlegge potensialet TSS av
DRAM genet
. Pilen indikerte nestet omvendt 5’RACE primer. Den GeneRacer PCR, basert på RNA-ligase-mediert og oligo-capping hurtig amplifikasjon av cDNA, ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. PCR-produktene ble løst på agarosegel, og mulige bånd ble oppsamlet og bekreftet ved DNA-sekvensering. * Indikerer en uspesifikk forsterkning av primer dimmere.
For ytterligere å gi ledetråder i jakten på de regulatoriske elementer på DRAM promoter, utførte vi CHART-PCR-analyser for å vurdere tilgjengeligheten av DRAM promoter DNA til Nukleasefordøyelse. Kjerner isolert fra HepG2 og Hep3B cellene ble utsatt for kutting med DNase I eller MNase og de oppnådde genomiske DNA-fragmenter mellom -7216 og + 289 bp (i forhold til plasseringen av TSS) ble analysert ved hjelp av kvantitative PCR-analyser (figur 3A). Dataene ble presentert som prosenten mellom intakt DNA fra nuklease-behandlede prøver og de ubehandlede, og var omvendt reflekterte andel av det beskyttede DNA. DNA-fragmentene som strekker seg over den proksimale promoter (R5, R6 og R7) var mer følsomme for DNase I og MNase fordøyelse, med særlig R6 (-144 til 72) som oppviser den laveste beskyttelse av ~35% i begge cellene undersøkt, mens høyere nivåer av beskyttelse mot DNase i eller MNase fordøyelse ble observert på R1 og R2-regionen, noe som indikerer at DNase i og MNase tilgjengeligheten er begrenset til den proksimale promoter-regionen, spesielt til R6 regionen (figur 3B).
(A) Skjematisk representasjon av primersettene som brukes for SKJEMA-PCR. (B) R6 region av DRAM-promoteren er mer følsom for DNase I og MNase fordøyelse. Det genomiske DNA ble isolert fra Hep3B og HepG2-celler og analysert ved hjelp av kvantitativ PCR. Dataene ble vist som prosent av fordøyde DNA til ufordøyde DNA. (C) Serum deprivasjon øker tilgjengeligheten til R5, R6 og R7 regioner til Nukleasefordøyelse i Hep3B og HepG2 celler.
For å undersøke effekten av serum deprivasjon på DNA tilgjengeligheten av DRAM arrangøren til DNase jeg og MNase fordøyelse, ble kjerner isolert fra HepG2 og Hep3B celler dyrket i serumfritt medium i 48 timer utsatt for Nukleasefordøyelse og diagram-PCR-analyse. Tilgjengeligheten til alle R5, R6 og R7 regioner for å Nukleasefordøyelse ble betydelig økt i begge celler ved serum deprivasjon med R6 regionen viser minst beskyttelsesnivået (figur 3C). Sammen er disse dataene implisere at den proksimale delen av DRAM arrangøren inneholder antatte cis-regulatoriske elementer som reagerer på serum mangel.
Serum sult induserer endringer i histone modifikasjon på DRAM arrangøren loci
For ytterligere styrke den observasjon at den proksimale delen av DRAM arrangøren inneholder antatte cis-regulatoriske elementer til serum deprivasjon, vi undersøkte histone modifikasjon status på dette locus bruker chip analyser. Histon acetylations slik som lysin acetylering på H3 og H4 er generelt kjent for å være assosiert med aktivt transkriberte gener og åpen kromatinstruktur [14] – [16]. Antistoffer som er spesifikke for diacetylated H3 (K9 og K14) og tetra-acetylert H4 (K5, K8, K12 og K16) ble anvendt for å utføre brikken analyse for å bestemme mønsteret av histonmodifikasjonene i DRAM-promoteren locus med eller uten serum. I Hep3B celler både H3 og H4 ble acetylert ved den R1, R6 og R7 region, med R6-locus som viser det høyeste nivå acetylering. Den histon Acetyleringen ble tilsynelatende øket i en tidsavhengig måte ved serum deprivasjon ved R6 og R7 regioner, men ikke den R1-regionen (figur 4A, B)
Hep3B celler ble fremstilt for kromatin IP (chip) analyser . De kromatin DNA ble immunoutfelt med antistoffer som er spesifikke for H3K4me3 (A), anti-di-acetyl-H3 (B), anti-H3K9me2 (C) og anti-tetra-acetyl-H4 (D), og den anrikede DNA-fragmenter som flankerer DRAM-promoteren ble analysert ved kvantitativ PCR. Resultatene ble angitt som mengden av DNA gjenvunnet ved spesifikke antistoffer i forhold til DNA-beriket av de passende IgG kontrollene. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. *: P 0,05
Deretter undersøkte vi histone metylering status på locus av DRAM promoter.. Den trimetyl-H3K4, en euchromatic markør [17] – [18], viste et lignende mønster med Diacetyl-H3 og tetra-acetyl-H4 i Hep3B celle (figur 4C), mens det dimetyl-H3K9 ble skåret lavest i R6 region hos basal nivå og ble redusert med langvarig serum sult (figur 4D). Den dimetyl-H3K9 fungerer som et signal for kromatin lyddemping ved å rekruttere de HP1 proteiner (heterochromatin protein 1) og er gjensidig utelukkende med H3-K9 acetylering [19]. Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at transkripsjonen aktivering av DRAM-genet er korrelert med økt lokal euchromatic markører og samtidig redusert heterochromatic markører.
NF-kB er ikke ansvarlig for aktivering av DRAM arrangøren
for å identifisere de minimale regulatoriske elementer til serum deprivasjon i DRAM promoter, ble ulike fragmenter av den proksimale DRAM arrangøren satt inn oppstrøms for ildflue luciferase reporter vektor. Den transkripsjonelle aktivitet av disse konstruksjonene ble analysert i Hep3B og HepG2-celler. Reporteren som inneholder -1741 /+ 299 fragment bare svakt svarte til serum deprivasjon, mens journalistene som inneholder -863, -75, 19 /+ 299 fragmenter vises betydelige høy luciferasepreparater aktiviteter i lydhør overfor serum deprivasjon. Påfallende, reporteren som inneholder + 28 /+ 299 fragment viser ingen aktivitet til serum deprivasjon (figur 5A). Disse data indikerer at cis-regulerende elementer til serum deprivasjon i DRAM-promoteren er bosatt regionen som flankerer -19 /+ 28 nukleotider (figur 5B). Arrangøren reporter som inneholder den korteste DNA fragment som omfatter -19 /+ 28 region ble kåret som Luc-DCP heretter.
(A) Hep3B og HepG2 celler ble transient transfektert med reporter plasmider som inneholder avkortede versjoner av promoter-regionen
DRAM
genet som angitt. Luc-DCP er definert som rapportørinneholdende den korteste promoter-regionen (-19~ + 28). (B) Kjernen promoter-regionen inneholder en antatt NF-kB-bindingssete. Transkripsjonsfaktorbindingsseter som er presentert i kjernen promoter-regionen (-19~ + 28) ble forutsagt av web programvare TFSEARCH og MatInspector og mutasjon eller delesjons plasmider ble samlet inn ved bruk av seterettet mutagenese metode. (C) Mutasjon eller sletting av NF-kB bindingssetet ikke påvirker kjerne promoter aktivitet.
I et forsøk på å søke etter potensielle transkripsjonsfaktor bindingssteder i -19 /+ 28 region, vi neste utført omfattende bioinformatiske analyse og fant en kanonisk NF-kB-bindingssetet bosatt i denne regionen. For å bekrefte om dette antatte NF-kB-bindingssetet er funksjonell, har vi gjort sletting og mutasjon i dette området (figur 5B). Overraskende, sletting eller mutasjon av dette NF-kB-bindingssetet hadde tilsynelatende ingen effekt på arrangøren aktivitet i lydhør overfor serum deprivasjon (figur 5C). Disse dataene antyder at andre faktorer, ikke NF-kB kreves for DRAM induksjon av serum mangel.
Sentrale komponenter av transkripsjon maskineri komplekset er bundet til den proksimale delen av DRAM arrangøren
Brg i og RNA-polymerase II er viktige komponenter av RNA-polymerase II holoenzymes som deltar i gentranskripsjon [20]. Den kromatin fra Hep3B og HepG2-celler ble høstet og utfelt med anti-Brg I og anti-Pol II-antistoffer. De utfelte DNA ble evaluert ved sanntids-PCR. Brg I bundet mest til DNA ved R6-regionen i begge cellene, mens Pol II bindes til R6 og R7 regioner med høyere affinitet enn den for R4 regionen (figur 6A). Påfallende, serum deprivasjon resultert i en økt binding av Brg I og Pol II til DNA ved R6 regionen og slike økninger ble sett så tidlig som 5 min etter serum deprivasjon og nådde det høyeste nivået på 30 min i begge celler henholdsvis (figur 6B).
(A) Brg-en er bundet til den proksimale delen av DRAM-promoteren. Chip ble utført i Hep3B og HepG2 celler. (B) Serum deprivasjon forbedrer Brg-1 og Pol II binding til DRAM-promoteren locus. (C) Nedbryting av Brg-en ved hjelp av spesifikke målgruppe shRNA opphever serum deprivasjon indusert DRAM uttrykk.
Brg-1 er nødvendig for serum deprivasjon induksjon av DRAM uttrykk
For å undersøke hvilken rolle av Brg jeg i induksjon av DRAM uttrykk, ble HepG2 celler transfektert med siRNA oligos spesifikt mot BRM eller Brg jeg i 24 timer, etterfulgt av RT-PCR-analyser (figur 6C, venstre panel). Induksjon av DRAM uttrykk ved serum deprivasjon ble avskaffet ved nedbryting av Brg I. Men visste knockdown av BRM ikke påvirke uttrykket av DRAM (figur 6C). Disse resultater viser at Brg-I er essensiell for DRAM induksjon i respons på serummangel.
diskusjon
DRAM har en potensiell tumor-undertrykkende funksjon og er kritisk for p53 for å modulere autofagi og apoptose [ ,,,0],12]. Derfor vil oppdagelsen av regulatoriske forhold som styrer DRAM uttrykk gi mål for nye behandlingsformer. Imidlertid er regulering av DRAM ekspresjon dårlig beskrevet så langt. Her har vi demonstrert for første gang at serum deprivasjon sterkt indusert DRAM uttrykk i leveren kreft HepG2 og Hep3B celler og identifisert en kjerne DNA sekvens i DRAM arrangøren, som er avgjørende for sin respons til serum mangel.
Tidligere DRAM ble identifisert som en p53-induserte genet og en funksjonell p53-responselement er lokalisert på 2,3 kb oppstrøms for DRAM-promotoren [21]. Her har vi vist at serum sult induserer DRAM ekspresjon i HepG2, en p53-positiv celle, og Hep3B, en p53-negative celler i en lignende måte, noe som tyder p53 ikke kan være en viktig faktor som er involvert i denne induksjons [22]. Men det er en stor interesse for å se om det er noe samarbeid mellom p53and serum deprivasjon i reguleringen av DRAM uttrykk.
Våre data viste at jo lenger fragment (-1714) svakt svarte til serum sult. Vi postulerer at i et lengre fragment eksisterer det undertrykkende cis-elementer som kan redusere den basale aktivitet av DRAM-promoteren. Den korte versjonen av arrangøren ikke inneholder slike elementer, og vise høy transkripsjonen aktivitet
acetvlering og metylering på lysin rester av kjerne histone haler er kritisk for gentranskripsjon [23] -. [24]. Acetylations av lysiner med H3 og H4 er generelt kjent for å være assosiert med aktivt transkriberte gener og åpen kromatinstruktur [15] – [16], [25]. Konsekvent, observerte vi at i Hep3B og HepG2 celler lysin acetylering på H3 og H4 var tilsynelatende øket i en tidsavhengig måte ved serum deprivasjon i kjernen promoter-regionen i DRAM-genet. Den trimetyl-H3K4, en euchromatic markør for aktiv transkripsjon, vises et lignende mønster med Diacetyl-H3 og Tetra-acetyl-H4 i Hep3B celle. I kontrast, ble dimetyl-H3K9 scoret lavest i R6 regionen på basal nivå og var tidsavhengig redusert ved serum deprivasjon. Den dimetyl-H3K9 fungerer som et signal for kromatin lyddemping ved å rekruttere de HP1 proteiner og er gjensidig utelukkende med H3-K9 acetylering. Disse data tyder på at serum deprivasjon kan indusere samarbeid montering av histone acetyltransferases, deacetylases og metyltransferaser, transkripsjonen kompleks til målet kromatin å endre histone koder. Vi er imidlertid ikke klart hvilke histone modifikatorer blir rekruttert til dette locus. Interessant, observerte vi at endringer i undertrykkende til aktive histon merker finne sted i første 15 minutter, og ikke endrer seg vesentlig i det hele tatt til 24 timer, mens den mRNA fra DRAM ble gradvis øket, og nådde høyt nivå inntil etter 24 timer og 48 timer. Denne tilsynelatende forsinkelse av DRAM-mRNA-ekspresjonen kan være på grunn av tiden for montering av transkripsjon maskineri til effektivt å drive DRAM-genekspresjon. Imidlertid må den eksakte mekanisme for å bli belyst. Foreløpig er vi forsøker å identifisere potensielle protein komplekser som kan bindes til denne kjernen DNA sekvensen ved hjelp DNA nedtrekk og massespektrometri tilnærminger og har identifisert flere proteiner inkludert p300 som potensielt kan binde seg til kjernen formidler av DRAM. Deres roller i reguleringen av DRAM uttrykk blir nå grundig avhørt.
tumor suppressor Brg-en er en sentral komponent i SWI /SNF chromatin- ombygging kompleks [26]. Dette komplekset kan aktivere gentranskripsjon ved ombygging kromatinstruktur på forstyrrende DNA-histone interaksjoner på nucleosomes. Vi demonstrerte at Brg-1 er anriket i kjernen promoter regionen av DRAM-genet og er nødvendig for serum deprivasjon indusert ekspresjon DRAM.
Proteinet BRM (Brahma) kan erstatte Brg-1 og oppfylle helikasen /ATPase funksjon av komplekset in vitro. Imidlertid Brg-1 og BRM ikke er funksjonelt utbyttbare in vivo. Homozygot
Brg1
knockout embryoene dø før implantasjon og heterozygote mus er utsatt for å utvikle epiteltumorer [26] – [27], mens
BRM
knockouts er levedyktig og ikke utvikle svulster [28] – [29]. Konsekvent, uttømming av Brg-en i HepG2 celler avskaffet serum deprivasjon indusert DRAM uttrykk, mens utarming av BRM ikke påvirke DRAM uttrykk. BRG-1 har vist seg å spille sentrale roller i regulering av celle apoptose og autofagi, men underling mekanismene er uklar. Identifisering av DRAM er et direkte mål for BRG-en vil kaste nytt lys over den molekylære reguleringen av autofagi.
Materialer og metoder
Cell kultur, transfections og plasmider
HepG2 og Hep3B-celler (ATCC) ble opprettholdt i DMEM inneholdende 10% FBS (Gibco), 2 mM L-glutamin og penicillin (50 U /ml) /streptomycin (50 ug /ml) ved 37 ° C under 5% CO
2 i en fuktet kammer.
Celler transfeksjon ble utført ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. SiRNA oligoer spesifikt rettet mot BrgI (CGCGCUACAACCAGAUGAATT), BRM (GGAUUGUAGAAGACAUCCATT) eller negativ kontroll (rykke RNA, UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) ble kjøpt (GenePharma Co., Ltd, Shanghai, Kina).
Revers transkripsjon PCR (RT-PCR )
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen). Reaksjonsblandingen (20 ul) inneholdende 1 ug total RNA ble revers transkribert til cDNA i bruken av PrimeScript RT-polymerase (Takara). De resulterende cDNA ble analysert ved hjelp av kvantitativ PCR (Mx3000P real-ime PCR System, Stratagene, La Jolla, CA, USA) med primerpar spesifikke for DRAM og GAPDH. Data ble presentert som prosenter av det totale mRNA nivåer av DRAM mot β-actin.
5′-RLM-RACE
GeneRacer system (Invitrogen), basert på RNA-ligase-mediert og oligo -capping rask forsterkning av cDNA, ble utført i henhold til produsentens anvisninger. Settet sikrer forsterkning av bare full lengde-transkripter ved å eliminere avkortede meldinger fra amplifikasjonsprosessen. DRAM-spesifikke primere (F, TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAGC, R, GCGAGCTCCAAGCGGACGCGACTAC) ble brukt til forsterkning av PCR der LaTaq GC-Rich PCR system (Takara, Inc., Dalian, Kina)
Chromatin tilgjengelighet analyse
.
tilgjengelighet av DNA til DNase fordøyelse og MNase (Takara, Inc., Dalian, Kina) ble analysert ved hjelp av kromatin tilgjengelighet gjennom SKJEMA-PCR som beskrevet tidligere [30] – [31]. Analysene ble gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre. Primerpar for ulike regioner som følger: R1 (F: TCCAACCCTCATGGATGGCTTTTAG; R: ATTCAGTCACATCTTCAGGCTCTAC); R2 (F: ATGAATCAGTAGTAGGGCACGAAAG; R: CAGCCTGGTCAACAGATAGAG); R3 (F: TTGCGGGTCTCACTATATTGTCCAG, R: GGGCAGACTAGTATTTCAAGAGATC); R4 (F: TCCAGAACACAAATCCCTTTCACAG, R: GAGCCTTTATCACACCACTTCACTC); R5 (F: CGCTCTCCTGGAAAGCAGCACAATG, R: AGTGTTCAATGAGGTTCGCCAGGTC); R6 (F: ACCTCATTGAACACTTCTGCCCGAC; R: GCTCTTGCGCAACTCTGGAGAAAAG); R7 (F: CGAGTGTCCAAACCAAAAGCGAAAG; R: TGCGAAACGAGTGAAGTCACAAAG).
Chromatin immunoprecipitation (chip)
chip analyser ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). De protein-DNA komplekser ble immunopresipitert med 4 mikrogram antistoffer RNA polymerase II (SC-9001, Santa Cruz Biotechnology), og Brg1 (SC-10768); dimetyl-H3-K9 (ab1220, Abcam), tetra-acetyl-H4 (06-866, Upstate) og diacetyl-H3 (07-593, Upstate); og trimetyl-H3-K4 (9751, Cell Signaling Technology). Real-time PCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer med 1 mL av utfelt DNA. DNA utvinnes fra prøver inneholdende et antistoff ble sammenlignet med IgG kontroller utført på alikvoter av den samme kromatin fremstillingen. Resultatene ble angitt som mengden av DNA utvunnet i forhold til den aktuelle IgG kontroll gitt av produsentene. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter.
Konstruksjon av DRAM-promotor-luciferase reporter plasmider og luciferase-assay
PCR-analyser ble utført ved anvendelse av primer angir spesifikk for
DRAM
promoter (F-1714): AGGAACGCGTACTCCACGGCCACAGTGATCTCTTG; F (-863): TGGAACGCGTGGCCACATATGTTGGGCTCAGACTC; F (-75): TGACACGCGTGGTGGCCACTCTCACTGCTGCGAAG; F (-19): TGACACGCGTTCGGGGTGCGAGGCCCGGCACTC; F (28): TGACACGCGTGTTGGGAGAAATAAATCCTTTTCTC; R (299): CGTACTCGAGCGGGCTTGTTGCGAAACGAGTGAAG). Disse PCR-produkter ble klonet inn i Mlu I /XhoI områder av pGL3-Basic vektor (Promega, Madison, WI, USA). Promotor mutasjoner og delesjoner ble samlet ved en PCR-basert seterettet mutagenese sett (Takara), ved bruk av tilsvarende plasmid som malene. For nukleotidsubstitusjon og delesjon av den minimale promoter, ble en åtte nukleotid DNA-sekvens GCGCGCGC anvendt for å erstatte villtype DNA i den minimale promoter, eller kjernen NF-kB-bindingssete ble slettet ved hjelp av seterettet mutagenese metode. Arrangøren reporter plasmider ble transient transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). pTRL-TK plasmid (Promega) ble ko-transfektert som en intern kontroll for å evaluere transfeksjonseffektivitet. Tjuefire timer posttransfection, ble de resulterende cellene høstet og klargjort for luciferase aktivitet analyse. Luciferase aktiviteter ble målt ved hjelp av dual-luciferase reporter analysesystem (Promega) i henhold til produsentens protokoll med illuminometer (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, USA).
Western Blot analyse
Cellene ble høstet og lysert i RIPA-buffer (Beyotime Inc.). Cellelysatene ble klaret ved sentrifugering ved 15.000 g i 10 min. 20 ug av de totale proteinene ble løst på 8% SDS-PAGE-geler. Proteinene ble overført elektroforetisk på Immobilon P-membran (Millipore). De Western blot ble tidligere beskrevet [32]. Den antistoffer DRAM (AP1825a, Abgent) og β-aktin (SC-130656, Santa Cruz Biotechnology) ble kjøpt.
Statistisk analyse
statistiske evalueringer ble gjennomført ved hjelp av t-test. P-verdier. . 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Takk
Vi takker Dr. Kevin M. Ryan for å dele DRAM plasmid
