Abstract
Klotho ble først identifisert i 1997 og har vært ansett som en anti-aging genet. Emerging bevis viser at klotho har et nært forhold til kreft, inkludert lungekreft, brystkreft, etc, ved å hemme spredning og fremme apoptose av kreftceller. Cisplatin har vært den mest brukte stoffet i førstelinje kjemoterapi. Imidlertid har økningen i cisplatin-resistente kreftceller bli et stort hinder i klinisk behandling av kreft. I vår studie har vi for første gang vist at klotho kunne dempe motstanden av lungekreft til cisplatin kjemoterapi og apoptose av resistente celler med klotho overekspresjon ble markant økt. Men Klotho knockdown celler viste forbedret resistens mot kjemoterapi. Videre analyser viste at hemming av PI3K /Akt vei med spesifikk hemmer (LY294002) svekket de PROMOTIVE effekt på kreft vekst etter forstyrrer klotho shRNA. Videre viste vi at klotho modulert motstanden mot cisplatin i en xenograft naken mus modell. Disse observasjoner antydet at klotho kunne forbedre motstanden til lungekreftceller til kjemoterapi og kan tjene som et potensielt mål for genterapi av lunge cancer resistente overfor cisplatin basert kjemoterapi
relasjon:. Wang Y, Chen L, Huang G, Han D, han J, Xu W, et al. (2013) Klotho sensitizes Menneskelig Lung Cancer Cell Line til Cisplatin via PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 8 (2): e57391. doi: 10,1371 /journal.pone.0057391
Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 07.06.2012; Godkjent: 24 januar 2013; Publisert: 21 februar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (nr 30971320). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 75-85% av lungekrefttilfeller og kjemoterapi spiller en viktig rolle i behandlingen av lungekreft [1]. Cisplatin har vært den mest brukte stoffet i førstelinje kjemoterapi. Cisplatin kan aktivere flere signalveier, inkludert de som involverer ATR, p53, p73, og MAPK, og aktivere apoptose [2], [3]. Dets cytotoksisitet er knyttet til dannelsen av DNA-addukter, noe som forårsaker inter- og intra-strand tverrbinding som inhiberer DNA-replikasjon. Imidlertid har motstanden av lunge cancer kjemoterapi vært en viktig faktor som påvirker den terapeutiske effekt ved behandling av lungekreft. Således er det viktig å utvikle strategier for å forbedre motstanden av human lungekreft til Platin kjemoterapi. Mekanismen som ligger til grunn motstanden av kreftceller til kjemoterapi er komplisert og involverer aktivering av PI3K /akt (også kjent som PI3K /PKB) vei, tap av p53-funksjon, over-ekspresjon av HER-2 /neu og anti-apoptotiske bcl -2 og kompromittert caspaseaktivering [2], [3]. Derfor, for å dypt undersøke mekanismen bak motstanden av kreftceller til kjemoterapi har stor klinisk betydning ved behandling av cancer.
Klotho er et nylig funnet anti-aldring-genet og ble opprinnelig identifisert i klotho homozygote mutante mus ( KL – /-) som viste en menneskelignende aldring relaterte syndrom og utvikle flere lidelser som hypogonadisme, ektopisk forkalkning, osteoporose, hudatrofi, og lungeemfysem [4]. Imidlertid mus med klotho overekspresjon har en utvidet levetid som er 30% lengre hos menn og 20% hos kvinner [5]. Klotho-genet koder for en enkelt-pass-type-1 transmembrane eller utskilt form av klotho protein gjennom alternative RNA-spleising [6]. Klotho ble vist å utøve en inhiberende virkning på insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1) reaksjonsveien både i humane dyr kreftceller og bukspyttkjertelcancerceller [7], [8]. Vår tidligere studie fant også dette fenomenet i humane lungekreftceller (A549-celler) der klotho også tillagt en pro-apoptotisk effekt gjennom Bax /BCL-2 pathway [9]. PI3K /Akt reaksjonsvei er en av de viktige ned-strømmer av IGF-1 veien, og mange studier har bekreftet sin rolle i apoptose av kreftceller [10] -. [12], og kunne sensitisize disse kreftcellene til cisplatin
i denne studien hypotese vi klotho kunne hemme PI3K /Akt vei og videre for å lindre resistens for lungekreftceller til cisplatin og kan tjene en potent kandidat for genterapi for lungekreft.
materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Nanjing Medical University (Permit Number: 2120474). Alle operasjoner ble utført under natrium-pentobarbital-anestesi, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere smerte.
Cellekultur og transfeksjon
humane kreftcellelinje lunge (A549-celler) ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Den H460 celler og cisplatin bestandig A549 og H460 (A549DDP og H460DDP) celler ble vennlig levert av professor Zhou i Shanghai Lunge Hospital. Alle cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Life Technologies, Inc.), 100 U /ml penicillin, 100 U /ml streptomycin, 2 mM glutamin i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C. For å opprettholde medikament-resistens, ble A549 /DDP og H460 /DDP-celler dyrket i RPMI 1640 inneholdende 2 ug /ml DDP og deretter i DDP fri RPMI 1640 to dager før eksperimentene. A549DDP cellene nådde 80% konfluens ble transfektert med pCMV6-MYC-KL, og dens spesifikke shRNAs i nærvær av lipofektamin 2000 (Invitrogen). Den shRNAs var som følger:
sh-en: CCTAAGCTCTCACTGGATCAATCCTCGAA;
sh-2: CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT;
sh-3: GGTCACTCACTACCGCTTCTCCATCTCGT;
SH- 4:. GTTACAGCATCAGGCGTGGACTCTTCTAT;
Alle plasmider ble kjøpt fra OriGene (Rockville, MD, USA)
MTT analysen
halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) av A549DDP og A549-celler ble bestemt ved MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid) analyse (Sigma). Kreftceller ble sådd på 96-brønners plater (1 x 10
4 celler per brønn), og ble behandlet med cisplatin ved forskjellige konsentrasjoner i 48 timer. Etter inkubasjonen ble mediet erstattet med 50 ul av MTT-reagens (2 mg /ml) fulgt av ytterligere inkubering i en atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C i 2 timer. Deretter ble mediet fjernet og dimetylsulfoksyd (DMSO) (150 ul) ble tilsatt til hver brønn. Den optiske tetthet (OD) av hver brønn ble målt ved anvendelse av en mikroplateavleser ved 560 nm.
morfologisk undersøkelse
Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 80 uM (IC50 for A549DDP) cisplatin i 8 timer, og 60 uM for H460DDP, og deretter vasket en gang i fosfatbuffersaltoppløsning (PBS) fulgt av fiksering i kulde methonal: aceton (1: 1) i 5 minutter. Etter vasking tre ganger i PBS i 5 min, ble disse celler behandlet med 4 ug /ml 4 «, 6-diamidine-2»-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) (Sigma) i 10 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter undersøkt ved fluorescens mikroskopi. Celler ble tilfeldig valgt for eksamen ved en høy forstørrelse (× 400) og fotografert. Begge normale celler (stor atom, spredning og homogen fluorescens) og apoptotiske celler (atom krymping og hyperchromatic kjerner) ble telt under hvert felt.
Flowcytometri
Celler ble høstet og forsiktig disaggregert til en enkelt cellesuspensjon. Farging ble fremstilt i henhold til produsentens protokoll. Satsen for apoptose indusert av kreft regimer ble analysert ved flowcytometri ved hjelp av en annexin V-FITC /PI kit (BD Biosciences, San Diego, California) etter produsentens anvisninger.
Real-time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celler med TRIzol reagens (Invitrogen, San Diego, CA) ifølge produsentens instruksjoner, og kvantifisert ved å måle absorbansen ved 260 nm. Genekspresjon ble påvist ved kvantitativ sanntids RT-PCR (QRT-PCR) ved anvendelse av standard SYBR grønn RT-PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA ble syntetisert ved hjelp av RevertAid First-Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Vilnius, Litauen) i henhold til produsentens instruksjoner. Primer sekvenser ble utformet med Origene Technologies, Inc. Primere som brukes var som følger:
klotho
forstand: 5′-GCTCTCAAAGCCCACATACTG -3 «;
anti: 5′ -GCAGCATAACGATAGAGGCC -3 «;
β-aktin
forstand: 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′;
anti: 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 «;
PCR-betingelsene besto av pre-denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min.
Western blot-assay
24 timer og 48 timer etter transfeksjon ble cellene vasket to ganger i iskald PBS og proteiner ble ekstrahert fra cellene ved lyse i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1% [v /v] NP-40, 0,5% [vekt /volum] natriumdeoksycholat, 0,1% [w /v] natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris-HCl [ ,,,0],pH 8], 10 mM EDTA og 1 mM PMSF [Sigma]) i 30 minutter ved 4 ° C og etterfølgende sentrifugering i 15 minutter ved 12 000 g. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med et BCA-kit (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter ble 60 ug protein ble fylt på en 10% (vekt /volum) SDS-polyakrylamid-gel elektroforese og overført til en PVDF-membran (Millipore Corporation Billerica, MA 01821), som deretter ble blokkert i 2 timer ved romtemperatur med blokkerings buffer (TBS inneholdende 0,1% [volum /volum] Tween 20 [Sigma] og 5% [w /v] melkepulver). Primære antistoffer (anvendt i 1 time ved romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C) var: anti-fosfo-AKT, anti-akt, (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), anti-Bax, anti-klotho og anti-GAPDH (Santa Cruz). Antistoffer ble fortynnet til 1: 1000, med unntak for den anti-GAPDH-antistoff (1: 500). Deretter ble membranene inkubert i 2 timer med HRP-konjugert sekundært antistoff (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) (heste anti-mus eller geite-anti-kanin, 1: 20000). Visualisering ble gjort ved hjelp av en ECL kit, og signalene ble kvantifisert ved å skanne densitometry.
Transduksjon av Lentivirus
De lentiviral vektorer som uttrykker korte hårnål RNA (shRNAs) ble vellykket konstruert ved OriGene (Rockville , MD, USA) som tidligere beskrevet. De effektivt konstruert klotho-shRNA oligonukleotid sekvenser var som følger, forstand: 5′-
CGCGTCCCC
CTGAGGCAACTGCTTTCCTGGATTGACCT
TCAAGAGAGGTCAATCCAGGAAAGCAGTTGCCTCAGTTTTTGGAAAT
-3′.
The sekvensene ble satt inn i
mul
jeg og
CLA
I enzym områder av pLVTHM vektor, henholdsvis. For rekombinasjon reaksjon ved hjelp pCMV-dR8.74 og pCMV-VSV-G vektorer (
Addgene
, Cambridge, MA), lentiviral vektor DNA og emballasje vektorer ble deretter transfektert inn 293T celler. Etter 48 timers transfeksjon, ble supernatanter inneholdende lentiviruses høstet, sentrifugert ved 1800 g i 10 minutter, og filtrert gjennom et 0,45 um poly (vinyliden-difluorid) Durapore-membran (Millipore, Billerica, MA, USA) for å fjerne eventuelle ikke-festede celler emballasje. Resistent lungekreft cellelinje (A549DDP) ble infisert med lentivirus. Deretter ble de infiserte cellene velges ut av puromycin (0,4 ug /ml) i 14 dager. A549DDP celler infisert med lentivirus-mediert shRNA targeting klotho (sh-klotho) eller lentivirus-mediert shRNA (rykke) ble kåret A549DDP-lenti-sh-2 eller A549DDP-lenti-scramble, henholdsvis.
In vivo eksperimenter i nakne mus
For in vivo eksperimenter, Male atymiske nakne mus (BALB /c nu /nu, fire uker gamle) ble anvendt. De ble injisert subkutant med A549DDP-lenti-sh-2 eller A549DDP-sh-krafse celler. Når tumorene målt en midlere volum på 100 mm3, ble musene (6 pr gruppe) ble behandlet med cisplatin (3,5 mg /kg, 2 ganger i uken) eller PBS i 21 dager. Svulster ble målt med målepunktene. Tumorvolumene ble beregnet ved den følgende formel: tumorvolum (mm3) = 0,5 * lengde (mm) x bredde (mm) x bredde (mm)
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som. gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Forsøk ble utført i det minste i tre eksemplarer. Sammenligninger ble gjort med to-tailed Student t test eller ANOVA. En verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Klotho uttrykk ble nedregulert i cisplatin-fattige celler
For å bekrefte motstanden av A549DDP og H460DDP celler, ble MTT-analyse utført for å måle IC50 av A549 celler og A549DDP celler. Resultatene viste IC50 var 17,7 ± 1,93 mikrometer i A549 celler og 86,6 ± 13,2 mikrometer i A549DDP celler, mens H460DDP og modercellelinjen var 63,5 ± 3,8 og henholdsvis 27,7 ± 2,0 (fig 1A). Ekspresjon av klotho ble bestemt ved sanntids-PCR og western blot analyse. Den relative mRNA-nivået av klotho i A549DDP celler var omtrent 35% lavere enn det i A549-celler (figur 1B). Western blot-analyse viste den samme trend i proteinekspresjon av klotho i begge cellelinjer (figur 1C). Videre har vi identifisert et uttrykk for klotho og IC50s i andre cellelinjer, inkludert H1299, PC-9, H1650 og MCF-7 (figur 1C), og vi fant ut at de endogene Klotho uttrykk ble negativt relatert til cisplatin følsomhet (fig 1C) og statistisk analyse viste en invers sammenheng mellom klotho uttrykk og IC50s. Således vi spekulert i at det var forholdet mellom klotho ekspresjon og motstanden mot cisplatin og klotho uttrykk kan bidra til motstands
A.: To cellelinjer ble behandlet med cisplatin viste forskjell i IC50. B: Kvantitativ RT-PCR for påvisning av klotho ekspresjon i A549 celler og A549DDP celler. C: Western blot-analyse av klotho ekspresjon i et panel av lungekreft cellelinjer inkludert to cisplatin-resistente varianter og en brystkreftcellelinje (MCF-7). Klotho uttrykk er høyere i foreldrenes H460, og A549 cellelinjer i forhold til cisplatin resistente varianter. Høyere Klotho ekspresjon ble også påvist i H1299, PC-9, H1650 og MCF-7 cellelinjer. GAPDH tjente som en intern referanse. Påvisning ble utført i tre eksemplarer og data ble presentert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05)
Over-uttrykk for klotho kunne hemme Akt signalveien og indusere apoptose av A549 /DDP celler
for å finne ut hvilken rolle klotho i cisplatin-motstanden cisplatin resistente celler, må vi først oppdaget den p-AKT uttrykk i A549, H460 og deres cisplatin resistente celler. Resultatene viste at ekspresjonen av fosforylert Akt ble signifikant senket i A549 og H460-celler (figur 2A). Deretter ble kreftceller med klotho over-uttrykk forberedt. Som vist i figur 2C, ble protein uttrykk klotho i begge cellelinjer markert øket etter transfeksjon. Effekten av klotho over-ekspresjon på motstanden av A549 /DDP og H460 /DDP-celler til cisplatin ble bestemt ved MTT-analyse. Data er vist i figur 2B. Proliferasjonen av celler transfektert med klotho ble signifikant undertrykket sammenlignet med kontrollgruppen. De midlere IC50s var lavere i Klotho transfekterte celler antyder at disse cellene var mer følsomme overfor cisplatin. Videre er ekspresjon av fosforylert Akt ble negativt relatert til klotho ekspresjon, celler med klotho overekspresjon viste en redusert ekspresjon av fosforylert Akt sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2C). Så, vi har oppdaget at apoptose av celler som gjennomgår klotho transfeksjon. DAPI farging er en metode for å detektere apoptose. Apoptotiske celler vil morfologisk presentere funksjonene i apoptose følgende DAPI farging: lyse atom kondens og perinukleær apoptotiske legemer. Strømningscytometri er en teknikk for telling, undersøke og sortering av mikroskopiske partikler suspendert i en strøm av væske. Det gir samtidig multiparametric analyse av de fysiske eller kjemiske egenskapene til enkeltceller strømmer gjennom en elektronisk gjenkjenning apparat, og det er ofte brukt for å oppdage apoptose. Western blot-analyse avslørte at ekspresjonen av Bax og bcl-2 hadde de samme tendenser som de i flowcytometri og DAPI farging (figur 2D). DAPI farging viste antall apoptotiske celler med klotho over-ekspresjon ble dramatisk øket når sammenlignet med de som gjennomgår transfeksjon med tomt plasmid, men den apoptose av celler behandlet med tomt plasmid var sammenlignbar med den i kontrollen (figur 2E). Strømningscytometri-analyse viste at apoptose av A549DDP celler transfektert med klotho var 47%, mens H460DDP var 19,8%, noe som betyr at de var mer følsom overfor cisplatin, sammenlignet med de negative kontroller (figur 2f). Disse resultatene antydet at klotho kunne øke følsomheten av cisplatin-resistente celler overfor cisplatin ved å heve apoptose i en Akt avhengig måte
A, B.: Western blot-analyse viste at p-Akt ekspresjon ble forbedret betydelig i cellene motstandsdyktig mot cisplatin. C: MTT analyse viste en stor nedgang i IC50 av Klotho transfektert celler. D: Western blot analyse viste forhøyet uttrykk for klotho i cisplatin resistente celler. P-Akt uttrykk ble nedregulert i cisplatin resistente celler etter klotho transfeksjon. GAPDH tjente som en intern referanse. Forsøket ble utført i tre eksemplarer og data ble presentert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05)
Videre undersøkte vi fenotypen av resistente celler og de overordnede cellene, og vi fant ut at ERCC1 ble nedregulert i klotho transfekterte cellene, mens den p-gp, et gen relatert til medikament efflux, og bidro til den mest cisplatin motstand, ble ikke påvirket av klotho (figur 2C). Disse resultatene underforstått at klotho kan påvirke reparasjon av cellene gjennom ERCC1 å endre motstanden i kreftceller i stedet for å øke energiavhengig utstrømming av hydrofobe narkotika.
Klotho knockdown hemmet apoptose og økt motstand mot cisplatin i A549 /DDP celler
for ytterligere å undersøke hvilken rolle klotho i motstanden i cellene til kjemoterapi, ble klotho knockdown utført i A549DDP og H460DDP celler med bestemte shRNAs. Fire shRNAs ble utformet og transfektert inn i A549DDP eller H460DDP celler som beskrevet i vår tidligere studie hvor Resultatene viste at den sh-2 viste den beste virkningsgrad interferens [9]. I denne studien ble sh-2 anvendt i de følgende forsøk. Som vist i figur 3B, western blot analyse demonstrerte ekspresjonen av klotho var signifikant nedregulert med omtrent 50% sammenlignet med den negative kontrollgruppen i begge cellelinjer. Vi har utforsket deretter virkningen av klotho knockdown på følsomheten av resistente celler overfor cisplatin hvori MTT-analysen ble anvendt for å undersøke den IC50 for A549DDP og H460DDP-celler (figur 3A). Resultatene viste at IC50 for shRNA transfekterte celler hadde en markert økning i IC50, sammenlignet med den negative kontrollgruppen. Spesielt i A549DDP celler, var gjennomsnittlig IC50 av celler transfektert shRNA var 452,5 ± 20,69 mikrometer (Fig 3A)
A:. Den ERCC1 og P-gp proteinnivåer i cisplatin resistente celler ble identifisert ved western blot. B: A549DDP og H460DDP-celler ble transfektert med klotho spesifikk shRNA eller kryptert RNA som en negativ kontroll. MTT-analyse viste en økt IC50 på celler transfektert med shRNA. C: Western blot analyse bekreftet klotho uttrykket ble nedregulert i cellene etter transfeksjon med shRNA. D: p-Akt ble også påvist ved Western blot-analyse. Resultatene viste at p-Akt uttrykk ble oppregulert betraktelig etter shRNA transfeksjon. GAPDH tjente som en intern referanse. Forsøket ble utført i tre eksemplarer og data wer presentert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05)
Videre er uttrykk for total-Akt, fosfor-Akt (p-Akt), Bax og BCL. -2 ble undersøkt i klotho shRNA transfekterte celler. Western blot-analyse viste at klotho knockdown førte til betydelig økning i ekspresjon av fosfo-Akt (figur 3C) og bcl-2, men det markert nedgang i ekspresjon av Bax (et pro-apoptotiske protein) (figur 2D). DAPI farging avslørte apoptose av celler som gjennomgår shRNA transfeksjon ble betydelig redusert demonstrert ved mikroskopi, sammenlignet med celler som fikk transfeksjon med krafse shRNA (figur 2E). Strømningscytometri viste at apoptose av cellene var 0,2% i A549DDP og 0,1% i H460DDP sammenlignet med celler transfektert med krafse (figur 2F). Disse funnene viste at klotho nedregule redusert apoptose via fører til ubalanse i uttrykket av apoptose relaterte proteiner (Bax og BCL-2).
Økt motstand følgende klotho nedregulering ble svekket av Akt hemming med LY294002
for ytterligere å undersøke om klotho kan forbedre motstanden i cisplatin resistente celler til cispaltin gjennom regulering av p-Akt uttrykk, celler transfektert med klotho bestemt shRNA ble behandlet med 10 mikrometer og 40 mikrometer LY294002, en phosphoinositide- 3-kinase-inhibitor, for å klargjøre rollen av Akt i økt resistens mot kjemoterapi følgende klotho knockdown. LY294002 vesentlig hemmet ekspresjon av p-Akt i shRNA transfekterte celler, spesielt etter behandling med 40 uM LY294002 (figur 4A), sammenlignet med den negative kontrollgruppen. Deretter ble MTT-test som benyttes for å bestemme sensitiviteten av disse celler til cisplatin. Som vist i figur 4B, er IC50 for de A549DDP celler behandlet med LY294002 ved 10 pM og 40 pM var 92.97 ± 10.04 uM og 50,52 ± 5,63 uM, henholdsvis, som var vesentlig lavere enn i kontrollgruppen (452,5 ± 20,69 uM; P 0,01), og de samme forandringer ble sett i H460DDP cellene. Derfor, ble 40 pM LY294002 anvendt i de følgende eksperimenter. Som vist i figur 2D, Bax, et pro-apoptotiske protein, var signifikant oppregulert i celler som gjennomgår LY294002 behandling, sammenlignet med celler uten behandling med PI3K /Akt inhibitor. Tvert imot, ekspresjon av bcl-2 var signifikant nedregulert etter LY294002 behandling. Videre DAPI farging og flowcytometri (figur 2E, F) viste samme resultater. Disse funnene antydet at klotho kunne lindre motstand av kreftceller til kjemoterapeutika ved å regulere apoptose i et PI3K /Akt signalveien avhengig måte
A:. A549DDP og H460DDP celler transfektert med shRNA ble behandlet med LY294002 (10 og 40 mikrometer). Western blot-analyse viste at LY294002 kunne gi en betydelig lavere p-Akt uttrykk, spesielt etter behandling med 40 uM LY294002. B: Celler transfektert med shRNA ble behandlet med LY294002 ved forskjellige konsentrasjoner, og MTT-analysen ble utført for å måle IC50. C: Apoptose beslektede proteiner, Bax og bcl-2, ble detektert. Resultatene viste klotho over-uttrykk kan øke Bax /BCL-2-forhold, mens klotho knockdown redusert den. LY294002 kunne reversere redusert forholdet følgende shRNA transfeksjon. GAPDH tjente som en intern referanse. Forsøk ble utført in triplo og data presentert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05, ** P 0,01)
Klotho knockdown
in vivo
betydelig økt motstand av. lunge kreftceller til cisplatin
Basert på
in vitro
eksperiment klotho i cisplatin motstand av lungekrefttilfellene, vi videre undersøkt om klotho uttrykk påvirker cispaltin følsomhet
in vivo
, A549DDP-lenti-SH-2 og A549DDP-lenti-krafse celler ble injisert subkutant i høyre flanke av nakne mus. Cisplatin kunne hemme tumorvekst i mus injisert med A549DDP-lenti-krafse celler sammenlignet med fosfatbuffer kontroll, men mus injisert med A549DDP-lenti-SH-2-celler viste ingen signifikant inhibering i forhold til kontrollgruppen (figur 5A) . Western blot videre indikert at uttrykket av klotho i A549DDP-lenti-SH-2 solide tumorer var svak, mens den var positiv i kappløpet kontroll solid tumor. Lignende resultater med
in vitro
studier ble identifisert i uttrykket av p-Akt (Fig 5B). Disse funnene tyder på at klotho bidrar til cisplatin motstand i lungekreftceller i xenograft tumormodeller, og PI3K /Akt var involvert i prosedyren
A:. Apoptose av cellene analysert ved flowcytometri. B: Apoptose av cellene ble utført ved DAPI farging. Kondensert kromatin ble undersøkt av en fluorescens mikroskopi. C:
In vivo
chemoresistance analysen av Klotho knockdown celler. Xenograft tumorvolum hos mus behandlet med cisplatin eller fysiologisk saltløsning er vist. Tumorvolumet er presentert som gjennomsnitt ± SD. D:. Expression of klotho og p-Akt i svulstvev fra musene
Diskusjoner
Motstanden av kreftceller til kjemoterapi har vært en av de store utfordringene i klinisk behandling av kreft. I vår forrige undersøkelse, resultater viste at den nye anti-aging genet klotho var avgjørende for spredning og apoptose av lungekreftceller (A549 celler), hovedsakelig gjennom å hemme IGF-1 /R sti [9]. Akt, en serin /treonin-kinase spiller en viktig rolle i onkogenesen [13] – [15], og endret ekspresjon av Akt har blitt observert i forskjellige humane cancere [16] – [18]. Akt er også en nøkkel nedstrøms protein av IGF-1 /R pathway. Økende bevis støtter at Akt er involvert i motstanden av kreftceller til kjemoterapi og strålebehandling [18], [19]. Nylig har flere studier funnet at inhibering av Akt-aktivering kan redusere celleoverlevelse og forbedre motstanden cisplatin [20], [21]. Det er rapportert at Akt er involvert i cisplatin bestandig i flere krefttyper [22] – [24]. Når aktivert PKB /Akt er fosforylerer og virkemidler rettet mot proteiner involvert i mange ulike cellulære funksjoner, som spenner cellesyklusprogresjon, celleoverlevelse, ribosom biogenesis, protein oversettelse og cellemotilitet 25-27. Klotho ble først funnet i 1997 som en antatt aldring-suppressor genet i mus som forlenget levetid når overexpressed og induserte en for tidlig aldring syndrom når forstyrret [5]. Siden klotho kan hemme IGF-1 /R signalveien i vår forrige undersøkelse, og autofosforylering av IGF-1R induserer aktivering av Akt ved fosforylering, hypotese vi at klotho kunne lindre motstanden av lungekreftceller (A549DDP og H460DDP celler) til kjemoterapeutika der Akt spiller en viktig rolle.
i denne studien, cisplatin resistente NSCLC celler (A549DDP og H460DDP celler) og moderceller (A549 og H460-celler) ble ansatt for eksperimenter. Først ble klotho ekspresjonen målt i begge cellelinjer, og resultatene viste klotho uttrykk ved både mRNA og proteinnivåene i de resistente celler ble signifikant senket i forhold til de overordnede cellene (p 0,05). Med uttrykket av p-Akt i den cisplatin-resistente celler var signifikant høyere enn den i den overordnede cellene. I tillegg ble den høye IC50s betydelig redusert i A549DDP og H460DDP celler etter klotho opp-regulering. Imidlertid klotho nedregulering ved transfeksjon med spesifikk shRNA øket motstandsdyktigheten overfor cisplatin, ledsaget av en økning i p-Akt uttrykk. Tidligere studier har identifisert Akt som et viktig protein i IGF-1-mediert celleoverlevelse [28]. Konstitutivt, hindrer Akt aktivering fra den ekstracellulære matriks indusert apoptose [29]. Det er 2 store mekanismene for resistens i cellene: første, ulike endringer i celler som påvirker kapasiteten av cytotoksiske legemidler til å drepe celler, inkludert endringer i cellesyklus, økt DNA-reparasjon aktivitet, defekt apoptose sti, endret metabolisme av narkotika, etc; andre, øket energi-avhengig utstrømning av hydrofobe medikamenter, representert ved overekspresjon av en familie av energiavhengige transportører, såkalte ATP-bindende kassett transportører, slik som P-glykoprotein (P-gp) [30]. ERCC1 (excision reparasjon cross-komplemente gruppe 1) er en begrensende faktor i nucleotide excision reparasjon, fjerner DNA-addukter og reparasjoner DNA dobbelttrådbrudd [31], [32]. Høye nivåer av ERCC1 er korrelert med resistens mot cisplatin-basert kjemoterapi hos pasienter med NSCLC [33], [34]. P-gp ble det først oppdaget humane ABC-transportøren, og er kodet for av MDR1-genet [35]. P-gp er en av de klinisk viktige trans transportører og spiller en viktig rolle i legemiddelresistens. For å identifisere den underliggende mekanisme av motstanden i våre celler, vi videre utforsket ERCC1 og p-gp-proteinene i de transfekterte cellene, og vi har funnet at ERCC1 ble signifikant redusert i klotho transfekterte celler sammenliknet med negative kontroller, men ingen signifikant forskjeller ble sett i uttrykket av p-gp. Disse funn viste at klotho påvirket motstanden av lungekreftceller til cisplatin, som var knyttet til PI3K /Akt signalveien. Videre klotho kunne modulere reparasjon aktivitet av DNA gjennom regulering av ERCC1, deretter endre motstanden i kreftceller. I denne studien, til dypt undersøke hvilken rolle Akt i motstanden av cellene, fant vi at Akt hemming av dens spesifikke inhibitor (LY294002) reduserte forhøyet IC50 følgende klotho shRNA transfeksjon ledsaget av reduksjon av p-Akt uttrykk. Å identifisere resultatene
in vitro
, utførte vi en
in vivo
eksperiment i nakne mus. Vi fant at redusert antitumor effekt
in vivo
var forbundet med hemming av klotho uttrykk og aktivert PI3K /Akt veien. Disse resultatene bekrefter at klotho, en anti-aldring-genet, kunne lindre resistens for A549DDP og H460DDP til cisplatin ved inhibering av Akt signalveien.
Regulering av apoptose er komplisert og et antall gener som er involvert i denne prosessen, inkludert Bax /bCL-2, celleregulerende proteiner, etc [36]. Vår studie viste at forholdet mellom Bax /BCL-2 ble økt dramatisk etter klotho over-uttrykk i cisplatin resistente celler, mens klotho knockdown redusert dette forholdet ledsaget av hemming av Akt signalveien. Dette var konsistent med utviklingen av p-Akt uttrykk og IC50. Vi oppdaget den apoptose av cellene, og våre resultater viste klotho spilt en sentral rolle i apoptose av kjemoterapi resistente celler: økning i klotho uttrykk var nært knyttet til mer apoptotisk. Basert på resultatene ovenfor, spekulerer vi at klotho spiller en sentral rolle i reguleringen av Bax /BCL-2-forhold, og kan lindre motstanden av A549DDP og H460DDP celler til kjemoterapi ved å fremme apoptose. Motstanden i lungekreftceller til kjemoterapeutika er knyttet til den lave klotho uttrykk.
