Abstract
Cellular heterogenitet spiller en sentral rolle i en rekke funksjonelle prosesser in vivo, inkludert kreftutvikling. Men fortsatt vår kunnskap om celle-til-celle mangfold og hvordan forskjeller i individuelle celler manifest i endringer på befolkningsnivå svært begrenset hovedsakelig på grunn av mangel på passende verktøy slik at studier ved encellede nivå. Vi presenterer en studie av endringer i cellulær heterogenitet i sammenheng med pre-ondartet progresjon i respons til hypoksisk stress. Utnytte pre-ondartet progresjon av Barretts øsofagus (BE) som en sykdom modellsystem vi studert molekylære mekanismene bak utviklingen fra metaplastiske til dysplastiske (pre-cancerous) scenen. Vi brukte nylig utviklede metoder slik at målinger av celle-til-celle forskjeller i kopiantall av mitokondrisk DNA, ekspresjonsnivåer av et sett av mitokondrielle og nukleære gener involvert i hypoksi reaksjonsveier, og mitokondriemembranpotensialet. I motsetning til bulk cellestudier rapportert tidligere, viser vår studie signifikante forskjeller mellom metaplastiske og dysplastisk BE celler i både gjennomsnittsverdier og encellede parameter distribusjoner av mtDNA kopiere tall, mitokondrienes funksjon, og mRNA uttrykk nivåer av studert gener. Basert på encellede dataanalyse, foreslår vi at mitokondriene kan være en av de viktigste faktorene i pre-ondartet progresjon i BE
Citation. Wang J, Shi X, Johnson RH, Kelbauskas L, Zhang W, Meldrum DR (2013) Single-Cell Analysis avslører tidlig manifestasjon av kreft Phenotype i premaligne Esophageal Cells. PLoS ONE 8 (10): e75365. doi: 10,1371 /journal.pone.0075365
Redaktør: Nagendra Yadava, UMASS-Amherst /Tufts University School of Medicine, USA
mottatt: 04.06.2013; Akseptert: 12. august 2013, Publisert: 08.10.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding kom fra National Institutes of Health (NIH), National human Genome Research Institute (NHGRI), Center of Excellence i Genomisk Sciences (CEGS) og mikro biovitenskap Senter Grant No. 5 P50 HG002360 (PI DRM) http: //www.genome gov /. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
esophageal adenokarsinom (EAC) er en svært dødelig krefttype og antas å utvikle seg fra esophageal epitelceller gjennom en serie av komplekse, trinnvis transformasjoner på biomolekylære nivå [1] – [6]. Straks de er transformert EAC cellene produserer signifikant høyere nivåer av antioksidant molekyler som gjør dem motstandsdyktige mot høye nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) [2]. Selv om nylige studier har vist at transformasjonen sekvens innebærer utvikling av hyperplasi og metaplasi forårsaket av kronisk betennelse i plateepitel esophageal epitel, etterfulgt av multifokal dysplasi, carcinoma
in situ
og, til slutt, invasiv EAC [1], [7], [8], forblir den detaljerte molekylære mekanismen bak denne transformasjonen må avklares
Hypoksi spiller en sentral rolle i kreft [9] -. [16]. Som i nesten alle faste tumorer, blir oksygentilførselen til kreftceller stor fare på grunn av ukontrollert cellevekst og utilstrekkelig utvikling av mikrovaskulaturen. Mitokondrie, drivkraft av cellen og den viktigste kilden av adenosintrifosfat (ATP) i normale celler, er stedet hvor oksidativ fosforylering (OXPHOS) finner sted. Mitokondrier har også blitt funnet å spille en viktig rolle i programmert celledød eller apoptose, og deres dysfunksjon er forbundet med en rekke sykdommer. For eksempel, har variasjoner i mitokondrie DNA (mtDNA) kopitall er assosiert ikke bare med forskjellige cellulære fysiologiske betingelser, men også med ulike endringer av interne og eksterne microenvironments [17], [18]. Det har blitt demonstrert at mitokondriene kan generere økte nivåer av ROS under hypoksi [19], noe som førte til det postulat at mitokondriene, det primære målet for oksidativ skade, kan fungere som en endogen oksygenføler.
En av de viktigste faktorene for narkotika respons og aggressivitet av svulster er det store intratumoral heterogenitet. Nyere studier har vist at selv celler i en klonal populasjon eller tilsynelatende homogent vev utviser betydelig variasjon av forskjellige egenskaper som strekker seg fra genekspresjon nivåer for å fenotypiske egenskaper [20] – [22]. Det er nå allment akseptert at mitokondrie heterogenitet, inkludert variasjoner i mtDNA kopiantall, DNA mutasjon /utarming, uttrykk og regulering av gener kodet av mtDNA, og aktivitetsnivået, er en viktig bidragsyter til mitokondrie kompleksitet og bidrar til den generelle celle-celle heterogenitet [23] – [25]
De fleste aktuelle Bioanalytical teknikker samle inn data ved hjelp av tusener til millioner av celler, iboende gi resultater i gjennomsnitt over en stor cellepopulasjon.. Slike bulk-celle tilnærminger kan potensielt gå glipp av viktig og verdifull informasjon når du arbeider med svært heterogene systemer [26] som kreft [27]. Derfor er utvikling og anvendelse av teknikker stand til å utføre analyser på enkeltcellenivå er avgjørende, ikke bare for en bedre forståelse av kjerne cellulære prosesser, men også for nye, mer effektive strategier for sykdomsforebygging, ledelse og behandling [28 ] -. [31]
I denne studien bruker vi to udødeliggjort menneskelige Barretts spiserøret epiteliale cellelinjer CP-A og CP-C som opprinnelig ble avledet fra pasienter med Barretts øsofagus (BE) uten dysplasi og med dysplasi, henholdsvis [32]. Selv om begge er ikke-ondartede epitelceller, ble det funnet at CP-C-celler var mer resistente mot oksidativt stress indusert av gallesyre (Chenodeoxycholic syre (CDCA)) enn CP-A, noe som tyder på at, i det minste med hensyn til syre respons, cp- C-cellene oppfører seg mer som spiserørskreft cellelinjer sammenlignet med CP-A-celler [2]. I denne studien ønsker vi å belyse mulige mekanismer som fører til ondartet transformasjon i BE ved å kvantifisere forskjeller i måten cellene reagerer på oksidativt stress forårsaket av hypoksi. Vi har brukt en qPCR-basert teknikk utviklet i vårt laboratorium for å bestemme mtDNA kopiantall og uttrykket nivåer mitokondriell og kjernefysiske gener i enkeltceller. Anvendelse av enkelt-celle analyse skilles vi forskjeller i mtDNA kopitall, mitokondriemembranpotensialet, og hypoksi respons genekspresjon nivåer mellom CP-en og CP-C-celler som ikke kan forutsies ved bulk-celle-analyse. Anvendelsen av disse nye fremgangsmåter, sammen med encellede O
2 forbruks målinger [33] – [35], tillates den karakteriseringen av små hypoksi respons forskjeller mellom CP-en og CP-C-celler. En bedre forståelse av det molekylære grunnlaget for EAC initiering og utvikling vil lette arbeidet med å definere potensielle terapeutiske mål.
Materialer og metoder
Cell Kultur og Hypoksi Behandling
Barretts esophageal epiteliale cellelinjer CP-A og CP-C ble oppnådd fra ATCC og dyrket i keratinocytt Gibco® serumfritt medium (SFM) cellevekst-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), supplert med hEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) ved 5,0 ug /l, BPE (bovint hypofyseekstrakt) ved 50 mg /l og penicillin /streptomycin-løsning (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 100/100 ug /ml i et vev-kultur-inkubator ved 37 ° C i fuktet luft med 5 % CO
2. Før forsøkene ble cellene dyrket i en 75 cm
2 kolbe til omtrent 80% konfluens. Celler i G1 fasen sortert med FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) ble brukt i qPCR eksperimenter i denne studien. For hypoksi ble CP-A og CP-C-celler ved 80% konfluens inkubert i keratinocytt SFM medium inneholdende 2% (v /v) Oxyrase (Oxyrase, Inc., Mansfield, Ohio) ved 37 ° C i 30 minutter, noe er den optimale Oxyrase behandlingstiden som bestemt tidligere [31]. Cellene ble deretter trypsinisert i 0,05% (volum /volum) trypsin-oppløsning inneholdende 2% (v /v) Oxyrase ved 37 ° C i 9 min. Den trypsinering ble blokkert ved tilsetning av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Invitrogen) supplmented med 5% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen) inneholdende 2% (v /v) Oxyrase.
Enkelt-celle Innhøsting
encellede høsting (aspirasjon og dispensering) ble utført ved hjelp av en micromanipulator utviklet av vår gruppe [36], [37] (Methods S1).
Primer design og utvelgelse av Gene Target
Fragments innenfor hypervariable region i (HVI) i mtDNA ble valgt for kopi nummer analyse [38], [39]. Total DNA isolert fra bulkprøver (1 x 10
4 celler) ble brukt som templat for mtDNA kopitall måling, og kvantifisert ved anvendelse av en Real-Time qPCR System (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA) ved anvendelse av optimaliserte primere ( metoder S1). For RT-qPCR uttrykk nivå analyse, fire mitochondrially kodede gener (16s rRNA,
COXI
,
COXIII, CYTBI Kjøpe og fire kjernefysiske gener (28S rRNA, VEGF, MT3, og PTGES) (primere sekvenser som [31]) ble valgt (Methods S1).
encellede mtDNA Kopier nummer Bestemmelse
Etter høsting, rør som hver inneholder en celle suspendert i 6 mL DNaST lysebuffer [26] ble umiddelbart frosset på tørris og deretter lagret ved -80 ° C inntil qPCR-analyse. Hver qPCR ble kjørt i et totalvolum på 10 ul, inneholdende 2 ul av løsningen fra DNaST oppløsning som et templat. for å bestemme mtDNA kopitall, qPCR produkter av bulk prøver ble renset, kvantifiseres og fortynnet i serie (kopi antall 10
6, 10
5, 10
4, 10
3, 10
2, 75, 50 , 25, 10, 5, 1, 0) for en serie av qPCR reaksjoner. resultatene ble anvendt til å plotte en standardkurve for hvert gen. Den Ct-verdien av hver enkelt celle ble deretter overført til absolutte mtDNA kopitall ved hjelp av standardkurver innhentet.
Mitokondriell membranpotensialet
mitokondriemembranen potensial (MMP) ble kvantifisert med konfokalmikroskopi analyse ved hjelp av potensiometrisk fargestoff JC-1 (100 ng /ml) som fluorophore og publisert fargingsprotokoller [40 ], ble [41] (Methods S1).
encellede genekspresjonsanalyser
encellede RT-qPCR utført som tidligere beskrevet [31], [42].
data Analysis
Statistiske analyser, inkludert signifikanstester, ble utført ved hjelp av OriginPro programvarepakken (v. 8, OriginLab, Northampton, MA). Statistisk signifikans nivåer ble beregnet ved hjelp av tosidige ikke-parametrisk Mann-Whitney-Wilcoxon test.
Resultater
qPCR-basert metode for mtDNA Kopier nummer Adetermination i enkeltceller
Flere mitokondrie DNA-områder, slik som HVI, er blitt anvendt som mål for PCR-basert mtDNA kopiantall analyse i bulkprøver før [43]. Én primer-par med lavest Ct-verdien, tydelig negativ kontroll, skarpe og tydelige topper av amplifikasjonsproduktet i smeltekurvene, og den korrekte amplifikasjonsproduktet som bekreftet ved sekvensering ble valgt for hver region for ytterligere enkelt-celle-analyse (fig. S1
HV1
). Serielle fortynninger av PCR-amplifiserte mtDNA-fragment inneholdende det HVI regionen ble brukt til å lage qPCR standardkurver for mtDNA kopitall. Med de valgte primerpar ble HVI regionen vist å ha best mulig ytelse, med
R
2 = 0,9925, for DNA-kopi tall fra 10
2 til 10
6 ( fig. S2).
RT-qPCR for analyse av genuttrykk i enkeltceller
Nylig har vi rapportert om en ny teknikk som gjør det mulig isolering, rensing, og omvendt transkripsjon av total RNA fra en enkelt pattedyrceller etterfulgt av RT-qPCR-analyse av uttrykket nivåer av atom kodet gener [31]. Følge samme prosedyre, vi bestemt i enkeltceller uttrykket nivåer av flere utvalgte gener involvert i hypoksi respons, inkludert mitochondrially-kodet
COXI
,
COXIII
, og
CYTBI
[43] – [45], og
VEGF
,
MT3
,
ANGPTL4 Hotell og
PTGES
gener kodet av den kjernefysiske DNA, med 16S rRNA og 28S rRNA ble brukt som intern kontroll [31], [38], [46] -. [48]
encellede mtDNA Kopier nummer analyse i CP-A og CP-C cellelinjer
Tidligere studier basert på bulk-celle-analyse indikerte at den gjennomsnittlige mitokondrie massen ikke var signifikant forskjellig mellom CP-en og CP-C-celler [2]. I denne studien våre innledende bulk-celleanalyseresultater viste også et noe høyere, men statistisk ikke signifikant gjennomsnitt mtDNA kopitall i CP-C-celler (~1,530 per celle) sammenlignet med CP-A (~1,392 per celle) (fig. S3). Enkelt-celle analyse basert på 99 enkeltceller fra hver cellelinje viste statistisk signifikante forskjeller (p 0,002) i mtDNA kopitall mellom CP-en og CP-C-celler (Fig. 1A, B). 92 av 99 (92%) CP-A-celler viste mtDNA kopitall i området mellom 106-1,900 per celle med kun 8 (8%) celler inneholdende mer enn 2000 kopier per celle, mens i 92 ut av 99 CP-C-celler mtDNA kopiantall varierte mellom 171-2,952 per celle, med 8 celler som har mer enn 3000 eksemplarer per celle (fig. 1a). I gjennomsnitt, CP-C-celler som hadde omtrent 43% mer mtDNA enn CP-A-celler (1363 (CP-C) sammenlignet med 951 (CP-A), Fig. 1B, tabell 1). Beskrivende parametre av mtDNA populasjons histogrammer, inkludert skjevhet (mål på symmetri), kurtosis (mål på peakedness) og Fano faktor (grad av dispersjon) ble beregnet. Både skjevhet og kurtosis verdier var statistisk signifikant lavere i CP-C-celler sammenlignet med CP-A-celler, mens den Fano faktor ikke var signifikant forskjellige (Tabell 1).
A) En celle mtDNA kopiantall fordelinger i metaplastiske (CP-A) og dysplastiske (CP-C) celler, B) boks diagrammer av de to fordelingene er vist i panel A. følgende verdier er avbildet: åpen plass – gjennomsnittet; heltrukken linje – median; øvre og nedre sidelinjer – den
th 75 og 25
th persentiler, henholdsvis; øvre og nedre værhår – den
th 95 og 5
th persentiler, henholdsvis; x – minimale og maksimale verdier av fordelingen. Den p-verdi på 0.002 ble beregnet ved hjelp av tosidige ikke-parametrisk Mann-Whitney statistisk signifikans test (n = 99); mtDNA kopitall i området mellom 150-1,900 C-D) JC-1 fluorescens mikrografer av hypoksisk CP-A (C) og hypoksiske CP-C (D) celler; encellete fordelinger av den relative mitokondriemembranpotensialet i CP-A (E) og CP-C (F) -celler. JC-1 signaler fra omtrent 100 celler pr cellelinje og tilstand ble analysert; G) statistisk representasjon av MMP fordeling i begge celletyper /vilkår.
Differensial Responses to Hypoksi mellom CP-A og CP-C celler på enkeltcellenivå
mitokondriell membranpotensialet varierer sterkt mellom CP-en og CP-C-celler.
mitokondriell membranpotensialet (MMP) som genereres av den mitokondrielle elektrontransportkjeden reflekterer den funksjonelle status av mitokondrier. Det har vært knyttet til fysiologisk reaksjon og fremstilling av ROS [49]. JC-1 har blitt mye brukt i apoptose studier for å overvåke mitokondrie helse og dysfunksjon i forbindelse med cancer og nevrodegenerative sykdommer, [40], [41].
Fluorescens avbildning anvendelse JC-1-farging viste slående forskjeller mellom CP -A og CP-C-celler (100 celler av hver type) under både kontroll- og hypoksiske betingelser (fig. 1 C, D). Under normoksisk vekstbetingelser (21% O
2), CP-A-celler viste forholdsvis lav rød (590 nm) til grønt (529 nm) fluorescence intensitet forhold med et gjennomsnitt på 2, mens CP-C-celler oppviste et midlere forhold, på 3,8 (fig. 1E-G). Etter eksponering til hypoksi i 30 minutter (se Metoder), viste celler av begge typer redusert rød /grønn fluorescens intensitetsforhold, gjennomsnitt på 0,6 og 1,5 for CP-A og CP-C-celler, henholdsvis (fig. 1G). Beskrivende statistikk data er oppsummert i tabell 2.
Mitokondriell heterogenitet innen og mellom ulike celletyper ble rapportert tidligere, avslører store variasjoner i MMP blant celler av samme type innenfor en enkelt kultur tallerken [23] . I vår studie, analyse av encellede MMP data viste statistisk signifikant høyere kurtose verdier i normoksisk CP-C celler i forhold til normoksisk CP-A-celler, mens skjevhet var sammenlignbare. Under hypoksiske forhold observerte vi en motsatt trend, med CP-A celler som viser betydelig høyere verdier av kurtose enn CP-C celler, mens skjevhet verdier ikke var signifikant forskjellig. Disse data indikerer avvikende respons på hypoksi mellom de to cellelinjer, og innebærer at de to typer av celle reagerer på hypoksi forskjellig, ikke bare når det gjelder den gjennomsnittlige MMP, men også med hensyn til dets fordeling mellom individuelle celler. MMP distribusjon kurtosis verdier foreslå høyere MMP heterogenitet av mitokondrier i dysplastisk (CP-C) enn metaplastiske (CP-A) BE celler.
Analyse av mitokondrie genuttrykk i enkeltceller.
Tre mitochondrially kodede gener,
COXI
,
COXIII Hotell og
CYTBI
, ble valgt for uttrykk analyse på grunn av deres betydelige rolle i mitokondrienes funksjon og engasjement i hypoksi respons [44], [45]. Først må vi sammenlignet den relative ekspresjonsnivå av disse genene mellom normoksisk og hypoksiske forhold i bulk celleprøver ved hjelp av mitokondrielle 16S rRNA som en intern referanse. Alle tre mitokondrie gener viste en svært lik hypoksi reaksjonsmønster: en økning av ble observert 1,5-2,6 ganger med høy variasjon i både CP-A og CP-C-celler (fig S4A, B).
For genet. uttrykket analyse på enkelt-celle-nivå, en total av 24 celler av hver celletype og tilstand (normoxia og hypoksi) ble isolert. Resultatene viste en høy grad av celle-til-celle variasjon i uttrykket nivåer av alle fire mitokondrielle gener i celler av begge typer (Fig. 2-4). For eksempel, Ct verdier av 16S rRNA i CP-A celler varierte fra 20 til 26 (nå 30 i ett tilfelle), og utvalget i CP-C celler var mellom 20 og 25. Ct-verdier på
COXI
COXIII Hotell og
CYTBI
i begge cellelinjene var mellom 20 og 35 med gjennomsnittlig Ct-verdier på 22.4~27.9, 26.8~28.2 og 28.3~30.2 henholdsvis (fig. 2, 3 ). En betydelig reduksjon i Ct-verdien av 16S rRNA-genet (
p
0,05, n = 24) ble observert i hypoksiske CP-A enkeltceller, mens bare en liten, men statistisk signifikant endring ble påvist i hypoksisk cp C-celler (
p
0,05, n = 24) (Fig. 3,
16s rRNA
). Tilsvarende er en betydelig reduksjon i Ct-verdien for
COXI plakater (
p
0,001, n = 24) ble observert hos CP-A, men ikke i CP-C-celler under hypoksiske betingelser som sammenlignet med normoxia (fig. 2, 3,
COXI
). Siden lavere Ct-verdier bety høyere mRNA kopiere numre, 16s rRNA og
COXI
mRNA nivåer i CP-A celler var signifikant oppregulert ved hypoksi, noe som indikerer at både gener i CP-A celler svare på hypoksi. Interessant, når den gjennomsnittlige Ct
COXI
verdier ble normalisert mot uttrykket nivået av 16s rRNA Ct
16S
, en standard skritt for beregning av de relative mRNA nivåer i bulk celleprøver, reduksjon av
COXI
Ct-verdier i respons til hypoksi var ikke signifikant, noe som er konsistent med bulk-nivå genekspresjon analyseresultatene av denne studien (fig. S4). I kontrast, ble en betydelig Ct verdiøkning påvist i
CYTBI product: (
p
= 0,03, n = 24) i CP-C-celler, men ikke i CP-A celler (
p
= 0,43, n = 24) (fig. 2, 3,
CYTB1
), som foreslo en nedregulering ved hypoksi av denne mitochondrially kodet gen i CP-C-celler. Det er interessant å merke seg at uttrykket nivåer av 16S rRNA i normoksisk CP-C celler er høyere enn i normoksisk CP-A celler (C
t (CPC) = 22,73 vs. C
t (CPA) = 23,66 , p 0,006) og nærmer seg nivået i hypoksiske CP-A celler (C
t (CPA) = 22,09). Men vår studie også vist at den gjennomsnittlige mtDNA kopiantall per celle er høyere i CP-C celler (Fig. 1B, tabell 1). Derfor, for å foreta en direkte sammenlikning mellom de to cellelinjene mulig, beregnet vi de relative forskjellene i genekspresjon nivåer og normalisert dem mot gjennomsnittlig mtDNA kopitall ved hjelp av følgende ligning: hvor mtDNA er den gjennomsnittlige mitokondrie DNA kopiantall per celle. Ved å beregne r
normen vi kan bestemme de relative forskjeller i genuttrykk nivåer mellom de to celletypene per mtDNA molekyl. Denne parameteren kan også tolkes som et mål på «mtDNA aktivitet» fordi den representerer forholdet mellom de relative genekspresjon nivåer og mtDNA kopiantall. Utnytte dette uttrykket finner vi at under normoksisk forhold 16S rRNA er uttrykt 33% høyere per mtDNA molekyl i CP-C celler enn i CP-A celler. Et lignende resultat er gyldig for
COXI plakater (28% høyere i CP-C enn CP-A) og
COXIII product: (32%), mens
CYTBI
utstillinger 2.45- ganger lavere uttrykk per mtDNA molekyl i CP-C sammenlignet med CP-A celler. Videre ser vi klare forskjeller i genuttrykk fordelingsparametere-skjevhet og kurtose mellom hypoksi responser i CP-A og CP-C celler (Fig. 4). Selv om ingen klar trend i fordelings skjevhet eller kurtose er åpenbart i respons til hypoksi i CP-A-celler (fig. 4A, C, E, G), CP-C-celler utviser en klar og statistisk signifikant økning i både skjevhet og kurtosis av fordelinger av
COXI
,
COXIII Hotell og
CYTBI
genuttrykk (fig. 4F, H). På den annen side, med unntak av
PTGES
, de undersøkte kjernegener viste ingen signifikante forskjeller i fordelingen parametrene i CP-C-celler (Fig. 4B, D). Det er viktig å merke seg at gjennomsnittsverdiene av
COXI Hotell og
COXIII
uttrykk nivåer i normoksisk og hypoksiske CP-C celler var ikke signifikant forskjellig på bulk nivå (Fig. S4). Dette funnet viser igjen nytten av encellede analyser for å få tilgang til informasjon tilgjengelig på annen måte.
Histograms av gen-uttrykk nivåer i kontroll (
tomme barer
) og hypoksi-behandlet (30 minutter
solide barer
) CP-A og CP-C celler. Distribusjons histogrammer ble generert ved hjelp av samme bin størrelse.
Boksplott av encellede gen-uttrykk nivåer og
p
-verdier forbundet med forskjellene mellom normoksiske og hypoksiske forhold i de to cellelinjer. De boksen figuren viser følgende statistiske verdier: åpen plass – mener, heltrukne linjen – median, øvre og nedre sidelinjer – 75. og 25. percentil, henholdsvis øvre og nedre værhår – den 95. og 5. persentilene henholdsvis x – maksimal og minimal verdier.
Sammenligning av fordelingen skjevhet (A, B, E, F) og kurtosis (C, D, G, H) verdiene av de encellede gentranskripsjon nivå fordelte normoksiske og hypoksiske forhold . En klar trend med økt både skjevhet og kurtose mitochondrially-kodede genekspresjon fordelinger kan sees i CP-C-cellene i respons til hypoksi, men er fraværende i CP-A-cellene. Blant de undersøkte kjernegener bare PTGES genet viste signifikante endringer i skjevhet og kurtose parametre i CP-C celler.
Differensial uttrykk for kjernefysisk hypoksi responsgener.
Vi har vist at genuttrykk nivåer fastsatt fra encellede analyse var ikke alltid i samsvar med de som oppnås gjennom bulk-celle analyse. Differensiell ekspresjon av to kjernegener som respons på hypoksi ble observert mellom bulk CP-A og CP-C-prøver. I motsetning til CP-A celler, der
MT3
ble oppregulert ~ 7 ganger og
VEGF
viste ingen endring, CP-C celler viste en ~ 5 ganger økning i
VEGF
uttrykk mens
MT3
viste ingen signifikant endring (fig. S4A, B). På enkeltcellenivå la vi merke til at selv
28s
rRNA, som ofte brukes som intern referanse i bulk cellestudier, viste signifikant oppregulering i CP-A (
p
0,05, n = 36), men ikke i CP-C (
p
= 0,05, n = 36) cellene under hypoxi (fig. 5,
28s
). På grunn av varierende grad av uttrykk for
28s
rRNA, ble rå Ct verdier av hypoksi responsgener i stedet for tradisjonell delta Ct (normalisert mot en husholdningsgenet) som brukes for videre analyse.
Histograms av genuttrykk nivåer i kontroll (
tomme barer
) og hypoksi-behandlet (30 minutter,
solid barer
) celler. Distribusjons histogrammer ble generert ved hjelp av samme bin størrelse.
Selv om
28s
rRNA uttrykk ble påvist i alle enkeltceller i studien, karakterutskrifter fra de tre andre kjerne kodede gener ikke var alltid påvist i CP-A-celler fra både kontroll- og hypoksiske grupper, mest sannsynlig på grunn av deres lave overflod. For eksempel, av 36 enkeltceller,
MT3
transkripsjoner ble oppdaget i 33-kontroll og 34 hypoksiske enkeltceller,
PTGES
i 29 og 36, og
VEGF
i 16 og 24. i CP-C enkeltceller, men med unntak av
VEGF plakater (33 av 36), karakterutskrifter fra alle gener ble påvist i alle 36 enkeltceller. Basert på rå Ct verdier, to hypoksi responsgener
MT3 product: (
p
0,001, n = 33, 35 i kontroll og hypoksiske grupper, henholdsvis) og
PTGES
(
p
10
-4, n = 27, 36) hadde signifikant økt uttrykk nivåer i CP-A celler (figur 5, 6).. Interessant, i hypoksisk CP-C celler bare
PTGES
viste en signifikant oppregulering (
p
0,001, n = 36, 36), mens de to andre,
VEGF
og
MT3
, ikke (fig. 5, 6). Differensial
VEGF
genekspresjon etter hypoksi ble ikke observert i noen CP-A eller CP-C ved encellede nivå. I motsetning til de studerte mitokondrielle gener, har vi ikke observere så mange statistisk signifikante forskjeller i skjevhet og kurtosis parametre for de enkelte celle genuttrykk distribusjoner (Fig. 4A-D) mellom normoksiske og hypoksiske celler av begge typer. Fordelingen av
PTGES
genet viste statistisk signifikant økning i både skjevhet og kurtosis verdier i hypoksisk vs. normoksisk CP-C celler. Fordelings figurer av de tre andre gener «uttrykk nivåer viste ikke statistisk signifikante endringer i respons til hypoksi. I CP-A celler bare
MT3
genet viste en markant økt kurtose som respons på hypoksi. Alle andre gener viste ingen signifikante endringer i encellede uttrykk fordelingsparametere
I boksen figuren viser følgende statistiske verdier:. Åpent kvadrat – gjennomsnitts, heltrukne linjen – median, øvre og nedre sidelinjer – 75. og 25. persentiler henholdsvis øvre og nedre værhår – den 95. og 5. persentiler, henholdsvis x -. maksimal og minimal verdier
Diskusjoner
funnet av betydelig forhøyede nivåer av mtDNA i CP C i forhold til CP-A celler (fig. 1, Tabell 1) er viktig fordi det bærer potensialet funksjonell relevans. Det er interessant både økt og reduserte mengder av mtDNA er rapportert i forskjellige typer av humane solide tumorceller. For eksempel, har redusert mtDNA nivåer blitt funnet i prostata carcinoma celler og forbundet med invasive fenotype, [50], ble en nedregulering av mitokondriell biogenese korrelert med invasiv brystkreft [51] og progresjon av kreft i eggstokkene [52]. Tvert imot, har forhøyede mengder av mtDNA blitt rapportert i prostata [53], bukspyttkjertel [54], hode og nakke kreft, hjernesvulst [55], og fant til positivt korrelert med clinicopathological stadium i tykk- og endetarmskreft [56], Shapovalov m.fl. . har vist økt mtDNA nivåer og redusert åndedrett priser i aggressive osteosarkom celler i forhold til osteoblaster eller godartede osteosarkom celler [57]. Videre har økt mtDNA nivåer blitt forbundet med risiko for å utvikle brystkreft [58], mens økningen i mtDNA kopiere tallene har blitt rapportert i progresjon fra normal til pre-ondartet til ondartet progresjon i endometrium [59], kreftutvikling av hode og nakke kreft [60] og i utviklingen av esophageal plateepitelkarsinom [61]. Mens den funksjonelle rolle av økte mtDNA-nivåer i pre-malign til ondartet progresjon er ikke klarlagt, ble oppregulering av mitokondrielle biogenese foreslått til å tjene som en kompenserende mekanisme for nedsatt mitokondriefunksjon på grunn av mtDNA skader i pre-maligne lesjoner [60], [61]. Det er således mulig at dysplastiske esophageal epitelceller oppregulere mitokondriell biogenese for å øke den totale tilgjengeligheten av templat for transkripsjon, som i sin tur burde øke nettomengden av mitokondriell mRNA og de tilsvarende protein nivå for å opprettholde mitokondriefunksjonen. Vi merker oss at bare enkeltcellenivå analyse viste at mtDNA-nivåer mellom CP-en og CP-C-celler er signifikant forskjellig, mens bulk-nivå analyse viste ingen signifikant forskjell (fig. S3). De observerte høyere asymmetri og peakedness verdier av mtDNA innholdsdistribusjon i CP-A-celler indikerer en høyere grad av avvik fra normalfordelingen CP-A sammenlignet med CP-C-celler. Mens funksjonelle relevansen av dette funnet er ikke avklart, resultatet i seg selv er interessant som det indikerer befolkningsnivå forskjeller mellom de to stadiene i pre-ondartet BE. Det er mulig at på grunn av selektive trykk gitt av galle og syre reflux i spiserøret, en eller flere subkloner i mer heterogen populasjon av metaplastiske (CP-A) celler blir valgt for hvilket resulterer i en mindre heterogen, nærmere normalfordelingsprofil av mtDNA innhold i de mer avanserte, dysplastiske stadium (CP-C celler) av BE. Studier som fokuserer på heteroplasmy av mitokondriell DNA ved encellede nivå må være gjennomført for å gi mer detaljert innsikt i dette funnet. Likevel funn av forhøyede mtDNA nivåer i dysplastiske BE celler indikerer at pre-ondartet BE progresjon er lik andre typer progresjon (ESCC og hode- og halskreft) og at den kan brukes som en biomarkør for tidlig påvisning av dysplasi i forskjellige vevstyper.
mitokondriemembranpotensialet (MMP) målinger viste markert høyere relative verdier i normoksiske CP-C (1,86 ± 0,41) sammenlignet med CP-A (0.80 ± 0.17)-celler (fig. 1, tabell 2 ). Når normalisert mot mtDNA kopiere nummer, gjennomsnittlig relative MMP verdier er ca 37% høyere i CP-C enn i CP-A celler. Dette resultatet viser at i gjennomsnitt per mtDNA molekyl de dysplastiske celler opprettholde høyere MMP verdier enn metaplastiske celler.
