Abstract
Effektene av As
4O
6 som adjuvant på fotodynamisk behandling (PDT) ble studert. Som
4O
6 anses å ha kreft aktivitet via flere biologiske handlinger, for eksempel frie radikaler produksjon og hemming av VEGF uttrykk. PDT eller As
4O
6 i betydelig grad hemmet TC-1 celle-proliferasjon på en doseavhengig måte (
P
0,05) ved MTT-assay. Den anti-proliferative effekt av kombinasjonsbehandlingen var signifikant høyere enn i TC-1-celler behandlet med enten fotodynamisk terapi eller As
4O
6 alene (62,4 og 52,5% reduksjon sammenlignet med vehikkel-behandlet bare TC-1-celler henholdsvis
P
0,05). I tillegg celleproliferasjon i kombinasjon av fotodynamisk terapi og som
4O
6 behandling signifikant redusert med 77,4% (
P
0,05). Celle overlevelse pathway (
Naip1, tert Hotell og
Aip1
) og p53-avhengige veien (
Bax, p21
Cip1, Fas, Gadd45, IGFBP-3
og
MDM-2
) ble markert økt med kombinasjonsbehandling av fotodynamisk terapi og som
4O
6. I tillegg er den immunrespons i det ublandede reaksjonsveien (
Ly-12, CD178
og
IL-2
) ble også modulert etter kombinasjonsbehandling, noe som tyder på forbedret antitumoreffekter ved å kontrollere uønsket vekst-stimulerende trasé. Kombinasjonen effekten tilsynelatende reflektert samsvar med in vitro-data, i å begrense tumorvekst
in vivo
og i forhold til noen vanlige signalveier som er observert
in vitro
. Disse funnene tyder på nytten av combinatory behandling med fotodynamisk terapi og som
4O
6 for hemming av livmorhalskreft cellevekst
Citation. Kim YW, Bae SM, Battogtokh G, Bang HJ, Ahn WS (2012) Synergistic anti-tumor Effekter av kombinasjon av fotodynamisk behandling og Arsen forbindelse i livmorhalskreftceller: in vivo og in vitro studier. PLoS ONE 7 (6): e38583. doi: 10,1371 /journal.pone.0038583
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 19 desember 2011; Godkjent: 07.05.2012; Publisert: 08.06.2012
Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av Den katolske Harvard Wellman fotomedisin Kjerne Technique Development Center, Seoul, Sør-Korea (Grant # 5-2012-A0154-00001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fotodynamisk terapi (PDT) innebærer en kombinasjon av ikke-giftige fargestoffer som kalles fotosensibiliserende (PSS) og synlig lys av riktig bølgelengde for å bli absorbert av PSS. I nærvær av oksygen, fører dette til dannelse av reaktive oksygenarter (ROS) som kan skade cellebestanddeler, noe som fører til celledød [1], [2]. Oppdagelsen av programmert celledød eller apoptose, har revolusjonert felt kjemoterapi generelt, og spesielt PDT [3] – [5]. Imidlertid er en fullstendig utryddelse av tumorceller ved PDT alene har ikke vært garantert [6]. . Videre studier for å kontrollere uønsket vekst-stimulerende veier etter PDT er ønskelig å minimalisere risikoen for skadelige skadevirkninger
arsenforbindelser er blitt vist å ha livsbevarende egenskaper i kreftbehandling [7] – [10]. Lovende resultater ble rapportert, viser at diarsenic oksid (Som
2o
3) behandling kunne tilby et alternativ til kjemoterapi for akutt promyelocytic leukemi (APL). Cytopathological undersøkelser viste også induksjon av apoptose i APL-celler. Nylige rapporter antydet at arsenforbindelser hemme proliferasjonen av humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) via G1 og G2 /M fase arrest av cellesyklusen [8]. I tillegg er de hemmende effekter på bFGF- eller VEGF-stimulert celleproliferasjon antyder den antiangiogene potensialet av arsenforbindelser [11]. Videre tetra-arsen oksid (Som
4O
6) ble rapportert å ha antiangiogenic effekter på NGF-indusert dannelse av nye skip i rotte hornhinnen, sammenlignet med kontrollgruppen og som
2o
3 behandlede gruppe [9]. Det har vært derfor foreslått at As
4O
6 kan være en ny arsenforbindelse, som det induserte apoptose i kreftceller ved mye lavere konsentrasjon enn As
2o
3 [10]. Arsenforbindelser kan øke reaktive oksygenarter (ROS) i celler og derved øke apoptose induserende faktor (AIF) sekresjon gjennom aktivering av PARP-1, og til slutt induserer celleapoptose. Utgivelsen av cytokrom c og apoptose induserende faktor (AIF) er finjustert av Bcl-2 familien proteiner i en av følgende to måter: i henhold til en mulig mekanisme er Bax stede i cytoplasma translocated til mitokondrie membranen, der den gjennomgår konformasjonsendringer assistert av budet. Bindingen av Bax til den ytre membran (OM) fører sin
in situ
multimerization, hvor PTP er inngjerdet og cytokrom c slippes. BCL-2 og Bcl-xL hemme konformasjonsendringer i Bax og derfor hemme frigjøring av cytokrom c og apoptose. Høyt nivå av ROS produksjon er den viktigste årsaken til apoptose av arsenforbindelse. Som fri-radikal, kan ROS reagere med de fleste biologiske makromolekyler, og derfor ikke bare kan forårsake oksidativ skade på DNA, men også endrer strukturen og funksjonen av proteiner [12] -. [14]
På den annen side, ROS kan modulere genetisk uttrykk ved å opptre som en andre messenger. Flere studier har antydet at oksidativ skade kan være involvert i initiering av hendelser i kreft, og kan bidra til å indusere apoptose etter initiering av en økning i celleformering [15], [16]. Arsenforbindelse kan også velig regulere immunresponsen mot involvere anti-kreft-funksjon, gjennom reduksjon av VEGF-ekspresjon [12] – [14]
I denne studien viste vi for det første den forbedrede anti-tumor effekt av PDT. ved hjelp av Radachlorin med As
4O
6 i mus med tumorer forårsaket av humant papillomavirus (HPV) 16 E6 /E7 onkogen uttrykt TC-1 tumorceller. Denne studien viste at kombinasjonsbehandling av PDT pluss Som
4O
6 var mye mer effektive på undertrykkelse av tumorvekst sammenlignet med PDT eller som
4O
6 alene.
Resultater
In vitro celleveksthemmende virkning av As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT på TC-1 celler
for å se veksthemming effekten av PDT på TC -1 celle, lys av 6.25J /cm
2 ble eksponert ved 12 timer etter behandling Radachlorin på cellene, og deretter ble celleveksten ble målt i en forutbestemt tid. Levedyktigheten for celler behandlet med forskjellige doser av Radachlorin, etterfulgt av lysbestråling ble redusert på en doseavhengig måte sammenlignet med kontroll, respektivt (figur 1A). For å se veksthemmende effekt av As
4O
6 på TC-1-celle, celleveksten ble målt etter en forutbestemt tid etter As
4O
6-behandling. Levedyktigheten for celler behandlet med forskjellige doser av As
4O
6 ble redusert på en doseavhengig måte sammenlignet med kontroll, respektivt (figur 1B). Ved hjelp av disse data, ble levedyktighet av cellene bestemt etter behandling av de dyrkede TC-1-celler med 3 uM av As
4O
6 og forskjellige doser av Radachlorin /PDT per dag. Den kombinasjonsbehandling viste synergistisk virkning, mink levedyktighet på en doseavhengig måte sammenlignet med kontroll, som vist i figur 1C. Cellelevedyktigheten ble funnet å være 62,4% for PDT alene og 52,5% etter As
4O
6 alene behandling ved en lav dose. I kontrast, etter PDT pluss Som
4O
6 behandling, andelen av cellevekst ble funnet mindre enn 23%. Vi observerte også den kombinerte virkning sammenlignet med enkeltdoser over tid for å klargjøre hvorvidt den combinatory tilnærmingen kan resultere i lengre levetid begrensning av celleproliferasjon sammenlignet med de enkelte behandlinger (figur 2). Cellelevedyktigheten ble funnet å være mindre enn 10% for 0,2 pg /ml Radachlorin /PDT pluss As
4O
6 behandling i tre dager, sammenlignet med individuell behandling. For evaluering av synergi mellom Radachlorin /PDT og som
4O
6 behandling, brukte vi en kombinasjon indeks som beregnes ved Chou og Talalay metode (tabell 1). Blant de flere kombinasjoner av behandling, 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT pluss 3 um av As
4O
6 på dag 3 og 4 ført til den høyeste celledød hastighet, og det viste synergisme. Noen flere cellelinjer så som HaCaT, HeLa, og Siha celler ble tatt med for å vurdere inhibisjon av cellevekst (Supplement figur S1). Selv om resultatene av HaCaT og Siha var i overensstemmelse med tidligere estimater av MTT-analysen, HeLa viste Radachlorine /PDT-resistente trend i forhold til de andre celler. Cellelevedyktigheten av de to cellelinjen ble funnet å være mindre enn 25% til 0,15 ug /ml av Radachlorin /PDT pluss As
4O
6 behandling i fire dager, sammenlignet med individuell behandling. Vi karakterisert celledød ved beising av TC-1-celler behandlet med 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT eller /og 3 uM av As
4O
6 i 1 dag. Som forventet, er effekten av kombinasjonsbehandlingen var større enn hver enkelt behandling. I fravær av Radachlorin /PDT eller As
4O
6, cellene oppnådde en fullstendig sammenflytende, tette monolag etter 48 timers dyrking (figur 1D). Cellene forble festet til vevskultur substratet og de vedtatt en langstrakt morfologi. I motsetning til de fleste av cellene behandlet med Radachlorin /PDT pluss As
4O
6 ble løsrevet fra platen og ble avrundet; karakteristisk for celler som gjennomgår død ved apoptose. Cellene ble behandlet med Radachlorin /PDT eller som
4O
6 imidlertid vedtatt morfologi som var middels i naturen. Vi telles forskjellige apoptotisk celle-populasjoner som induseres av 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT eller /og 3 uM av As
4O
6 i 1 dag. Som vist i vedlegg Figur S2, celledød økt betydelig etter Radachlorin /PDT pluss som
4O
6 behandling. Tidlig apoptotisk befolkningen var 9,9% ved Radachlorin /PDT pluss Som
4O
6 behandling. I kontrast, tidlig apoptotiske celle populasjoner var 4,3% og 4,1% ved Radachlorin /PDT og som
4O
6 behandling, henholdsvis. Dette viser at kombinasjonen behandling induserte mer begynnelsen av apoptotiske celler i forhold til de enkelte behandlinger.
(A) TC-1-celler (3 x 10
3) ble dyrket i 12-brønners plater i triplikat over natten og behandles med forskjellige konsentrasjoner av Radachlorin og PDT (6,25 J /cm
2) som beskrevet i Materialer og Metoder. Etter PDT, cellene ble dyrket i en forutbestemt tid. (B) Blokker effekten av cellevekst som
4o
6 på TC-1 celler. TC-1-celler ble dyrket og behandlet som beskrevet i Materialer og Metoder. Etter Som
4O
6 Behandling av cellene ble dyrket i en forutbestemt tid. Celleviabilitet ble fastsatt basert på MTT analysen. (C)
In vitro
celleveksthemmende effekten av As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT på TC-1 celler. TC-1-celler ble dyrket med 3 uM av As
4O
6 og forskjellige doser av Radachlorin /PDT for en dag, som beskrevet ovenfor. Celleviabilitet ble fastsatt basert på MTT analysen. Hver søyle representerer en gjennomsnittlig [± SD (vertikal linje)] av tre gjentak per dose (
n
= 3). * Og #: signifikant forskjellig (
P
0,05) fra kontroll og PDT ved t-test. (D) Morfologiske forandringer av TC-1-celler. TC-1-celler ble behandlet med 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT eller /og 3 uM av As
4O
6 i 1 dag. Cellene ble så sees under mikroskop. Bildene ble tatt med fasekontrastmikroskop på X300. (A) ikke-behandlet; (B) 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT alene; (C) 3 um Som
4O
6 alene; (D) 3 um Som
4O
6 pluss 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT.
TC-1 celler ble dyrket med 3 um av As
4O
6 og (A) 0,15 ug /ml og (B) 0,2 ug /ml Radachlorin /PDT, respektivt. Celleviabilitet ble fastsatt basert på MTT analysen. Hver søyle representerer en gjennomsnittlig [± SD (vertikal linje)] av tre replikater (n = 3). * Og #. Signifikant forskjellig (P 0,05) fra kontroll og PDT ved t-test
Gene uttrykk profilen til TC-1 celler behandlet med As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT
Vi brukte RT
2 Profiler PCR Array System for å forstå de cellulære prosessen endringer gjennom hvilke TC-1 celler kan bli påvirket av kombinasjonsbehandling med As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT. Vi har funnet 63 gener som var minst to ganger opp- eller nedregulert (hvert gen er beskrevet i tabell 2) og anvendt hierarkisk clustering vise differensielt uttrykte gener (figur 3A). For å oppdage forskjellene i de funksjonelle profiler, vi plassert differensielt uttrykte gener i sammenheng med nåværende interactome kunnskap, ved hjelp av verktøyene oppfinnsomhet Pathways Analysis (
P
for alle 0,05), som viser at økt celleveksthemming og antitumor effekter signifikant relatert til genuttrykk nivåer av gener relatert med celledød, dvs p53 og NFAT pathway (figur 3B). Hvert gen i reaksjonsveien ble testet ved kvantitativ PCR (figur 4), og resultatene av PCR matrisen og QRT-PCR var like. Disse inkluderte gener som koder for Tert, Aip1, Bax, p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, MDM-2, Ly-12 og IL-2, sammenlignet med svakt uttrykt gener som Naip1 og CD178. Betydelig oppregulert molekylære funksjoner for kombinasjonsbehandlingsgruppen var p53 sti. Den nedregulert molekylære funksjon var ryddig sti. MAPK, cytokin-cytokin reseptor interaksjon, brennvidde heft, ble celleadhesjonsprosesser trasé også studert i gense sett, men ikke strengt korrelert med økt cellevekst hemming (
P
for alle 0,05) (figur 3C- F).
(A) Alle dataene ble median sentrert og gruppert ved hjelp av en hierarkisk clustering. En klynge bilde som representerer 63 av genene er vist i matriseformat, hvor p representerer enkeltgener, og kolonnene representerer hver analyse. Hver celle i matrisen representerer uttrykket nivå av et gen i en individuell analyse. Røde og grønne celler preget av høye og lave nivåer, henholdsvis. (B) Ti gener (p53 og NEAT trasé) viser statistisk signifikante forskjeller i tre grupper er vist som en klynge bilde. (C) MAPK reaksjonsveien som en klynge bilde. (D) cytokin-cytokin reseptor interaksjon veien. (E) Focal adhesjon pathway. (F) Celleadhesjon svei.
Resultatene er presentert som transkripsjonsnivåer i forhold til nivået i ubehandlede kontrollceller ved hjelp av CT-metoden, med gjennomsnittlig mRNA nivå av fem indre kontroll-gener, inkludert b- aktin, som brukes som normaliseringskontroll. (A) Celleoverlevelse pathway. (B) NEAT veien. (C) p53 veien.
Som
4O
6 pluss Radachlorin /PDT undertrykker tumorvekst i TC-en dyremodell
For å bestemme den synergis antitumor effekter av As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT
in vivo
, ble C57BL /6 mus utfordret sc med TC-1-celler og deretter behandlet med As
4O
6 og /eller Radachlorin /PDT. Behandlingen ble initiert på dag 0, da tumorer var ~230 mm
3 i størrelse. Som vist i figur 5A, som
4O
6 eller Radachlorin /PDT behandlede dyregrupper viste signifikant undertrykkelse av tumorvekst, sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppe. Imidlertid dyr behandlet med kombinasjonen av As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT viste de mest signifikante tumor suppresjon, sammenlignet med de andre gruppene. Dette antydet at As
4O
6 kan spille en viktig rolle i å hemme veksten av Radachlorin /PDT.
(A) Tumor vekstkurver for TC-1 fra mus behandlet med Radachlorin /PDT og /eller som
4O
6 (n = 7 for hver gruppe). Tumorbærende mus ble gitt intravenøst injisert Radachlorin (10 mg /kg kroppsvekt) og /eller peritoneale injeksjoner av 7,5 mg /kg av As
4o
6. Tre timer senere ble cellene eksponert for laser, tumorstørrelse ble overvåket deretter, som beskrevet i Materialer og Metoder, og dens midlere ellipsoide volum ble plottet over tid. Signifikant inhibering av tumorvekst ble påvist ved ANOVA. *:
P
0,01, sammenlignet med kontrollgruppen, #:
P
0,01, sammenlignet med Radachlorin /PDT alene gruppen og $:
P
0,01, sammenlignet med den som
4O
6 alene gruppen. (B) perfusjon og morfologiske forandringer i TC-1 tumorer i C57BL /6 mus behandlet med As
4O
6 (10 mg /kg kroppsvekt, i.p.). Tumorvev ble høstet etter 48 timer etter As
4O
6 behandling. Vev ble vist ved en bølgelengde på 365 nm og fotografert ved x200 forstørrelse. (C) Prosent område av perfusjon område av TC-1 tumorer i C57BL /6 mus behandlet med As
4O
6 sammenlignet med ikke-behandlede svulster. De tumorvev ble høstet ved angitte tidspunkter etter As
4O
6 behandling. Sekvensielle forandringer av perfuserte områder på 1, 3, 6, 12, 24, og 48 timer etter As
4O
6-behandling. *
P
0,05, sammenlignet med ubehandlede kontroller. (D) CD31-immunostained tumorsnitt (original forstørrelse, x400) og As
4O
6-behandlede seksjoner vises. Tjuefire timer etter As
4O
6 behandling, TC-1 svulster viste omfattende tap av CD31 flekker indikerer betydelig As4O6-indusert vaskulære skader.
Effekt av arsen behandling på regionalt blod perfusjon i svulstvev
Hoechst 33342 ble brukt til å visualisere dynket fartøy som beskrevet i materialer og metoder. I kontrollen vev, ble vaskulære endotelceller tydelig farget av Hoechst 33342 på både sin ytterkant og sentrale regionen (figur 5B). Behandlet vev var sentralt avfarget og periferien florescence signalet var nesten umulig å oppdage. Dette fenomenet fortsatte til 24 timer punktet. Imidlertid fluorescens ved periferien av cellene var tydelig ved 48 timer etter behandling, mens sentral farging forsatt fraværende. For å observere endringer av fartøyets funksjon i hele tumor, ble tumor seksjon skannet felt for felt. Den sekvensielle endringer perfusjon området etter som
4O
6 behandling er vist i figur 5C. Ved hvert tidspunkt, prosentandelen av hver seksjon for å tumor felt var sammenlignbare med kontroll vev ved hvert tidspunkt. Perfusjon området ble redusert umiddelbart etter As
4O
6 behandling. Ved 6 og 12 timer, perfusjonen området var et minimum, ved 24 timer perfusjon området var 14,4% sammenlignet med vev fra PBS-behandlet kontrollgruppe vev. Tumor microvessel tetthet dimensjoner ble målt etter administrering av As
4O
6 til mus med TC-1 tumorxenotransplantater. Som vist i figur 5D, var det en signifikant forskjell i tumor kar tetthet som detekteres av CD31-farging mellom det som
4O
6-behandlede gruppen og tidsavstemt PBS-behandlede kontrollgruppen etter 24 timer av As
4O
6 behandling. Mus behandlet med As
4O
6 hadde en reduksjon i tumor fartøyets dimensjoner sammenlignet med kontrolldyrene, med CD31 farget microvessels fremdeles vil være tydelig ved den ytre kant av tumoren.
In vivo-genekspresjon nivåer av tumorvev behandlet med As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT
TC-1 celler ble behandlet med As
4O
6 og Radachlorin /PDT for en dag, som angitt i «Materialer og metoder» -delen. Uttrykket av gener mRNA i tumorvev ble undersøkt ved QRT-PCR (figur 6A). Resultatene er presentert som transkripsjonsnivåer i forhold til nivået i ubehandlede kontrollceller ved hjelp av CT-metoden, og b-aktin mRNA-nivåer ble anvendt som normaliseringskontroll. Ved hjelp av CD5-antigenet i kombinasjonsterapigruppen, Ly-12 og IL-2-genekspresjon økt 26 og 17 ganger, sammenlignet med kontrollgruppen, som viser at p53 er involvert i regulering av NFAT vei av p21, Gadd45, IGFBP-3- , Mdm-2 og andre gener. Genekspresjon ble funnet økt i tre påfølgende eksperimenter. For å avgjøre rollene til p53 signalveier i synergiantitumor effekten av som
4o
6 pluss Radachlorin /PDT
in vivo
, vi videre undersøkt p53, p21 og Gadd45 protein nivåer i vivo (Figur 6B). Som
4O
6 eller Radachlorin /PDT behandlede dyregrupper viste ingen signifikante uttrykk forandringer, sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppe. I motsetning til dette, p53, p21, og Gadd45 protein ble signifikant økt i kombinasjonsbehandling med As
4O
6 pluss Radachlorin /PDT.
(A) mRNA ekspresjon av gener i tumorvev var undersøkt av Q-PCR. Resultatene er presentert som transkripsjonsnivåer i forhold til nivået i ubehandlede kontrollceller ved hjelp av CT-metoden, med b-aktin mRNA-nivåer som anvendes som normaliseringskontroll. (B) Western blot analyse av in vivo tumorvev behandlet med 0,15 ug /ml Radachlorin /PDT eller /og 3 um av As
4O
6 i flere dager.
Diskusjoner
i denne studien har vi forholdsvis analysert resultatene av enkel behandling av As
4O
6 eller fotodynamisk terapi grupper med de som oppnås ved samtidig behandling ved hjelp av E6 /E7 uttrykker TC-en cellelinje og C57BL /6 mus modell transplantert med denne cellen. Vi endelig rapportere forbedrede hemming av cellevekst og antitumor effekter og endringer i genuttrykk nivåer av gener relatert med celledød, dvs p53 og NFAT sti, forårsaket av dette som
4O
6 og PDT co-behandling.
Disse effektene ble fremstilt ved fotodynamisk terapi avhengig av konsentrasjonen av det fotosensibiliserende middel Radachlorin, og ved den As
4O
6 behandling på en konsentrasjonsavhengig måte. I de PDT-ubehandlede celler, ble celleveksten gående opprettholdes frem til slutten av observasjonsperioden. PDT-behandlede celler ble tilbakegang kun for en dag etter PDT, men cellevekst ble på nytt øket etter 2 dager etter PDT. Jo lavere As
4O
6 nivå var, jo langsommere celleveksthemmende virkning ble vist. Under 3 uM av As
4O
6, hemming av cellevekst så ut til å begynne på den første behandlingsdagen og var konsekvent holdt under 60-80% nivået av cellevekst i løpet av de første 4 dagene av behandlingen. I motsetning konsentrasjoner av As
4O
6 høyere enn 3 um syntes å være cytotoksiske. I co-behandling gruppe som
4O
6 og PDT, mer signifikante effekter på celleveksthemming og mer morfologiske endringer ble funnet, i forhold til hver enkelt behandlingsgruppe. Det har vært kjent at antitumormidler generere reaktivt oksygen og reaktive nitrogenforbindelser for å indusere apoptose og nekrose av cellen [17] – [19]. Som en av de antitumormidler, for å antitumormekanisme av arsenforbindelse generere reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser i kolorektal kreft cellelinje er også blitt rapportert [20]. Tilførsel av tilstrekkelig oksygen og generering av reaktive oksygenarter (ROS) er kjent for å være viktige faktorer som bestemmer effekten av fotodynamisk terapi [4], [21]. Derfor induksjon av ROS mediert av antitumormidler kan ha bidratt til effektivisering av PDT.
Neste, vi forhold analysert endring av intracellulære signalveien for hver enkelt- /co-behandlingsgruppen, ved hjelp av RT
2Profiler
TM PCR matrise-metoden, og disse resultatene ble bekreftet av real-time PCR undersøkelse ved hjelp av 13 forskjellige primere. Ved hjelp av sanntids-PCR-metoden, analyserte vi endring i ekspresjonsnivåene av 84 gener som er involvert i 15 signalveier. Vi har funnet betydelige endringer i ekspresjonsnivåer for gener som er kjent å være involvert i celleoverlevelse veien (f.eks Naip1, tert, Aip1, etc.), p53 pathway (f.eks Bax, p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, Mdm- 2, etc.), og NFAT (nukleær faktor på aktivere T-celle) veien (f.eks Ly-12, CD178, IL-2, etc.) som er involvert i modulering av immunresponsen. Spesielt ekspresjonsnivåer av Naip1, som er kjent som apoptose hemmende gen, og tert, den telomerase revers transkriptase, ble redusert i hver celle overlevelse vei, mens uttrykket nivået av indusering av apoptose-genet Aip1 ble forbedret. Videre PCR matrise resultater viste reduserte nivåer av tert-genekspresjon på 2,7, 17,1 og 34,6 fold i As
4O
6 alene, PDT alene, og co-behandlingsgruppene, henholdsvis, som hver sammenlignet med kontrollgruppen . Tert-genet er kjent for å være forbundet med aktivering av telomerase, og i tilfelle av livmorhalskreft, synes det c-myc-genet for å indusere telomerase aktivering av tert-ekspresjon [22]. Derfor foreslår vi at nedregulering av tert-genet indusert av denne co-behandling av As
4O
6 og PDT kan ha vært involvert i celledød. Inhiberingen av tert-genet ble også bekreftet av real-time PCR undersøkelse utført etter RT
2 Profiler
TM PCR rekke analyse, og denne reduksjon av tert genekspresjon nivået ble konsekvent vist i ko-behandlingsgruppen, både
in vitro Hotell og
in vivo
.
Vi har også observert endringer i uttrykket nivåer av p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, og Mdm-2 gener, kjent for å være involvert i p53 vei, og det co-behandlingsgruppen viste mer betydelig økning i forhold til hvert enkelt behandlingsgruppe. Men noen vesentlig endring av Bax genekspresjon (kjent for å bli aktivert av p53) ble ikke observert. Videre fra fravær av vesentlige endringer av p53 nivå, disse endringene av p21, Fas, Gadd45, IGFBP-3, og Mdm-2 genuttrykk nivåer synes å være mediert av p53-uavhengig veier.
I tillegg , tatt i betraktning uttrykket nivåer av gener som Ly-12, CD178, og IL-2, som er kjent for å være involvert i NFAT reaksjonsveien, økt Ly-12 ekspresjon, mens CD178 og IL-2 uttrykk heller redusert i ko-behandlingsgruppen, sammenlignet med hvert enkelt behandlingsgruppe. Som den intracellulære sti NFAT har vært kjent for å være assosiert med økt immunresponser, vi forventet at det skulle bli oppregulert ved PDT; imidlertid genekspresjon nivåer i denne reaksjonsvei, inkludert IL-2, ble redusert etter PDT behandling og videre nedgang ble funnet i ko-behandlingsgruppen. Men da vi prøvde å bekrefte resultatene av RT
2Profiler
TM PCR array ved hjelp av real-time PCR-metoden, fant vi motsatte resultater i forhold til de av RT
2Profiler
TM PCR array, dvs. IL-2 uttrykk redusert i PDT alene behandlingsgruppe og økte i co-behandlingsgruppen, både som viser lignende resultater under
in vitro Kjøpe og
in vivo
forhold. Det ble rapportert at PDT kan stimulere svulstvekstfremmende immunsignaler og kan forbedres ved å kontrollere uønsket vekst-stimulerende trasé [23], [24]. Derfor våre resultater for IL-2 ser ut til å vise at PDT redusert ekspresjon av dette genet, mens det ble økt med arsenforbindelsen behandling, noe som indikerer at kombinasjonsterapi kombinere to fordeler ved å indusere immunmediatorer og antitumorvirkninger. I tillegg økte dette samtidig behandling
in vitro Hotell og
in vivo
uttrykk nivåer av CD5-genet og Ly-12 opp til 23 og 26 ganger, henholdsvis. Imidlertid gjorde ekspresjonsnivåer av Ly-12 eller IL-2 ikke viser betydelige endringer i PDT-behandling alene gruppe; Derfor vil den økte genekspresjon så ut til å bli indusert av arsenforbindelse. Så langt har imidlertid ingen andre studier har rapportert forholdet mellom den kombinerte PDT-As
4O
6 behandling og NFAT vei, og mer intensive studier bør gjennomføres.
På samme måte vår TC-en cellelinje-transplantert musemodell viste signifikant forbedret antitumor effekt i PDT og som
4O
6 co-behandlingsgruppen, sammenlignet med hver enkelt behandlingsgruppe. For å identifisere den mekanismen for denne virkning, utførte vi real-time PCR-eksperiment ved å bruke 10 forskjellige primere og endelig observert signifikante endringer i ekspresjonsnivåer for gener som er kjent for å være involvert i celleoverlevelse vei, p53 veien, og NFAT sti, lik med de som er hentet fra
in vitro
eksperimenter. Vår western blot data viser at samtidig behandling økt uttrykk av p53, p21, Gadd45 7 dag sammenlignet med mono behandling og kontroll. Aktivering av p53-protein spiller en viktig rolle i kontrollen av tumorcellerespons overfor kjemoterapeutiske midler og DNA-skadende midler. P21 og GaDD45, nedstrøms effektorer av p53, ble aktivert i kombinasjonsbehandling fremstilling av apoptose i TC-1 tumorceller. Disse resultatene antyder at apoptose kan være mediert gjennom p53 signalveien via oppregulering av proapoptotiske proteiner.
I løpet av PDT, intracellulær reduksjon av oksygen og kollapset blodkar kan indusere intracellulær hypoksi, og dette kan opp-regulerer nivået VEGF uttrykk for å katalysere angiogenese [25]. Mange studier på PDT har vært forsøk på å øke effektiviteten av denne fremgangsmåte ved å støtte generering av intracellulær ROS, eller ved å utføre denne fremgangsmåte i kombinasjon med flere inhibitorer av angiogenese, så som COX-2, MMP, eller VEGF [9], [ ,,,0],26] – [31]. Arsenforbindelser er for tiden anvendes som terapeutiske midler for akutt leukemi og ulike solide tumorer, og de har også blitt rapportert å generere ROS og inhiberer VEGF-ekspresjon [17], [19]. I denne studien vaskulær forstyrrelse effekten av As
4O
6 ble bestemt av Hoechst33342 perfusjon og CD31 immunhistokjemi flekker. Blood perfusjon området sank raskt etter som
4O
6 behandling. Fra 3 h tidspunkt, den sentrale delen av tumorer forsvant med hensyn til perfusjon aktivitet og, endelig, kan nesten ikke noe signal bli påvist i det hele tumorområdet, og med den ytre kant. Interessant nok var denne reduksjon av perfusjonen området gjenvunnet fra 24 timers tidspunktet, og den florescence dukket opp fra den ytre kant tydelig etter 48 og 72 timer. Selv om blodperfusjon syntes å bli utvunnet fra den ytre kant 72 timer etter behandling, ble det ikke påvist signal fra innsiden av tumorene. Disse data viste at mye mer intensive immunoreaktive microvessels ble observert i tumorvev fra mus behandlet med PBS, men lite CD31-farging var tilstede i det sentrale område av tumorvev fra mus behandlet med As
4O
6. Resultatene ekko de av studier som involverer Som
2o
3 og Conbretastatin A-4 [32], [33]. Som
2o
3 nedsatt blod perfusjon i forhold til kontrollene opp til seks timer etter som
2o
3 behandling med noen bedring på 24 timer [32], og også CA-4-P, 24 h etter behandling på P22 svulster vaskulære funksjoner vises delvis gjenopprette [33]. Derfor, i denne studien, vi brukte en av arsenforbindelser, dvs. As
4O
6, i kombinasjon med PDT metode for å undersøke den økende antitumoreffekt og også dets intracellulære signalveier. Disse data viste at effekten av behandlingen på combinatory VEGF og tilhørende banene ble forsterket med vurderingen av tumor-assosiert vaskulatur i dyremodellen og angiogenese markører i tumorlesjoner.
