Abstract
Bakgrunn
samspillet mellom miljømessige kjemikalier og deres metabolitter med biologiske makromolekyler kan resultere i cytotoksiske og gentoksiske effekter. 4-aminobifenyl (4-ABP) og flere andre beslektede arylaminer er blitt vist å ha sammenheng involvert i induksjon av humane urinblæren kreft. Den genotoksiske og den kreftfremkallende virkninger av 4-ABP er utstilt bare når det er metabolsk omdannes til en reaktiv elektrofil, aryl nitrenium ioner, som senere binder seg til DNA og indusere lesjoner. Selv om flere studier har rapportert dannelse av 4-ABP-DNA-addukter, er det ikke et omfattende arbeid blitt utført for å undersøke immunogenisiteten til 4-ABP-modifiserte DNA og dets mulig involvering i dannelse av antistoffer i blærecancerpasienter.
metodikk /hovedfunnene
Menneskelig DNA ble endret av N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl (
N
OH-AABP), en reaktiv metabolitt av 4-ABP. Strukturelle forstyrrelser i
N
-OH-AABP modifiserte DNA ble vurdert av ultrafiolett, fluorescens, og sirkulære dichroic spektroskopi, samt ved agarosegelelektroforese. Gentoksisitet av
N
-OH-AABP modifiserte DNA ble konstatert av kometmetoden. Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) analyse av innfødte og modifiserte DNA-prøvene bekreftet dannelsen av
N Anmeldelser – (deoksyguanosin-8-yl) -4-aminobifenyl (DG-C8-4ABP) i
N
-OH-AABP skadet DNA. De eksperimentelt induserte antistoffer mot
N
-OH-AABP-modifisert DNA oppviste mye bedre gjenkjennelse av DNA isolert fra pasienter med blærekreft sammenlignet med DNA erholdt fra friske individer i konkurrerende binding ELISA.
Konklusjon /Betydning
Dette arbeidet viser epitop deling mellom DNA isolert fra pasienter med blærekreft og
N
-OH-AABP-modifisert DNA implicating rollen som 4-ABP metabolitter i DNA skader og neo-antigenepitop generasjon som kan føre til induksjon av antistoffer i blærekreftpasienter
Citation. Shahab U, Moinuddin, Ahmad S, Dixit K, Habib S, Alam K, et al. (2013) Gentoksisk Effekt av
N
hydroxy-4-Acetylaminobiphenyl on Human DNA: implikasjoner i blærekreft. PLoS ONE 8 (1): e53205. doi: 10,1371 /journal.pone.0053205
Redaktør: Rizwan Hasan Khan, Aligarh muslimske universitet, India
mottatt: 31 juli 2012; Godkjent: 26 november 2012; Publisert: 31 januar 2013
Copyright: © 2013 Shahab et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis finansiert av ICMR gi no. Immuno 18/11/18/2008-ECD-I (som nå står ferdig) og midlene fra Universitetet (Aligarh muslimske universitet). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA fra celler eksponert for et kjemisk kreftfremkallende nesten alltid inneholder et sett av strukturelt ulike kreftfremkall-nukleotid-addukter [1]. Det er mistanke om at misreplication eller misrepair av et delsett av disse addukter gir opphav til mutasjoner, som i sin tur kan være de genetiske forstadier til kreft fenotype. En slik karsinogen er 4-aminobifenyl, et aromatisk amin. Disse er i stand til å indusere en rekke toksiske effekter, inkludert kreft og met-hemoglobinemia [2]. 4-ABP er et miljø- og yrkes forurensning generert hovedsakelig fra sigarettrøyk, forbrenning av fossilt brensel og fra gummi, kull, tekstil og skrive ut industrien [3] – [5]. 4-ABP har vist seg å være en viktig etiologisk middel av human blærekreft, og også en potent urinblæren karsinogen i forsøksdyr [6], [7]. 4-ABP rester har blitt rapportert i hemoglobin og i DNA isolert fra blæren av røykere [8], [9]; potensielt impliserer 4-ABP i etiologien av blærekreft. Den kjemiske strukturen til 4-ABP og dens fysiologiske metabolitt,
N
-OH-AABP, legges ut som figur 1A
agarosegel-elektroforese av nativt og
N
. – OH-AABP modifisert humant DNA [b]. DNA-prøver fra baner 2-5 ble behandlet med økende konsentrasjon av
N
-OH-AABP. Felt 1: Native menneskelig DNA; Lane 2: Native menneskelig DNA med 0,378 mM
N
-OH-AABP; Lane 3: Native menneskelig DNA med 0,757 mM
N
-OH-AABP; Felt 4: Native menneskelig DNA med 1,136 mM
N
-OH-AABP; Lane 5: Native menneskelig DNA med 1,515 mM
N
-OH-AABP
gentoksiske og kreftfremkallende effekter er utstilt når 4-ABP er metabolsk omdannes til en reaktiv elektrofil.. Den primære trinnet er
N
oksidasjons av arylaminer og arylacetamides av spesifikke cytokrom
P
450 (CYP1A2) i levervevet [10], etterfulgt av konjugering av
N
hydroksylgruppen funksjon med acetat, sulfat, eller glukuronat [11] – [14]. De aktiverte elektro derivater av 4-ABP utøve sin gentoksisk effekt gjennom interaksjon med DNA danner addukter som har blitt rapportert for en rolle i blæren karsinogenese både i forsøksdyr [15] – [17] og mennesker [18], [19]. DNA-addukter er også rapportert ved eksponering av menneskelige blære celler til
N
-OH-ABP,
N
-OH-AABP og
N
-OAc-AABP [20 ] – [22]. Imidlertid har den store (80%) DNA-addukt dannet blitt identifisert som
N
– (deoxyguanosin-8-yl) -4-aminobifenyl (dG-C8-ABP) [19]. Selv om de største DNA-lesjoner er et resultat av kovalent adduktdannelse, disse metabolittene også forårsake oksidativ skade på DNA fremstilling av reaktive oksygenforbindelser [23] som til slutt å generere DNA-strengbrudd og base modifikasjoner slik som 8-oxo-guanin og relaterte produkter [24] [25].
virknings~~POS=TRUNC av ulike kreftfremkallende er bedre konstatert ved å analysere sin gentoksisitet [26]. Denne studien rapporterer strukturelle endringer i menneskelig DNA på inkubasjon med
N
-OH-AABP i 24 timer. Den modifiserte DNA ble preget av ulike spektroskopiske teknikker, gel elektroforese og termiske denaturering studier. Den gentoksisitet av
N
-OH-AABP ble konstatert gjennom kometmetoden. Antistoffer mot
N
-OH-AABP-DNA ble indusert i hunnkaniner og brukes som en immunkjemiske probe for å påvise lesjoner, forårsaket av fire-ABP metabolitter, i DNA av blærekreftpasienter.
Etikk Statement-
Denne studien ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee of JN Medical College, AMU, Aligarh, India (tillate no. 401 /CPCSEA). Blodprøver fra pasienter og friske individer ble samlet etter informert muntlig samtykke.
Materialer og metoder
N
-OH-AABP var fra Midtvesten forskningsinstitutt Kansas. Human placenta-DNA metylert kvegserumalbumin (MBSA), etidiumbromid, protein A-agarose (2,5 ml pre-pakket kolonne), anti-kanin IgG-alkalisk fosfatase-konjugater, p-nitrofenylfosfat, Tween-20, Freunds komplette ufullstendige adjuvans, Histopaque 1077, lavt smeltepunkt agarose (LMPA), RPMI 1640, Triton-X-100, trypanblått, og fosfatbufret saltvann (PBS) Ca
2 + og Mg
2+ var fra Sigma Chemical Company , USA. Polystyren mikrotiterplater flatbunnet ELISA-plater var fra Nunc (Danmark). Alle andre kjemikalier og reagenser som ble brukt var av høyeste analytisk kvalitet.
Modification of Human Placental DNA
humant placenta-DNA (15 uM) ble modifisert ved inkubering ved 37 ° C i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM og 1,515 mM) i
N
-OH-AABP i DMSO. Ubundne bestanddeler ble fjernet ved omfattende dialyse mot natriumfosfatbuffer (10 mM, pH 7,4) inneholdende 150 mM NaCl.
agarosegelelektroforese
Endringen i elektroforetiske mønster av nativt og modifiserte DNA ble observert på 1% agarose ved 30 mA i 2 timer i TAE-buffer (40 mM Tris-acetat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Gelene ble farget med etidiumbromid og visualisert under UV-lys.
Isolering av lymfocytter
hepariniserte blodprøver (2 ml) fra friske donorer og pasienter ble fortynnet hensiktsmessig i Ca
2+ og Mg
2 + gratis PBS. Lymfocytter ble isolert fra blod ved hjelp Histopaque 1077 og cellene ble endelig suspendert i RPMI 1640.
Levedyktighet Vurdering av lymfocytter
lymfocyttene ble kontrollert for deres levedyktighet før start og etter utløpet av reaksjon ved anvendelse av Trypan Blue utelukkelsestesten [27]. Levedyktigheten av cellene ble funnet å være større enn 93%.
lymfocyttbehandling
Lymfocytter (1 x 10
5-celler) ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av N-OH-AABP (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM, 1,515 mM) i et totalt reaksjonsvolum på 1 ml og inkubert ved 37 ° C i 90 min. Etter inkubering ble blandingen sentrifugert ved 4000 rpm, supernatanten ble kastet, og de pelleterte lymfocytter ble resuspendert i 100 ul PBS (Ca
2 + og Mg
2 + fri) og behandles videre for Comet assay.
Comet assay
Comet assay ble utført i henhold til protokollen gitt i en tidligere publikasjon fra vårt laboratorium [28].
Fysiokjemiske analyse
fluorescens analysen var utført på Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer. Prøvene ble eksitert ved 325 nm og emisjon profilen ble tatt opp i 500-700 nm område. Sirkulær dikroisme (CD) målinger av naturlig og modifisert humant DNA ble nedtegnet på Jasco J-815 spectropolarimeter i bølgelengdeområdet 220-400 nm. Alle skanninger ble målt ved et intervall på 1 nm.
High Performance Liquid Chromatography
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) analyse av native og modifiserte DNA ble utført på Biologic Duo strømningssystem, BioRad , (USA) utstyrt med UV-synlig fler bølgelengde detektor. Absorbansen ble overvåket ved 245 nm. I korte trekk 50 uM DNA-prøve ble hydrolysert i 0,1 N HCl (1 ml /mg DNA) ved 100 ° C i 30 minutter (for å frigjøre basene) og tørket under vakuum. Basene ble oppløst i 50 ul 0,1 M Tris-HCl-buffer, pH 8,5 og filtrert gjennom 0,42 um Milex, engangs Syring filter før lasting på C-18 reversfasekolonne (Supelco, Discovery 25 cm x 4,6 mm). Elueringsmidlet bufferen var 12,5 mM sitronsyre, 25 mM natriumacetat, 25 mM etylendiamintetraacetat (EDTA), pH 5,2 og en strømningshastighet på 1 ml /min ble opprettholdt gjennom.
immuniser
tilfeldige avlet, New Zealand Hvit (NZW) hunnkaniner ble immunisert som beskrevet tidligere [28], [29]. I korthet kaniner (n = 4; to hver for naturlig og modifisert DNA) ble immunisert intramuskulært på flere steder med 50 ug av de respektive antigener kompleksert med metylert BSA i 01:01 forhold (w /w) og emulgert med et like stort volum av Freunds adjuvans.
Rensing av antistoffer
immunoglobulin G (IgG) ble affinitetsrenset fra preimmun og immunsera på en protein A-agarose-kolonne [30]. Homogenitet isolerte IgG ble konstatert med 7,5% SDS-PAGE.
DNA fra humant blod
Blodprøver ble samlet i EDTA-ampuller fra ulike blærekreftpasienter og friske individer. Lymfocytt DNA ble isolert i henhold til produsentens instruksjoner. 5 ml blod ble tilsatt til 500 mL av Qiagen protease og deretter buffer AL (6 ml) ble blandet, etterfulgt av kraftig risting. Blandingen ble inkubert ved 70 ° C i 10 minutter og 5 ml etanol (98%) ble tilsatt til prøven, og blandet ved å snu røret og kraftig risting. Oppløsningen ble forsiktig overført til QIAamp Maxi kolonne plassert i et 50 ml sentrifugerør og sentrifugert ved 1850 x g (3000 rpm) i 3 min. Filtratet ble kastet og 5 ml Buffer AW2 ble tilsatt, og igjen sentrifugert ved 4500 x g (5000 rpm) i 1 min. Igjen 5 ml AW2-buffer ble tilsatt og sentrifugert ved 4500 x g (5000 rpm) i 15 min, og filtratet ble kastet. Deretter 600 ul av buffer AE ble helt direkte på membranen av kolonnen som senere ble inkubert i 5 minutter, og sentrifugert ved 4500 x g (5000 rpm) i 2 min. Elueringsmidlet ble lastet på nytt på membranen av kolonnen, inkubert i 5 minutter, og sentrifugert ved 4500 x g (5000 rpm) i 5 minutter. Elueringsmidlet inneholdende DNA ble lufttørket og oppløst i PBS, pH 7,4. Renheten og konsentrasjonen av DNA-preparat ble konstatert av A
260 og A
280 målinger.
ELISA
Spesifikk binding av antistoffer ble konstatert i konkurrerende bindingsprøve [31]. Prosent hemming ble beregnet ut fra den gitte formelen:.
Prosent hemming = 1- (A
hemmet /A
uhemmet) × 100
Diskusjon
Resultater og p > gelen mønster (figur 1 B) viser en økning i mobiliteten av modifisert DNA med økende konsentrasjon av
N
-OH-AABP (kolonnene 2-5). Maksimal mobilitet ble observert med 1,515 mM
N
-OH-AABP; og enhver ytterligere økning i konsentrasjonen resulterte i fullstendig tap av DNA-strukturen. Økningen i mobilitet av N-OH-AABP behandlede DNA kan være på grunn av genereringen av enkelttrådbrudd som kan resultere i dannelsen av liten størrelse DNA som har hurtigere mobilitet sammenlignet med nativt DNA i felt 1. Et tap i fluorescens DNA ble også observert som en funksjon av økning i konsentrasjonen av
N
-OH-AABP. Dette peker igjen mot skader på spiralformede DNA-strukturen.
Den encellede gelelektroforese (SCGE) eller komet analysen er en svært følsom metode for å evaluere DNA-skader. Under elektroforese den skadede DNA migrerer fra kjernen mot anoden, danner en form av en «komet» med et hode (cellekjernen med intakt DNA) og en hale (avslappet og brutt DNA). Derfor kan kometmetoden brukes til å teste gentoksisitet av kreftfremkallende stoffer i dyrkede celler inkludert nylig isolerte humane lymfocytter. I denne studien har vi brukt kometen-analyse for å analysere skader på humane lymfocytter DNA på
N
-OH-AABP behandling. De komet bilder, ved behandling av lymfocytter med forskjellige konsentrasjoner av
N
-OH-AABP, er presentert i Figur 2. En komet med en hale er en indikasjon på brudd i DNA enkelt celle gelelektroforese. Våre resultater klarlagt DNA-skader ved behandling med 1,515 mM
N
-OH-AABP, som tydelig fra dannelsen av distinkte halen fra diffust hodet (figur 2E). Vi har observert at med økende konsentrasjoner av
N
-OH-AABP, prosenten av DNA i hale også økt. På 0,378 mM konsentrasjon av
N
-OH-AABP, 19% av DNA ble funnet i halen. Men på 0,757 mM og 1,136 mM av
N
-OH-AABP andelen halen DNA økt til 27% og 58% henholdsvis. Det ytterligere økt til 89% på 1,515 mm
N
-OH-AABP. DNA-skade parametre, det vil si, oliven hale øyeblikk (OTM) og hale lengde ble også målt og funnet å være signifikant øket med 1,515 mM
N
-OH-AABP i forhold til 0,378 mm, 0,757 mm og 1,136 mM
N
-OH-AABP. En markert økning i OTM (94%) ble observert i lymfocyttene behandlet med 1,515 mM
N
-OH-AABP sammenlignet med kontroll (ubehandlede lymfocytter). Videre er en betydelig økning i halelengden ble også registrert. Den ble funnet å være 72% høyere enn den for ubehandlet lymfocyttkontrollen. Resultatene er oppsummert i tabell 1.
Alle lymfocyttene ble behandlet i 24 timer ved 37 ° C.
I en tidligere publikasjon, ble det observert 62% hyper ved 260 nm i UV-absorpsjonsspektrum
N
-OH-AABP modifisert humant DNA [32]. Den observerte hyper representerer eksponering av kromofore grupper som et resultat av dannelse av trådbrudd og dissosiasjon av hydrogenbindinger i tilfelle av modifiserte DNA.
Hverken nativt DNA eller dets modifiserte form har sin egen fluorescens og derfor en extrinsic fluoroforen , etiumbromid ble brukt for fluorescens spektroskopi av DNA og dets
N
-OH-AABP-modifisert form. Native og
N
-OH-AABP modifiserte DNA ble inkubert med etidiumbromid i 30 min og utslipp profilen ble registrert ved anvendelse av eksitasjon bølgelengde (325 nm) av etidiumbromid (figur 3A). En reduksjon på 43,17% i fluorescensintensiteten av modifisert DNA, sammenlignet med dens native form, innebærer forstyrrelser i DNA-dobbelt skruelinjeformet struktur som et resultat av
N
-OH-AABP modifikasjon.
fluorescens-emisjonsspektra av nativt humant DNA (—) og modifisert humant DNA med 1,515 mM
N
-OH-AABP (-) [a]. Rundskriv dichroic spektra av naturlig menneskelig DNA (-) og
N
-OH-AABP endret menneskelig DNA (—-) [b]
Endringer i DNA-strukturen var. evaluert av ellipticity målinger.
N
-OH-AABP modifiserte DNA viste en 5 nm shift (275-280 nm) i CD signal sammen med en økning i ellipticity 5,57 til 9,27 mdeg (figur 3B), noe som indikerer strukturelle endringer i DNA-molekylet. Økningen i elliptisitet tilsvarer 39,9% tap i den DNA-strukturen ved modifisering. Denne strukturelle tap kan skyldes unstacking av DNA-baser som følge av heliks destabilisering. De strukturelle forstyrrelser foreslår utfoldelsen av DNA, kan skyldes den generasjonen av enkelttrådbrudd.
Figur 4A og 4B viser representative HPLC kromatogrammer av syre hydrolysert prøver av innfødte og
N
-OH- AABP endret menneskelig DNA hhv. Veldefinerte topper på oppholdstid 4,467 min, 7,332 min og 8,727 min ble observert i native menneskelig DNA. Imidlertid, i tilfelle av modifiserte DNA disse toppene forskyves til 4,631 min, 7,443 min og 9,164 min henholdsvis, noe som tyder på modifisering av DNA-baser. Den ekstra topp ved en retensjonstid 22,029 min i det sure hydrolysat av modifisert DNA er karakteristisk for dG-C8-4-ABP-addukt, en kjent markør for DNA skades av 4-ABP og
N
-OH- AABP [33]. Identifiseringen av DG-C8-4-ABP addukt er i overensstemmelse med de publiserte rapporter om DNA-addukter med arylaminer i forsøksdyr [15] – [17]. Lignende DNA-addukter er rapportert i biopsiprøver av menneskelig urinblæren [18], [19].
Representant HPLC kromatogram av syre hydrolysat av
N
-OH-AABP endret menneskelig DNA [b].
Kvinner kaniner immunisert med
N
-OH-AABP endret menneskelig DNA viste kraftig humoral respons utløse høy titer immunogen spesifikke antistoffer. De eksperimentelt induserte antistoffer ble brukt som en immunkjemiske probe for å oppdage
N
-OH-AABP eller relaterte arylaminer indusert lesjoner i genomisk DNA av blærekreftpasienter. Bindingsmønsteret av DNA isolert fra pasienter med blærekreft ble helt avslørende i konkurrerende inhiberingsanalyse. Hemming av anti-
N
-OH-AABP-DNA IgG av lymfocytt DNA fra pasienter med blærekreft ble spilt inn i området fra 60,5% til 77,6%. Mens inhibering forårsaket av lymfocytt-DNA fra normale, friske individer var ganske lav (tabell 2). Betydelig høy anerkjennelse av lymfocytt DNA fra pasienter med blærekreft ved eksperimentelt induserte antistoffer mot
N
-OH-AABP modifisert DNA er en klar indikator på epitop deling mellom genomisk DNA av blærekreftpasienter og det menneskelige DNA endret
in vitro
av
N
-OH-AABP. Dette fører til den konklusjon at
N
-OH-AABP, eller et beslektet arylamin, genererer ny-epitoper på DNA-molekylet som er anerkjent som «
fremmed
«eller
ikke- selv
av immunsystemet som resulterer i autoantistoff generasjon i blærekreftpasienter. Betydelig høy anerkjennelse av genomisk DNA fra pasienter med blærekreft ved eksperimentelt induserte antistoffer mot
N
-OH-AABP endret menneskelig DNA er et bevis mot involvering av modifiserte baser og enkelttråd regioner i sykdommen patogenesen .
bekreftelser
forfatterne erkjenner Infrastruktur støtte fra DST-FIST innretningen av instituttet.
