Abstract
Den første Hensikten med denne studien var å identifisere romanen serum diagnostiske markører for menneskelig eggstokkreft granulosa celle tumor (GCT), en svulst som representerer inntil 5% av alle eggstokkreft. For å omgå mangelen på menneskelig vev tilgjengelig for analysene brukte vi
Ctnnb1
tm1Mmt /+;
PTEN
tm1Hwu /tmiHwu;
Amhr2
tm3 (CRE) Bhr /+ transgen musemodell, som har den konstitutive aktivering av CTNNB1 signale kombinert med tap av
PTEN
i granulosa celler og utvikler GCT som etterligner aggressive former av sykdom hos mennesker. Proteomikk profilering av massespektrometri viste at vinculin, enolase en, flere varmesjokkproteiner, og valosin inneholder protein (VCP) ble mer rikelig utskilt av dyrkede mus GCT celler i forhold til primær kultivert GC. Blant disse proteinene, bare VCP var til stede i betydelig økt nivå i preoperativ serum av GCT kreftpasienter sammenlignet med friske personer. For å bestemme spesifisiteten av VCP, ble serumnivåer også målt i eggstokk-karsinom, non-Hodgkins lymfom og bryst, tykktarm, bukspyttkjertel, lunge og prostata kreftpasienter. Økte serum VCP nivåer ble observert i de fleste krefttilfeller, med unntak av pasienter med lunge- og prostatakreft. Videre ble serum VCP nivåene økt i noen GCT, eggstokk-karsinom, brystkreft, og tykktarmskreftpasienter som ikke hadde noe annet viser økte nivåer av brukte serum tumormarkører for deres krefttype (f.eks inhibin A, inhibin B, CA125, CEA, eller CA15.3). Disse resultatene viser potensialet bruk av VCP som svært sensitive serum markør for GCT samt flere andre menneskelige kreft
Citation. Lague MN, Romieu-Mourez R, Bonneil É, Boyer A, Pouletty N, Message Masson AM, et al. (2012) proteomikk Profilering av en musemodell for Ovarian granulosa- Cell Tumor Identifiserer VCP som en svært følsom Serum svulst markør i flere kreft hos mennesker. PLoS ONE 7 (8): e42470. doi: 10,1371 /journal.pone.0042470
Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 13 april 2012; Godkjent: 09.07.2012; Publisert: 01.08.2012
Copyright: © lague et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av driftsstøtte MOP-102508 fra den kanadiske Institutes of Health Research og Canada Research Chair i eggstokk molekylærbiologi og funksjonell genomforskning. The University of Virginia forskningssenter for Reproduksjon Ligand analyse og analyse Kjernen er støttet av National Institutes of Health NICHD (SCCPRR) Grant U54-HD28934. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Serum markører er av stor verdi for klinisk screening, diagnostisering og oppfølging av kreft. En ideell men da bør ha høy følsomhet og /eller høy spesifisitet, for å diskriminere kreftpasienter fra friske individer, så vel som fra pasienter med benigne tumorer eller ikke-relaterte tilstander. De fleste for tiden anvendte serum markører er hormoner, glykoproteiner, eller andre proteiner som overuttrykt av kreftceller. Disse markørene er vanligvis ikke spesifikke for et unikt krefttype og ofte mangler følsomhet [1]. Flere strategier er nylig blitt foreslått for å identifisere nye serum tumormarkører [2]. Differential proteomic analyse av serumprøver fra kreftpasienter og friske forsøkspersoner er metoder for valg, men er hemmet av det sparsommelige materiale i sjeldne kreft, så vel som av vanskeligheten i å påvise proteiner som blir uttrykt ved lave nivåer sammenlignet med rikelig normale serumproteiner. En alternativ to-trinns metode involverer den første identifisering av proteiner som blir differensielt uttrykt og /eller utskilt mellom normale og tumorceller, etterfulgt av identifisering av disse proteiner i serum hos kreftpasienter. Denne tilnærmingen krever ideelt isolering av primære tumorceller og de tilsvarende normale celler. I denne sammenheng, kan bruk av relevante dyremodeller for tumorutvikling gir viktige utgangsmaterialer for proteomikk eller genomisk analyse, og føre til identifikasjon av tumorspesifikke kandidat proteiner eller gener hvis ekspresjon kan deretter bli undersøkt i prøver fra mennesker, som demonstrert i eggstokkreft [3], [4], [5].
eggstokkreft granulosa celle tumor (GCT) er den mest utbredte av sex snor /stromal undergruppe av ovarietumorer hos kvinner, og er tenkt å representerer opp til 5% av alle ovarie cancer. I løpet av de siste årene, har vår gruppe fokusert på klarlegging av den molekylære etiologi av menneskelig GCT, samt på etablering av relevante dyre GCT modeller. Vi fant bevis for at misregulation av både Wnt /CTNNB1 (ß-catenin) og PI3K /AKT signalveier oppstå i menneskets GCT [6], [7]. Transgene mus med konstitutiv aktivering av CTNNB1 i granulosa celler (GC,
Ctnnb1
tm1Mmt /+;
Amhr2
tm3 (Cre) Bhr /+) utvikler forstadier eggstokkene lesjoner som ofte utvikle seg til GCT senere i livet [6]. Tapet av PI3K /AKT signaliserer antagonist genet
PTEN
i GC sjelden fører GCT, men samtidig aktivering av CTNNB1 og tap av
PTEN
i
Ctnnb1
tm1Mmt /+;
PTEN
tm1Hwu /tm1Hwu;
Amhr2
tm3 (CRE) Bhr /+ (CPA) modellresultatene i utviklingen av aggressive, metastatisk GCT med 100 % pene [7]. Vi har foreslått at CPA-mus er den beste modellen for tiden tilgjengelig for analyse av GCT biologi, så vel som for prekliniske dyrestudier rettet mot utvikling av nye terapeutiske intervensjoner og /eller diagnostiske verktøy.
Vi antok at CPA-mus modellen kan brukes til identifisering av differensielt uttrykte, GCT-assosierte proteiner, og at disse vil oversette til klinisk nyttige nye serum diagnostiske markører for sykdom hos mennesker. Her presenterer vi en differensial secretome analyse som sammenligner primær kultivert GC fra normal mus til GCT celler fra CPA mus. Denne tilnærmingen førte til identifisering av vasolin inneholder protein (VCP) som en potensielt klinisk relevante serummarkør for menneskelig GCT, så vel som for andre former for kreft.
Resultater
Identifisering av proteiner utskilt selektivt i mus GCT
proteomikk profilering ble brukt med sikte på å identifisere utskilte proteiner som kan utgjøre ny serum diagnostiske markører spesifikke for GCT. Brukte kulturmedier ble innhentet fra dyrkede GCT celler fra CPA mus eller fra normal GC fra EKG-stimulerte eggstokkene. Proteiner fra media ble separert ved SDS-PAGE og fjorten proteinbånd ble observert i GCT men ikke i GC-medium ble utsatt for massespektrometri-analyse (figur 1). Denne prosessen identifisert en rekke proteiner som ble mer rikelig utskilt eller skur av GCT celler i forhold til normal GC (tabell 1). VCL, ENO1, flere varmesjokkproteiner (HSPA8 /HSC70, de konstitutive og induserbare HSP90 alfa isoformene HSP90ab1 og HSP90aa1, og HSPA4), og VCP var de mest konsekvent identifisert proteiner fra GCT secretome.
Prøver ble separert med 10% SDS-PAGE etterfulgt av sølvfarging. Pilene viser eksempler på proteiner uttrykt selektivt i GCT cellekulturmedier, sammen med omtrentlige molekylvekter. Et totalt 3 geler med forskjellige akrylamidinnholdet ble studert og 14 bånd (med proteiner fra 12 til 116 kDa) ble underkastet massespektrometri-analyse. Bare én av de 3 gels er vist på figuren.
VCP er et serum markør for GCT og andre krefttyper
Vi neste undersøkt om proteiner utskilt av GCT celler fra CPA mus kan tjene som serummarkører i menneske GCT pasienter. Menneske homologer av ni proteiner identifisert i secretome analysene (B2M, CTSB, HSPA4 /HSP70, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCP, VCL, og WIF-1) ble valgt for videre studier basert på kjente genet funksjoner og antistoff tilgjengelighet. Serumprøver ble oppnådd fra friske frivillige og fra pasienter med GCT før behandling. Ingen signifikante forskjeller i nivåene av B2M, CTSB, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCL eller WIF-en ble observert av immunoblot analyser i serum hos GCT pasienter sammenlignet med friske personer (data ikke vist). Marginalt økte nivåer av HSP4A ble observert i serum hos noen GCT pasienter sammenlignet med friske personer, men forskjellene var ikke statisk signifikant, og anses ikke å ha klinisk nyttig (Figur 2A). VCP nivåene var lave i immunoblot analyser av serumprøver fra friske personer, men ble betydelig økt i de fleste av serumprøver fra GCT pasienter (
P
0,05). Med en referanseverdi for VCP nivåer satt til gjennomsnittet av immunoblot bandet intensitetsverdiene for friske kontroller pluss to ganger standardavviket, observerte vi at 8 av 9 kvinner med GCT vises økt serum VCP nivåer (figur 2B, tabell 2). For å bestemme spesifisiteten av VCP som en tumormarkør for GCT ble serumnivåer VCP vurdert hos pasienter med ovariekarsinomer, samt i små kullet pasienter med store ikke-eggstokk-kreft med kjent histologi og grad (tabell 3). Overraskende ble det funnet forhøyede serum VCP nivåer påvist i klinisk signifikant andel pasienter med eggstokk-karsinom (8 8), brystkreft (5 av 12), tarmkreft (7 av 12), kreft i bukspyttkjertelen (8 av 12) eller ikke-Hodgkins lymfom (5 av 12) (figur 2B og tabell 3). Men serum VCP nivåer ble ikke menings økt hos pasienter med lungekreft eller prostatakreft.
(A) HSPA4 nivåer i serum hos kvinner med GCT eller ovarialcancer. Like mengder av serum protein ble separert ved SDS-PAGE og ble underkastet immunoblotanalyse for HSPA4 nivåer (representative blot er vist i toppanelet, hver passasje representerer en enkelt donor). Densitometri analyser av signaler som oppnås med de HSPA4 Immunoblotanalyse analysene er rapportert i et diagram hvor hvert punkt representerer en enkelt donor (nederst, horisontale linjen = middelverdi). Ingen signifikant forskjell i HSPA4 nivåer ble påvist blant grupper ved en-veis ANOVA. (B) VCP verdiene øker i serum hos kreftpasienter. Sera ble analysert som i (A) i nærvær av VCP hos pasienter med bryst, kolon, lunge, bukspyttkjertel eller prostata cancer, eggstokk-karsinom, GCT, eller non-Hodgkins (NH) lymfom. Statistisk signifikante forskjeller (
P
0,05). Ble påvist mellom kontroll (normal) og GCT og tykktarmskreft grupper
spesifisitet og sensitivitet av VCP i forhold til mye brukte serum diagnostiske markører
neste forhold relevansen av VCP som andre vanlig brukte serum diagnostiske markører for ulike krefttyper. For tiden er de mest nyttige serummarkører for GCT hos postmenopausale kvinner inhibin A og inhibin B [8]. I vår kohort, ble inhibin A og inhibin B-serumnivåene økes 5 ut 9 og 7 ut av ni pasienter med GCT (tabell 2), henholdsvis. Det var ingen klar sammenheng mellom preoperative nivåer av inhibin A, inhibin B og VCP i GCT pasienter, ikke desto mindre en pasient hadde upåviselige serumnivåer av inhibin A og inhibin B, men sterkt økte nivåer av VCP (tabell 2). Sensitiviteten av VCP synes derfor å sammenligne gunstig til den av inhibiner og VCP kan tjene til å identifisere sjeldne inhibin-negative GCT pasienter. Serum CA125 er økt i ca 50% av kvinner med tidlig eggstokkkreft og i over 80% av kvinner med avansert sykdom, og er nyttig for å overvåke terapi [9]. I vår lille ovarialcancer årsklasse, fire av åtte pasienter testet positivt for CA125, mens VCP måling påvist kreft hos alle pasienter, inkludert de negative for CA125 (figur 3). CEA er den mest brukte serum tumormarkør for tykktarmskreft. Serum CEA er forhøyet i løpet av mindre enn 25% av tidlig fase kreft i tykktarmen, og 75% av sent stadium kreft og er nyttig for å bestemme prognosen, overvåking og behandling overvåking [10]. I de 12 kolon kreftpasienter som vi testet, fem var positive for CEA. VCP måling påvist kreft i alle CEA-positive pasienter, i tillegg til to som var CEA-negative (figur 3). CEA og CA15.3 er de mest brukte blodprøver for brystkreft. Vurdering av disse markørene er ikke anbefalt for prognosen, men heller for postoperativ oppfølging samt overvåking i avanserte sykdommer [10]. I det 12-sak kohort som vi undersøkt, 3 pasienter testet positivt for enten CEA eller CA15.3, og resten negative for begge. VCP nivåer ble forhøyet i alle tre pasienter som var CEA- eller CA15.3-positive, og også i tre pasienter som var negative for begge merkene (figur 3). Således VCP serumnivåene ble signifikant økt i de fleste av de testede cancerpasienter, også i noen ellers negative for etablerte serumtumormarkører.
Sera fra pasienter ble testet for VCP nivåer av immunblot analyser og den stiplede linje viser VCP cutoff verdier etablert i friske donorer. I tillegg ble sera testet ved hjelp av ELISA med hensyn til nærvær (+) eller fravær (-) av økte nivåer av CA125 i eggstokk-karsinom, CEA i tykktarmskreft, eller CEA og CA15.3 i brystkreft. Den normale nivåer av CA125, CEA, og CA15.3 er under 35 U /ml, 7 g /l og 29 kU /l, henholdsvis.
Diskusjoner
VCP protein er en AAA + ATPase forbundet med ulike cellulære aktiviteter. VCP er nødvendig for å opprettholde celleprotein homeostase og regulerer ekspresjon av proteiner involvert i mange funksjoner slik som DNA-replikasjon, mitose, proteindegradering, endocytose, membranfusjon, organeller og biogenese. Spesielt virker VCP på ubiquitinmolekyler underlag molekyler og regulerer protein omsetningen ved å balansere proteosomal degradering av løselige proteiner eller misfoldede proteinaggregater lokalisert i ER lumen eller cytosol. Avhengig conformational gjenoppretting av komplekser med VCP og målet protein underlag, VCP enten fremmer deres fornedrelse, segregerer dem fra store protein komplekser, eller modulerer deres ubiquitinering av konkurrerende ubiquitin konjugering og Dekonjugering machineries (anmeldt i [11]). VCP forbinder med tallrike ubiquinated substrater, og funksjonene av VCP i ulike celletyper er relatert delvis til spesifikke vev ekspresjon av substrater og kofaktorer. I nevroner og muskelceller, VCP interaksjon med NF-1, UNC45b, og caveolin-3 regulerer synaptogenesis og myofibrogenesis (anmeldt i [12]). Noen autosomal dominant mutasjoner i VCP genet årsaken inklusjonslegeme myopati med Paget sykdom av bein og frontotemporal demens (IBMPFD) som er en sjelden, sen alder innsettende arvet degenerative lidelse som kan påvirke muskler, bein og hjerne [13]. I tillegg til grunnleggende funksjoner i homeostase, ble VCP vist seg å regulere halveringstiden og nivåene av flere proteiner med kreft-modulerende funksjoner. For eksempel, VCP i samarbeid med flere ubiquitin ligaser regulerer turn-over av IkappaB [14], HIF-1 [15], p53 [16], eller ErbB3 [17]. Mutasjoner og /eller misregulation av VCP funksjoner i kreftceller er fortsatt ikke godt karakterisert, som er deres mulige årsaksvirkninger i tumorigenesis. Ikke desto mindre, overekspresjon av VCP har nylig blitt dokumentert
in situ
i et bredt spekter av humane krefttyper, og analyser av store pasientkullene viste signifikant høyere ekspresjonsnivåer av VCP av tumorceller ofte korrelerer med sykdomsprogresjon [18] , [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Imidlertid er den første til å identifisere økte VCP nivåer i serum hos kreftpasienter den foreliggende rapport.
Til sammen våre resultater indikerer at VCP representerer en svært følsom og potensielt klinisk nyttig serum tumor markør for en rekke human kreft. Selv om sin mangel på spesifisitet for et enkelt krefttype tyder på at det er usannsynlig at VCP serum målingen kan brukes som et screening-verktøy, dets følsomhet tilsvarende eller bedre enn mange vanlig brukte markører indikerer at det kan brukes i anvendelser som overvåking behandlingseffekten eller overvåking for tilbakefall av sykdommen. I tillegg VCP kunne brukes til diagnose i forbindelse med flere kreft type-spesifikke markører for å øke den totale følsomheten til analysen. Screening av mye større kullene vil være nødvendig for å bestemme følsomheten av serum VCP måling for påvisning av ulike stadier av kreft progresjon, og forskjellige kreft subtyper. Videre vil det spesielle ved VCP med hensyn til påvisning av neoplastiske vs ikke-neoplastisk sykdom må vurderes før sin nytte som en svulst markør kan dokumentert. Som immunoblotting er begrenset både i form av quantitativeness og teknisk funksjonalitet, vil storskala screening krever utvikling av en høy gjennomstrømming ELISA-analysen for VCP.
I sammendraget, våre resultater viser at proteomikk profilering av tumor secretomes fra klinisk relevante musemodeller kan føre til identifikasjon av kandidat sirkulerende proteiner forbundet med tumorigenesis hos mennesker. Vi rapporterer at VCP er overuttrykt i serum hos kreftpasienter, og at det kan representere en ny klinisk nyttig markør for diagnose av kreft.
Materialer og Methods
Mice
Ctnnb1
tm1Mmt/+;
Pten
tm1Hwu/tm1Hwu;
Amhr2
tm3(cre)Bhr/+ (CPA) transgene mus ble samlet som tidligere beskrevet [7] og opprettholdt på en C57BL /6 genetisk bakgrunn. I disse musene, konstitutiv aktivering av CTNNB1 signalering er på grunn av delesjon av det tredje ekson av
Ctnnb1
, noe som resulterer i produksjon av en dominant-stabil CTNNB1 mutant protein som mangler fosforyleringsseter som kreves for sin proteosomal degradering [ ,,,0],6]. CPA mus utvikler GCT perinatalt og dø før 8 ukers alder [7]. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité og ble i samsvar med USPHS politikk på Humane Stell og bruk av forsøksdyr.
Cell kultur
Normal GC ble isolert ved hjelp av metoden beskrevet av Železnik et al. [26]. Kort sagt ble umodne (23-26 dager gamle) C57BL /6 mus injisert I.P. med 5 IU hest choriongonadotropin (EKG, Folligon, Intervet, Schering-Plough) for å indusere follikulær vekst. Førti-åtte timer senere, ble dyrene avlivet og eggstokkene punktert med en 25 gauge nål for å frigjøre GCer inn i mediet (0,9% NaCl). Cellesuspensjonen ble sentrifugert ved 1000
g
i 5 minutter og resuspendert GC ble sådd ut i 24 brønners plater ved 70% konfluens i DMEM /F12-medium (Sigma Aldrich) supplert med 5% FBS (Invitrogen), penicillin og streptomycin (P /S). GCT 21-25 dager gamle CPA mus ble skåret ut, hakket med en størrelse 10 skalpellblad og spaltet i 2 timer med 0,1% kollagenase fra
Clostridium histolyticum plakater (Sigma) i serumfritt DMEM med P /S . Cellene ble så sentrifugert ved 1000
g
i 10 min og resuspendert i DMEM supplert med 10% FBS og P /S før plettering i 100 mm cellekulturskåler (25 x 10
6 celler /skål) .
Differensial secretome analyserer
Tjuefire timer etter plating, kultivert GC og GCT cellene ble vasket med HBSS (Invitrogen) og inkubert i 24 timer i serumfritt DMEM. Supernatanter ble oppsamlet og konsentrert 80 ganger ved å bruke Amicon ultra-4 sentrifugale filterenhetene (Millipore) med en 3 kDa molekylvekt cut-off. Proteinkonsentrasjoner ble kvantifisert ved anvendelse av metoden til Bradford (Bio-Rad proteinanalyse) og 4-6 ug proteinprøver ble separert ved SDS-PAGE. Etter sølvfarging, proteiner båndene funnet i GCT men ikke i GC-prøver (n = 14) ble kuttet ut fra gelen. Gelen Skivene ble avfarget med 50% metanol og deretter redusert i 10 mM DTT i 1 time ved 56 ° C og alkylert i 55 mM kloracetamid i en time ved romtemperatur. Etter vasking i 50 mM ammoniumbikarbonat ble gelbitene krympet på 100% acetonitril (ACN). Fordøyelsen ble utført ved anvendelse av trypsin i 50 mM ammoniumbikarbonat i 8 timer ved 37 ° C. Peptidene ble til slutt ekstrahert i 90% ACN /0,5 M urea og tørket i en speed vakuum. Prøvene ble gjenoppløst i 5% ACN med 2% maursyre (FA) og separert på en hjemmelaget C
18-kolonne (150 pm x 10 cm) under anvendelse av en Eksigent nanoLC-2D-system. En 56-min gradient 5-60% ACN (0,2% FA) ble anvendt for å eluere peptidene fra en hjemmelaget reversert-fase-kolonne (150 um i.d. x 100 mm) med en strømningshastighet innstilt på 600 nanoliter /min. Kolonnen ble koblet direkte til en nanoprobe tilkobles med en LTQ-Orbitrap Velos massespektrometer (Thermo-Fisher). Hver fullstendig MS-spektrum ble etterfulgt av tolv MS /MS-spektra (tretten hendelser scan), hvor de tolv mest tallrike formere-ladede ioner ble valgt for MS /MS-sekvensering. Tandem MS-eksperimenter ble utført ved anvendelse av kollisjons-indusert dissosiasjon i den lineære ionefelle. Dataene ble behandlet med 2,1 Mascot (Matrix Science) søkemotor med toleranse parametere satt til 15 ppm og 0,5 Da for forløperen og fragmentioner hhv. De valgte variable modifikasjoner carbamidomethyl (C), deamidering (NQ), oksidasjon (M) og fosforylering (STY). Den valgte databasen var menneskelig IPI database v.3.54 med 150858 sekvenser.
Serumprøver
Serumprøver fra pasienter med brystkreft, tykktarm, lunge, bukspyttkjertel eller prostatakreft, eller non-Hodgkin lymfom ( n = 12 for hver krefttype) ble oppnådd fra Ontario Tumor Bank. Serumprøver fra friske frivillige (n = 7) og pasienter med GCT (n = 9) eller ovarialcancer (n = 8; 2 klarcellet, 2 serøs, 2 mucinous og to endometrioid eggstokkreft) ble hentet fra Réseau de recherche DU kreft du Fonds de recherche Québec – Santé. Prosedyrene ble godkjent av FRQS-RRCancer forskningsutvalget og Ontario Cancer Research Ethics Board, samt Comité d’éthique de la recherche sur les sujets humains av Centre Hospitalier de l’Université de Montréal. Inhibin A og inhibin B nivåer ble bestemt ved ELISA ved University of Virginia forskningssenter for Reproduksjon Ligand analyse og analyse Core. Verdier for inhibin A og B under deteksjonsgrensen (13 ng /l og 20 ng /l, henholdsvis) ble definert som normal. CA15.3 og CEA nivåer ble bestemt ved les Laboratoires du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal. -Verdier under 7 ug /l og 29 kU /l for CEA og CA 15.3, henholdsvis, ble ansett som det normale. CA125-nivåer ble bestemt ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig ELISA assay kit og nivåer ble ansett som normalt når under 35 U /ml (Abnova).
Immun analyserer
serumprøver (4 pl dvs. ca 200 mikrogram ) ble separert ved SDS-PAGE på 10% akrylamid geler. Gelene ble overført til polyvinylidenfluorid membraner (Amersham GE /VWR). Immundeteksjon ble utført med HSPA4- eller VCP-spesifikke antistoffer (kloner ab75977 eller ab11433 henholdsvis Abcam) og pepperrot peroksidase-konjugert sekundære antistoffer (GE Amersham /VWR) og avslørt ved hjelp av ECL Detection Reagenser (GE Amersham /VWR). Kvantifisering av proteinbåndene ble utført ved densitometri analyser med en Kodak Image Station 440CF og Kodak 1D v.3.6.5 programvare (Eastman Kodak, Rochester, New York). For å normalisere VCP eller HSPA4 protein nivåer mellom immunoblotter, inneholdt hver gel to eller tre vanlige serumprøver som referanser. Referanseverdien for VCP ble satt som gjennomsnittet av friske kontroll bandet intensiteter i immunoblot analyser + 2SD.
Statistiske analyser
En vei ANOVA med Dunnett post-test ble brukt for å sammenligne VCP nivåer hos friske kvinner og kreftpasienter.
takk
forfatterne takker Meggie Girard, Kathleen Theroux, Jennifer Kendall-Dupont, og Manon de Ladurantaye for deres tekniske hjelp og Ontario Tumor Bank (Jeanette Joanes ) og Réseau de recherche du kreft du Fonds de la recherche en Santé du Québec for å gi sera fra kreftpasienter og friske personer.
