Abstract
Vasohibin-en (VASH1) er isolert som en endogen angiogenese hemmer produsert av blodåreendotelets. Vi har tidligere rapportert at tumorvekst og tumor angiogenese ble utvidet i
VASH1 (- /-)
mus. Her undersøkte vi om VASH1 spiller noen rolle i kreft metastasering. Når Lewis lungekarsinom (LLC) celler ble inokulert i fotputen til å observere spontan metastasering, en betydelig økning i lungemetastaser sammen med inguinal lymfeknutemetastase var tydelig i
VASH1 (- /-)
mus. Histologiske analyser viste at fartøy av fotbladet svulst i
VASH1 (- /-)
mus var mer umoden, har færre vegg celler. Imidlertid, når LLC celler ble injisert i en halevene, graden av lungemetastaser var uendret mellom villtype mus og
VASH1 (- /-)
mus. Når VASH1 i endotelceller i kultur ble slått ned ved siRNA, vi har observert en nedgang i innholdet av ZO-1, en komponent av tett veikryss, som minsker resulterte i øket transmigrasjon av kreftceller på tvers av endotel-celle monolag. Disse resultatene indikerer at endogent VASH1 strammer endothelial barriere og gjør kreft fartøy resistente mot kreft metastase
Citation. Ito S, Miyashita H, Suzuki Y, Kobayashi M, Satomi S, Sato Y (2013) Forbedret Cancer Metastase i Mus mangelfull i
Vasohibin-en
Gene. PLoS ONE 8 (9): e73931. doi: 10,1371 /journal.pone.0073931
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 23 juli 2013; Publisert: 16.09.2013
Copyright: © 2013 Ito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd nummer 22112006 fra program Grants-i-Aid for Scientific Research på innovative områder «Integrative kreftforskning mikromiljøet Network»; av tilskuddet nummer 22300323 fra program Grants-i-Aid for Scientific Research (B) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan; og av en Helse- og Ap Sciences forskningsstipend (Third Term omfattende kontroll Research for kreft) fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er den ledende dødsårsaken i verden, og de fleste av kreftpasienter dør på grunn av metastaser. Prosessen med kreft metastase består av sekvensielle trinn, som inkluderer lokal invasjon av kreftceller i primær lesjon, intravasation, reiser kreftcelleaggregater i hele den systemiske sirkulasjonen, arrestere kreftcelleaggregater i det fjerne vaskulære senger, bloduttredelse, og gjenvekst av kreftceller i lesjonen metastatisk [1], [2].
tumor vaskulaturen, en gateway av kreftceller for intravasation, er dannet ved den prosess som er kjent som angiogenese, en av de viktigste kjennetegnene til kreft [3- ]. Denne prosessen angiogenese inkluderer følgende sekvensielle trinn: avløsning av omliggende vegg celler fra eksisterende fartøy for initiering av angiogenese, ekstracellulære matrise nedbrytning av endotelceller proteaser, migrasjon av endotelceller (ECS) på spissen, spredning av egenkapitalbevis på stilken , tube dannelse av egenkapitalbevis, og omfordeling og tett sammenslutning av vegg celler til egenkapitalbevis for vaskulær modning og stabilisering [4]. Men i motsetning til normale blodårer, blir tumorblodkarene utvidet, kroket, og utett på grunn av mangel av vaskulær stabilisering, og denne unormale arkitekturen av tumorkarene kan være ansvarlig for den intravasation av kreftceller [5].
Angiogenese er strengt regulert av en balanse mellom lokale endogene stimulatorer og inhibitorer av denne fremgangsmåte [6]. En rekke av angiogenese-inhibitorer er blitt identifisert i pattedyrkroppen. Blant dem, vasohibin-en (VASH1) er en endogen angiogenese hemmer produsert av blodåreendotelets ha bredspektret anti-angiogene aktiviteter [7], [8]. Vi opprinnelig isolert VASH1 som en vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) -inducible gen i ECS [7]. Men vår påfølgende analyse viste at VASH1 fortrinnsvis uttrykt i egenkapitalbevis av nydannede blodkar bak spirende foran der angiogenese opphører [9]. Faktisk
VASH1 KO
mus inneholder mange umodne fartøy i området hvor angiogenese skal avsluttes bak spirende foran. I tillegg til sin anti-angiogen aktivitet, vår siste analyse videre demonstrert at VASH1 øker stresstoleranse for ECS og stabiliserer blodårer [10].
Histologiske analyser har vist at ekspresjon av VASH1 er tydelig i løpet av ECS angiogenese under begge fysiologiske og patologiske tilstander inkludert kreft [7], [11] – [21]. Således kan ekspresjon av VASH1 være en biomarkør av angiogenese. Alternativt kan, med hensyn til sin funksjon, vi viste at økt tumorvekst og tumor angiogenese var tydelig når Lewis lungekarsinom (LCC) celler ble inokulert i
VASH1 (- /-)
mus [12]. Faktisk, redusert ekspresjon av VASH1 korrelert med dårlig prognose av visse humane cancere [21], [22]. Disse observasjoner tyder på at endogen VASH1 regulerer forløpet av tumor angiogenese og tumorprogresjon. Her, utvidet vi vår analyse til rollen VASH1 i kreft metastasering. Våre resultater tyder på at VASH1 er ansvarlig for hemming av kreft metastasering.
Materialer og metoder
Cells
Lewis lungekarsinom (LLC) celler ble hentet fra Celle Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, aldring og kreft, Tohoku University, og dyrket i RPMI1640 medium supplert med 10% FCS. Menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVECs) ble hentet fra Sanko Junyaku Industries (Tokyo, Japan) og dyrket i type-1 kollagen-belagt retter (Iwaki, Chiba, Japan) inneholder EBM-2 medium med veksttilskudd, SingleQuots, og 2% FCS (Lonza, Basel, Sveits). LNM35 celler ble beskrevet tidligere [8]
Material
Følgende materialer ble brukt. Anti-mus CD31 rotte antistoff (Fitzgerald Industries International, Concord, MA); anti-αSMA antistoff (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); anti-LYVE-1 antistoff (acris, San Diego, CA); anti-human ZO-1 monoklonalt antistoff (Transduction Laboratories BD); anti-human ZO-1 polyklonalt antistoff (Zymed Laboratories, Syd San Francisco, CA); anti-VE-cadherin antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); Alexa fluor 488-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (Molecular Probes, Eugene, OR); Alexa Fluor 488-konjugert anti-rotte IgG antistoff (molekylære prober); Alexa Fluor 568-konjugert anti-geit IgG antistoff (molekylære prober); Alexa fluor 555-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (Molecular Probes); anti-β-aktin-antistoff (Sigma-Aldrich); HRP-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (Sigma-Aldrich); HRP-konjugert anti-geite-IgG-antistoff (Sigma-Aldrich); HRP-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (Sigma-Aldrich); Calcein-AM (Sigma-Aldrich); FITC-konjugert dekstran (70 kDa, Sigma-Aldrich); 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI; Molecular Probes). Anti-human VASH1 mAb (4E12) ble beskrevet tidligere [7]
Mus modeller av metastaser
VASH1. (- /-)
Mus av C57BL6J bakgrunn ble beskrevet tidligere [9], [12]. Villtype (WT) C57BL6J mus (8-12 uker, hann) ble oppnådd fra Charles-River Japan (Yokohama, Japan). Alle dyreforsøk ble gjennomført med godkjenning av Tohoku universitet Animal Care komiteen.
For den spontane metastase modell, 5 × 10
5 LLC celler ble inokulert subkutant i høyre bakben footpad av mus. Seksten til atten dager etter inokulering, ble tumorbærende ben resekterte henhold dyp bedøvelse sammen med popliteal lymfeknuter. Åtte dager etter reseksjon ble musene avlivet; og lungene ble høstet, veid, og deretter fast med Tellyesniczky løsning. Metastatiske knuter på lungeoverflaten ble telt under observasjon med en dissekere mikroskop.
For den eksperimentelle metastase modell, 5 × 10
5 LLC celler ble injisert i en halevene. Seksten dager etter injeksjonen ble musene avlivet; og lungene ble deretter høstet og festes med Tellyesniczky løsning for analyse av lungemetastaser.
Immunofluorescensanalyse av tumorvev
tumorvev ble forankret i optimal skjæring temperatur (OCT) forbindelse (Sakura Finetech, Tokyo, Japan) for å lage frosne vevsprøver, og i snitt på 6 um. Snittene ble fiksert med metanol i 20 minutter ved -20 ° C, blokkert i 1 time ved romtemperatur med PBS inneholdende 1% BSA og 0,1% Tween-20, og farget med primære antistoffer (anti-CD31 Ab, 1:400 fortynning , anti-LYVE-1 Ab, 1:200 fortynning, anti-αSMA Ab, 1:200 fortynning) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av Alexa 488 eller Alexa 555-konjugerte sekundære antistoffer (1:400 fortynning) og DAPI for 1 time ved romtemperatur. Seksjonene ble dekket med fluorescerende montering medium (DAKO, Tokyo, Japan), og bildene ble kjøpt med et fluorescerende mikroskop (BZ-9000, Keyence) og analysert med en BZ-II programvare (Keyence, Osaka, Japan).
Isolering av egenkapitalbevis fra Lunger og LLC svulster
egenkapitalbevis ble isolert fra vevet ved bruk av magnetisk Cell Sorting System (MACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Lung av WT mus og tumorvev av WT og
VASH1 (- /-)
mus ble hakket og fordøyd med kollagenase II (Worthington, Freehold, NJ). For lunge vev, ble blodceller fjernet av PBS fusjon før fjerning. For tumorvev, ble et enkelt trinn sukrose-gradient-sentrifugering med Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich) gjort etter fordøyelse for å fjerne blodceller. Cellesuspensjonene ble filtrert med 40 mikrometer celle sil (BD). De fordøyd vev ble behandlet med ACK Lysing buffer (GIBCO), og CD31 positive egenkapitalbevis ble isolert ved MACS med CD31-antistoff (Fitzgerald Industries International, Concord, MA).
Real-time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra de isolerte endotelceller ved RNeasy (Qiagen), og revers transkripsjon ble utført. Real-time PCR-analyse ble gjort ved hjelp CFX96 (BIO-RAD) og SYBR premix Ex Taq (Takara BIO, Otsu, Japan). De sense- og antisense primer-par var: mus VASH1, 5′-TCAGCACAGAGAGATGAGGA-3 «og 5′-TACTGCAGCTCCCTGATGTA-3′; mus CD31, 5»-TTCAGCGAGATCCTGAGGGTC-3 «og 5′-CGCTTGGGTGTCATTCACGAC-3», henholdsvis.
genet Slå av Stealth siRNA
HUVECs ble transfektert med syntetiske sirnas i Lipofectamine RNAi max reagent ( Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Ved 12 timer etter transfeksjon, ble cellekulturmediet erstattet med vekstmedium, og cellene ble inkubert i ytterligere 12 timer. Deretter ble cellene anvendt for morfologisk analyse eller høstet for eksperimenter. Spesifikk genet Slå ble bekreftet ved Western blot analyse. Nukleotidsekvensene stealth sirnas for mennesker VASH1 og dens kontroll var 5′-CAA GGA CCG GAA GAA GGA Ugu UUC U-3 «og 5» CAA CCA AGG AGA GGA GUA UUG HiG U-3 «, henholdsvis.
for rednings forsøket ble HUVECs transfektert med sirnas for 3 «un-translatert region (UTR) av human VASH1 og ekspresjonsvektoren for menneskelig VASH1 cDNA som mangler 3» UTR. Ved 48 timer etter transfeksjon ble cellene ekstrahert for Western blotting. Nukleotidsekvensene snike sirnas for 3 «UTR av human VASH1 og dens kontroll var 5′-ATA AGA TGC ACC CAA CTC CCA GAG A-3′ og 5»-ATA GAA AGG TAC CCA CCA CTC CAG A-3 «, respektivt .
Western blot analyse
Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [7]. Kort sagt ble HUVECs behandlet med siRNA lysert med RIPA-buffer (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan); og lysatene ble deretter separert ved SDS-PAGE på en 7,5% separerende gel, og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert i 1 time ved romtemperatur med PBS inneholdende 1% skummet melk og 0,1% Tween-20, og deretter inkubert tor 1 time ved romtemperatur med primære antistoffer (anti-ZO-1 Ab, 1:200 fortynning, anti ve-cadherin Ab, 1:200 fortynning, anti-β-aktin Ab, 1:10000 fortynning, anti-human VASH1 antistoff (4E12), 1:500 fortynning). Deretter ble membranene inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur, hvoretter Blottene ble detektert med Immobilon-reagens (Millipore, Concord, MA). Bilder ble oppnådd ved å bruke en LAS-4000 lysende bilde analysator (Fuji Film, Tokyo, Japan).
Immunofluorescensanalyse av HUVECs
Etter siRNA behandling, HUVECs ble sådd ut på Type-1 kollagen-belagt dekkglass og inkubert i 48 timer. Deretter ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, permeabilisert med 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i 15 minutter, og blokkert i en time ved romtemperatur med PBS inneholdende 1% BSA og 0,1% Tween- 20 (Sigma-Aldrich). De var ved inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (anti-ZO-1 Ab, 1:200 fortynning, anti-VE cadherin-Ab, 1:200 fortynning). Etter 2 vaskinger med PBS, ble cellene inkubert i 1 time ved romtemperatur med Alexa 488 eller 568-konjugerte sekundære antistoffer (1:400 fortynning). De dekkglass ble til slutt dekket med fluoriserende monteringsmedium, og bildene ble anskaffet ved hjelp av en fluorescens mikroskop (DMI6000B, Leica).
permeabilitet av endotel med ett lag
siRNA-behandlede HUVECs (1 × 10
5 celler) ble sådd ut på bunnen av det øvre kammer av type-1 kollagenbelagt Transwell gjennomtrengelige støtter (0,4-um porer, 24 brønner, Corning) for å fremstille HUVEC-monolag. Etter inkubering i 24 timer ble FITC-dekstran (70 kDa, 1 mg /ml i 100 pl EBM-2-medium) ble tilsatt til det øvre kammer; og FITC-dekstran som hadde passert gjennom monolaget inn i det nedre kammeret ble kvantifisert ved fluorometri (absorpsjon /emisjon på 485/538 nm).
Transendothelial Migrasjon av kreftceller
siRNA-behandlede HUVECs (5 x 10
4-celler) ble sådd ut på bunnen av det øvre kammer av type 1 kollagen-belagte Transwell gjennomtrengelige støtter (8-um porer, 24 brønner, Corning) og inkubert i 24 timer for å fremstille monolag av HUVECs. Deretter ble LNM35 humane lungekreftceller farget med calcein tilsatt til de øvre kamre (1 x 10
4 celler /100 ul av EBM-2 medium, 0% FCS), med det nedre kammer inneholdende 600 ul av RPMI 1640 medium med 10% FCS. Seks timer senere ble antall celler som hadde transmigrated til den nedre side av membranene tellet under observasjon med et fluorescens mikroskop.
Statistical Analysis
Den statistiske signifikans av forskjellene mellom grupper ble evaluert ved bruk av uparet ANOVA, og
P
verdiene ble beregnet ved å utføre det uparede Student
t
test.
Resultater
Økning i Spontan Metastase i
VASH1 (- /-)
Mus
for å vurdere mulige rolle VASH1 i kreft metastase, vaksinert vi LLC celler subkutant i høyre bakben footpad av WT og
VASH1 (- /-)
mus. Seksten til atten dager etter vaksinasjonen, ble tumorbærende ben resected; og størrelsen og vekten av tumorene ble bestemt. Svulster i
VASH1 (- /-)
mus vokste seg større (Fig 1A og B).. Svulster i
VASH1 (- /-)
mus viste en økt vaskulær område (Fig 1 C og D).. Vi isolert normal egenkapitalbevis fra WT mus eller tumorassosiert egenkapitalbevis fra WT og
VASH1 (- /-)
mus, og sammenlignet uttrykk for VASH1. Ekspresjonen av VASH1 i ECS av tumorkarene var signifikant høyere enn i de normale hvilende fartøy i WT mus, mens ekspresjonen av VASH1 var fraværende i
VASH1 (- /-)
mus (figur 2).
LLC celler ble inokulert i høyre bakben footpad av WT og
VASH1 (- /-)
mus. A: Brutto utseende på dag 16 til 18 etter vaksinasjonen. B: Vekt av tumor-bærende ben. * P 0,05. C: Tumor snitt ble immunfarget med CD31, og det vaskulære området ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Midler og SDS vises (N = 7). * P 0,05. D: Tumor seksjoner ble immunostained med CD31, og vaskulær antall ble bestemt som beskrevet i materialer og metoder. Midler og SDS er gitt (N = 7). NS. Uvesentlig
A: Uttrykket av CD31 uttrykk i magnetisk sortert celler fra normale lunger eller tumorvev og strømme gjennom fraksjonen ble analysert ved RT-PCR. B: Ekspresjon av mus VASH1 i lungene fra
VASH1 (- /-)
mus, og i normale lunger og tumorvev fra WT mus ble bestemt ved RT-PCR. C: Ekspresjon av mus VASH1 ekspresjon i normale lunger og tumorvev fra WT mus ble kvantifisert ved sanntids RT-PCR og sammenlignet (N = 3). ** P. 0,01
Åtte dager etter reseksjon av tumorbærende ben, ofret vi musene og bestemmes omfanget av lungemetastaser. Brutto utseende og deler av lungene viste en signifikant økning i antall metastatiske svulster i
VASH1 (- /-)
mus (fig 3A og b.). Denne økningen i metastaser i
VASH1 (- /-)
mus ble ytterligere kvantifisert ved veiing lungene og telle antall metastatiske knuter i dem
Åtte (Fig 3C og D.). dager etter ben reseksjon ble musene avlivet og lungemetastase ble evaluert. A: Brutto utseende. B: Hematoxylin og eosin (H 0,05. D: Antall metastatiske noduler i lungene av WT og
VASH1 (- /-)
mus er gitt (n = 7). ** P 0,01
Den økte størrelsen på primærtumor kan være en årsak til utvidet metastaser i
VASH1 (- /-)
mus (fig 1B.).. Men vekten av tumor-bærende ben var mindre enn 2 ganger (figur 1B.), Mens antallet av metastatisk nodul var mer enn tre ganger i
VASH1 (- /-)
mus (Fig. 3D) . Dette proporsjonal økning av lungemetastatiske knuter kan indikere akselerasjon av metastatiske prosesser seg i
VASH1 (- /-)
mus. Faktisk fikk vi bekreftet den betydelige økningen av lungemetastatiske knuter i
VASH1 (- /-).
Mus med den samme vekten av tumorbærende bein (figur S1)
Vi neste søkt en annen mus modell av metastase ved å injisere LLC celler direkte via en halevene. Denne manøveren, såkalt eksperimentell metastase modell, hoppet den første intravasation trinn. Hva vi har observert, var at graden av lungemetastaser var uforandret mellom WT og
VASH1 (- /-).
Mus i denne modellen (Fig. 4A, B, C og D)
Åtte dager etter injeksjonen av LLC-celler via en halevene ble musene avlivet; og lungemetastase ble deretter evaluert. A: Brutto utseende. B: H E farging. Pilspisser viser metastase. Bar = 1 mm. C: Vekt av lungene fra WT og
VASH1 (- /-)
mus er gitt (N = 8). NS: ikke signifikant. D: Antall metastatiske knuter i lungene fra WT og
VASH1 (- /-)
mus er vist (N = 8). . NS: ikke signifikant
Sammen er disse resultatene tyder på at kreft metastase ble økt
VASH1 (- /-)
mus, og intravasation av kreftceller i primær lesjon kan være ansvarlig for denne økningen i metastase
økning i lymfeknutemetastase i
VASH1. (- /-)
Mus
Vi har også undersøkt omfanget av lymphangiogenesis i fotbladet svulster ( fig. 5A), og observerte den betydelige økningen i antall og område av lymfekar i
VASH1 (- /-)
mus (figur 5B og C).. Vi evaluerte deretter den regionale inguinal LN metastase 8 dager etter reseksjon av de tumorbærende ben, og fant at LN metastase ble forsterket i
VASH1 (- /-).
Mus (Fig. 5 D og E)
A: Tumor lymfekar ble farget med LYVE-1. Bar = 100 mikrometer. B: Lymfatisk fartøy nummer per felt i svulsten er vist (N = 4). ** P 0,01. C: lymfekar området i svulsten er vist (N = 4). * P 0,05. D: Den høyre side lyske LNS ble gjenvunnet og fotografert. Bar = 10 mm. E: Vekt av inguinal LNS vises (N = 5). ** P. 0,01
Umodne Tumor Fartøy i
VASH1 (- /-)
Mus
Normale blodårer er moden omgitt av vegg celler, men tumor blodkar er generelt umoden, å være mangelfull i mur celle dekning. Her undersøkte vi den cellulære sammensetningen av tumor fartøyene ved farging dem med antistoff mot CD31, en markør for egenkapitalbevis, og antistoff mot αSMA, en markør for vegg celler. Som forventet, ble mange av tumorkarene ikke er dekket av vegg celler i WT-mus (figur 6A;. Øvre paneler). Men omfanget av dekningen av vegg cellene var betydelig mindre i tumorkarene i
VASH1 (- /-)
mus (fig 6A, lavere paneler og B).
A:. Tumor seksjoner fra bena på WT og
VASH1 (- /-)
mus ble immunostained for CD31 og αSMA. Bar = 100 mikrometer. B: Forholdet mellom αSMA-positive fartøy til total fartøy vises (N = 7). * P. 0,05
Denne observasjonen samsvarer svært godt til vår forrige [12], og denne forskjellen i mur Mobildekning kan være en årsak til økningen i kreftcelle intravasation i disse
VASH1 (- /-)
mus. Likevel, siden kreft fartøy i WT mus var betydelig umodne, kan det være en ekstra grunn for den forbedrede metastaser i
VASH1 (- /-).
Mus
Mangel Dannelse av tett veikryss i endotel monolag Mangler VASH1
Vi har derfor undersøkt om det var noen endringer i egenskap av egenkapitalbevis seg selv når de manglet VASH1 uttrykk. Vi banket ned ekspresjonen av VASH1 i HUVECs ved bruk av siRNA, og deretter undersøkt permeabiliteten på tvers av endotel-monolag. Det var en signifikant økning i permeabiliteten på tvers av monolag av HUVECs mangelfull i VASH1 (Fig. 7A). Vi videre undersøkt trans av kreftceller over endothelial monolaget. Det var en signifikant økning i trans av kreftceller på tvers av monolag av VASH1-manglende HUVECs (figur 7B).
A:. Mengden av FITC-dekstran som passerte gjennom monolag av HUVECs ble behandlet med kontroll eller siRNA VASH1 siRNA ble sammenlignet (N = 3). ** P 0,01. B: Antallet kreftceller som transmigrated gjennom monolag av HUVECs behandlet med kontroll siRNA eller VASH1 siRNA ble sammenlignet. (N = 3). * P. 0,05
En faktor som bestemmer permeabilitet og sjelevandring av kreftceller over endothelial monolaget ville være dannelsen av celle-celle veikryss. Derfor undersøkte vi komponentene i celle-celle veikryss ved farging med antistoff mot ZO-1 som en markør for tett veikryss og antistoff mot VE-cadherin som en markør for etterlevelse veikryss. Det var en reduksjon i ZO-1, men ikke VE-cadherin, positiv farging i monolag av HUVECs mangelfull i VASH1 (Fig. 8A). Denne endringen i ZO-1-innholdet ble ytterligere bekreftet ved Western-blotting (fig. 8B). Vi har videre brukt sirnas for 3 «UTR av human VASH1 og ekspresjonsvektoren for menneskelig VASH1 cDNA som mangler 3» UTR for rednings eksperimentet. Følgelig bør siRNA knockdown endogen VASH1 uttrykk, men vil ikke påvirke ekspresjon av eksogene VASH1 av ekspresjonsvektoren. Som vist på fig. 8C, er slått ned av VASH1 ved denne siRNA også redusert ekspresjon av ZO-1, og det ko-transfeksjon av VASH1 cDNA som mangler 3 «UTR gjengitte uttrykk for VASH1 og hindret redusert av ZO-1-ekspresjon.
sytti-to timer etter siRNA behandling, farging for ZO-1 og VE-cadherin, komponenter av tett veikryss og etterlevelse veikryss, henholdsvis i HUVECs behandlet med kontroll siRNA eller VASH1 siRNA ble utført. Bar = 50 mikrometer. B: Proteininnhold av ZO-1, VE-cadherin, VASH1, og β-aktin i HUVECs ble behandlet med kontroll siRNA eller VASH1 siRNA ble analysert ved Western blotting. C: HUVECs ble transfektert med VASH1 ekspresjonsvektoren, og stealth siRNA. Cellene ble hentet 48 timer senere, og Western blot analyse ble utført.
Diskusjoner
Her er vi undersøkt hvilken rolle endogent VASH1 i kreft metastaser i forhold til samspillet mellom kreftceller og blodkar. Vi anvendte 2 musemodeller for kreft metastasering, som evaluert hele av metastatiske prosesser som spontan metastasemodellen og den andre, prosessen med ekstravasasjon og påfølgende hendelser som haleveneinjeksjon modell. Våre nåværende analyser viste den forbedrede metastase i
VASH1 (- /-)
mus i den spontane metastase modell, men ikke i haleveneinjeksjon modell. I den spontane metastase modell, kreftceller transmigrere gjennom uorganisert nydannede kreft fartøy. Imidlertid, når kreftceller ble injisert intravenøst i forsøksmetastase modell, fremgangs intravasation ble hoppet over. Dette kan være en grunn til at vi ikke kunne finne noen forskjell i den eksperimentelle metastase modell. Vi spekulert i at endogen VASH1 deltok i forsvaret mot kreft celle intravasation i primær lesjon. Vi foreslår også at tettheten av endothelial barriere er mer viktig for kreftceller til å forlate fra hovednettstedet
Vi observerte økningen av svulsten lymphangiogenesis og regional LN metastase i
VASH1. (- /-)
mus. Vi har tidligere vist at eksogene VASH1 hemmet svulst lymphangiogenesis og LN metastase [8]. Viktigere, vår nåværende resultatene ytterligere utforsket som endogen VASH1 besitter hemmende effekt på tumor angiogenese og LN metastasering. Som VASH1 fortrinnsvis fremstilt ved vaskulær ECS [12], denne inhiberende effekt av VASH1 på lymphangiogenesis hovedsakelig medieres via en parakrin måte.
Perifere lymfekar normalt mangler veggceller. Således kan økning av lymfekar direkte bidra til intravasation av kreftceller til lymfekar og LN metastasering. Imidlertid blodkar er strukturelt forskjellige. Vi undersøkte derfor den cellulære sammensetningen av tumorblodårer, og bekreftet vår tidligere observasjon at tumor blodkar i
VASH1 (- /-)
mus er mer umoden, har færre freske celler [12]. Det er tidligere dokumentert at mangelfull dekning av tumorblodårer ved freske celler er ledsaget av en økt forekomst av metastasering av menneskelige tykktarmskreft celler [23]. Betydningen av veggcelledekning for beskyttelse av tumorblodkarene fra kreftcelle intravasation ble ytterligere bekreftet ved en serie eksperimenter med flere dyremodeller [24] – [27]. Derfor vurderte vi at umoden tumor blodkar i
VASH1 (- /-)
mus kan være en årsak til styrking av kreft metastasering. Så langt vi kunne ikke påvise eventuelle effekter av VASH1 på freske celler [7]. Dermed mekanismene som styrer VASH1-mediert vedlikehold av blodkar modenhet fortsatt ikke klarlagt.
Som VASH1 er syntetisert av og påvirker egenkapitalbevis ved å opptre som en autokrin faktor [7], [10], VASH1 kan modifisere eiendommen av egenkapitalbevis seg foruten samspill med freske celler. Faktisk, knockdown av VASH1 forbedret permeabilitet og sjelevandring av kreftceller over homotypisk endothelial monolaget. Disse resultatene forfremmet oss å undersøke homotypisk celle-celle adhesjon i slimhinnen endotelet. Vi har faktisk funnet at knockdown av VASH1 i ECS resulterte i en redusert innhold av ZO-1, en komponent av tett veikryss, men hadde ingen virkning på VE-cadherin, en komponent av adherens veikryss. Videre kan eksogent tilført VASH1 gjenopprette nedgang på ZO-1 indusert av VASH1 siRNA.
Den stramme junction er den mest aktuell struktur som styrer permeabilitet av epitel og endotel lag. Tett veikryss i det endoteliale lag fungere som en barriere gjennom hvilken væske, molekyler og celler kan ikke passere [28], [29]. Således bør tett knutepunkt være en barriere som kreftceller må overvinne for deres intravasation. Faktisk er redusert tight junction i tumor fartøy sammen med oppkjøpet av metastatisk fenotype i melanom [30], og en dårlig prognose i leverkreft [31]. Derfor anser vi at redusert «tetthet» av tett veikryss kan være en annen årsak til styrking av kreft metastasering. Mekanismen hvordan VASH1 regulerer endothelial tight junction dannelse er ikke avklart.
I sammendraget, konkluderte vi endogen VASH1 å være nødvendig for motstanden endotelet mot intravasation av kreftceller som trengs for metastasering. VASH1 kan fungere for å sikre tett binding mellom endotelceller og foreningen av endotelet med freske celler for vaskulær modning, og disse fenotyper likne de av «falanks endotelceller» [32], [33]. Selv om de nøyaktige mekanismene som VASH1 arbeider gjenstår å bli belyst, kan disse funksjonene VASH1 brukes til hemming av kreft metastasering.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Sixteen til atten dager etter inokulering av kreftceller, ble tumorbærende ben resected
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073931.s001 plakater (DOCX)
Takk
Vi takker Ms. Yuriko Fujinoya for henne utmerket teknisk assistanse.
