Abstract
Bakgrunn
Tumor-avledet løselige faktorer, inkludert løselige HLA-molekyler, kan bidra til kreft immun flukt og derfor innvirkning på klinisk løpet av ondartede sykdommer. Vi har tidligere rapportert at melanomceller produserer,
in vitro
, løselige former av den ikke-klassisk MHC klasse I-molekylet HLA-E (sHLA-E). For å undersøke sHLA-E produksjon av ulike svulster og å ta sin potensielle verdi som et tumorassosiert markør, har vi utviklet en spesifikk ELISA for kvantifisering av sHLA-E i biologiske væsker.
Metodikk /hovedfunnene
Vi utviklet en sHLA-E spesifikke og sensitive ELISA, og vi viste at serum sHLA-E nivåer ble signifikant forhøyet (P 0,01) i melanom pasienter (n = 127), sammenlignet med friske donorer (n = 94 ). sHLA-E ble også påvist i kultursupernatantene av et bredt spekter av tumorcellelinjer (n = 98), inkludert melanom, nyre, colorektal og brystkreft. Cytokiner regulering av sHLA-E produksjon av tumorceller ble også gjennomført. IFN-γ, IFN-α og TNF-α ble funnet å oppregulere sHLA-E produksjon av tumorceller.
Konklusjoner /Betydningen
I lys av det brede tumorvev frigjøring av HLA-E og dens oppregulering av inflammatoriske cytokiner, sHLA-E bør studeres for sitt engasjement i immunresponser mot svulster. Interessant, våre resultater vist en positiv sammenheng mellom tilstedeværelsen av serum sHLA-E og melanom. Derfor fastsettelse av sHLA-E nivåer, ved hjelp av ELISA tilnærming, kan bli etterforsket som en klinisk markør hos kreftpasienter
Citation. Allard M, Oger R, Vignard V, Percier JM, Fregni G, Périer A , et al. (2011) Serum Løselig HLA-E i melanom: en ny potensiell immunrelaterte Marker i Cancer. PLoS ONE seks (6): e21118. doi: 10,1371 /journal.pone.0021118
Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg
mottatt: Mai 10, 2011; Godkjent: 19 mai 2011; Publisert: 21 juni 2011
Copyright: © 2011 Allard et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd tildelt av «Ligue Nationale contre le Cancer» (labellisation 2007). Den Funder har ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bevis akkumulert demonstrere evnen av immunsystemet for å identifisere og ødelegge maligne celler, for å forhindre tumorutvikling. Denne prosessen kalles kreft immunosurveillance, er basert på den kombinerte virkning av effektorer av medfødte (NK, NKT-celler, γδ T-celler og dendrittiske celler) og adaptiv (antigen-spesifikke T- og B-celler) immunitet for å avføle og utrydde begynnende-transform celler. Imidlertid, til tross for eksistensen av veldefinerte immunogene tumorantigener, og selv i nærvær av tumor-antigen-spesifikke cytotoksiske T-celler i immunsystemet synes ikke å være fullt effektive i å utrydde tumorer [1].
Flere mekanismer er involvert i tumorimmun flukt, inkludert strukturelle og funksjonelle endringer av human leukocytt antigener (HLA), som representerer hyppige arrangementer i kreft. Dette omfatter klassiske HLA-klasse I-antigen (HLA-A, -B, -C) tap eller nedregulering og avvikende ekspresjon av ikke-klassiske HLA klasse I-antigener (HLA-E, -G), som gir mekanismer som fører til en reduksjon i gjenkjennelse og ødeleggelse av tumorceller ved å immun cytotoksiske effektorer (hovedsakelig CTL-og NK-celler) [2]. Interessen for ikke-klassiske HLA-molekyler har blitt stimulert av den demonstrasjon at de kan bidra til NK og T-celle-tumorcelle flukt gjennom deres interaksjon med NK-inhibitoriske reseptorer [3] – [6]. Videre er produksjon av ikke-løselige cellebundet HLA (sHLA) molekyler er også blitt beskrevet, og kan representere en alternativ strategi for kreftimmun flukt [7], [8]. Til støtte for denne hypotesen, har sHLA molekyler vist seg å indusere
in vitro
hemming og /eller apoptose av CTL og NK [9], [10]. Videre har økt serumnivå av klassisk og ikke-klassiske sHLA blitt beskrevet i flere ondartede sykdommer, og deres prognostisk betydning er foreslått av statistisk signifikant sammenheng med høy stadium sykdom eller med bestemte kliniske forløpet i forskjellige maligniteter [11].
Vi har tidligere observert, i samarbeid med patologer, en hyppig uttrykk for HLA-E av melanomer og tykktarmskreft [12]. Studier fra vår gruppe og andre understøttet et immunsuppressivt potensialet i dette uttrykket, gjennom inngrep av CD94 /NKG2A hemmende NKR på cytotoksiske celler (NK og CD8 TIL) av tumorcellemembran HLA-E [13] – [16]. Vi har også rapportert at melanom cellelinjer kan produsere løselige former av HLA-E (sHLA-E)
in vitro
, etter protease avhengig utstøtingen av overflatemolekyler, og at denne produksjonen var økt med IFN-γ [12] .
Formålet med dette prosjektet var å utvikle en ELISA-analyse for påvisning og kvantifisering av sHLA-E i biologiske væsker, å validere sin spesifisitet, og hvis tilstrekkelig, for å ta den kliniske betydningen av sHLA- E-nivåer i blodet av melanom pasienter.
Resultater
Utvikling av en HLA-E spesifikke ELISA
for å oppdage og kvantifisere sHLA-E i biologiske prøver, utvikler vi en sandwich-ELISA bruker noncompeting solid fangst og biotinylated deteksjon anti-HLA-E monoklonale antistoffer MEM-E /08 og MEM-E /07 henholdsvis. Først et konsentrasjonsområde av et renset rekombinant oppløselig HLA-E (rsHLA-E) ble testet. A som er vist på figur 1A, ble rsHLA-E detekteres ved en minimumskonsentrasjon på 5 pg /ml. Gitt den rapporterte kryssreaktivitet av både anti-HLA-E Abs med fire HLA klasse Ia allele former: HLA-A23, -B7, -B8 og -B27, vi sjekket deres oppdagelse ved hjelp av våre designet ELISA-analysen. Blant rekombinant oppløselig HLA-A23, -B7, -B8 og -B27 samt rsHLA-A2 anvendt som negativ kontroll ble bare et svakt signal som oppnås med rsHLA-B7 ved den maksimale dose 20 ng /ml (Fig. 1B).
A /Påvisning av sHLA-E ved hjelp av serielle fortynninger av rekombinant HLA-E monomer. Det grå området viser omfanget av målbare sHLA-E nivåer. B /Bestemmelse av HLA-E bindende spesifisitet. Serielle fortynninger av HLA-A2, -A23, -B7, -B8 og -B27 rekombinante løselige monomerer er testet i sammenligning med rekombinant HLA-E monomer.
Disse resultatene førte til den konklusjon at sandwich-ELISA som er beskrevet her er meget spesifikk og følsom for HLA-E og kan brukes som en screeningsmetode for påvisning av sHLA-E i biologiske prøver.
Økt oppløselig HLA-E i sera fra melanom pasienter
skjermet sera fra 94 friske donorer og 127 melanompasienter uten pågående terapi for tilstedeværelse av sHLA-E (tabell 1). Vi oppdaget sHLA-E i serumprøver fra både friske og pasient givere i en fortynning avhengig måte (fig. 2A) som demonstrerer at denne ELISA kan brukes til å kvantifisere sHLA-E i seraprøver. Tatt i betraktning den mulige forekomsten av alder og kjønn, var ingen signifikante forskjeller i sHLA-E nivåer observert (data ikke vist). De individuelle verdier av serum sHLA-E er presentert på en prikk-plott ved hjelp av en log skala (Fig. 2B) og midler, er median og områder som er angitt på Tabell 2.
A /Illustrasjons påvisning av sHLA-E ved å bruke serielle fortynninger av to serumprøver ved hjelp av ELISA. B /Distribusjon av løselige HLA-E konsentrasjoner i serum hos friske kontroller og melanom pasienter. P-verdien indikerer forskjellen mellom de to gruppene. C /Prosenter av positive sHLA-E sera (sHLA-E≥5 pg /ml) hos friske donorer og melanom pasienter. D /Distribusjon av løselige HLA-E konsentrasjoner i serum av melanom pasienter med hensyn tumorstadier.
I melanom pasienter, serum nivåer av sHLA-E (median [utvalg] ) ble betydelig økt sammenlignet med friske kontroller (9 pg /ml [0-2544] vs 0 pg /ml [0-1224], henholdsvis p 0,001). For å kvantifisere hvor ofte sHLA-E-positive sera, vi tar en cut-off verdi på 5 pg /ml. Denne analysen viste at i gruppen av 94 friske blodgivere, kan sHLA-E bli detektert i 30 sera (31,9% av totalt). I motsetning til dette, i melanomapasienter, 68 av 127 sera (53,5% av total) inneholdt sHLA-E (Fig. 2C). Således prosenter av positive sera var signifikant høyere i melanoma pasienter sammenlignet med friske donorer (p 0,001). Subgruppeanalyse vurderer AJCC stadier (American Joint Committee on Cancer, https://www.cancerstaging.org/) ble deretter utført. Ingen forhold av serum sHLA-E nivåer ble funnet i forhold til tumor gradering (Fig. 2D). Imidlertid, som vist i tabell 1, sHLA-E-nivåer ble signifikant økt i stadium III melanoma pasienter sammenlignet med friske donorer (p 0,0001).
Til sammen utgjør disse resultatene validert en ELISA for bestemmelse av sHLA-E i humant serum og viste at sHLA-E er betydelig økt i sera fra melanom pasienter.
produksjon av løselig HLA-E med en mangfoldig panel av humane tumorcellelinjer
Vi analyserte fremstilling av oppløselig HLA-E ved 98 forskjellige etablerte humane tumorcellelinjer, som representerer faste tumorer som melanom (n = 30), karsinom (kreft i lungene (n = 5), colo-rektum (n = 12), nyre (n = 10 ), eggstokk (n = 3), bryst (n = 11) og prostata (3)), skjoldbruskkjertelkreft (n = 1), livmorhals kreft (n = 1), sarkomer (osteosarkomer, n = 3), gliomer (n = 2) og flytende tumorer (mesotheliomas (n = 7), myelomer (n = 7) og leukemier (n = 3)). Som vist i figur 3A og 3B (i hvitt), ble sHLA-E detektert i supernatantene av tumorcellelinjer avledet fra alle opprinnelse som ble testet, unntatt i supernatanten av eggstokk tumor, myelom, leukemi og gliom cellelinjer (fig. 3 og data ikke vist). I våre kulturbetingelser (500 000 celler, i 3 ml, i løpet av 48 timer), ble nivåene av sHLA-E naturlig produsert av tumorcellelinjer som strekker seg 5-400 pg /ml. Høyeste produksjoner ble oppdaget blant melanom, kolorektal og nyrekreftcellelinjer. Den frekvensanalyse av de tumorcellelinjer i stand til å produsere sHLA-E (ved å ta en cut-off-verdi på 5 pg /ml) viste at omtrent en tredjedel av tumorcellelinjer produsert sHLA-E (24,5%, 24 ut av 98) med høyere prosentandeler erholdt ved melanom (40%, 12 av 30) og renal cell carcinoma (40%, 4 av 10) (fig. 3C).
Analyse av oppløselige HLA-E konsentrasjoner i supernatantene til tumorcellelinjer behandlet eller ikke med IFN-γ med hensyn på tumor opprinnelse. fordeling av individuelle konsentrasjoner (A), gjennomsnittlig nivå (B) og prosentandelen av positive supernatanter (sHLA-E≥5 pg /ml) (C)
Selektiv regulering av sHLA-E produksjon av cytokiner
Vi har tidligere vist at IFN-γ økt overflaten uttrykk for HLA-E og avgivelse av løselig HLA-E av melanom celler. For å bekrefte dette resultatet og utvide panel av testede cytokiner, effekten av IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15 , IL-23, IFN-α2a, IFN-γ, TNF-α og GM-CSF på tumorcellelinjer sHLA-E-produksjon ble testet. Som ventet ble sHLA-E utgivelsen indusert eller betydelig økt i tumor cellesupernatanter etter IFN-γ-aktivering (p 0,0001). Den frekvensanalyse av de tumorcellelinjer i stand til å produsere sHLA-E etter IFN-behandling γ dobles (fra 24,5% til 49%, 48 ut av 98) (Fig. 3C). I mindre grad, til eksponering IFN-α og TNF-α betydelig økt produksjon av sHLA-E av tumorcellelinjer (p 0,001 og p 0,05 henholdsvis). Disse resultater er illustrert i figur 4A ved hjelp av to melanomcellelinjer (M88 og M102) og en colon adenocarcinoma cellelinje (HT29). Andre testede cytokiner har ingen virkning på denne produksjonen. Kinetisk analyse og dose-respons-eksperimenter ble utført med IFN-γ, IFN-α og TNF-α. Som vist i figur 4B, ble sHLA-E produksjon betydelig øket på en doseavhengig måte med den maksimale effekt observert med 10 ng /ml for de tre cytokiner. Denne produksjonen var påviselig så tidlig som 1 dag etter cytokiner behandling av kreftceller og var maksimal etter 48 timer (fig 4C.)
A /sHLA-E deteksjon i supernatantene av tre kreftcellelinjer. To melanoma celle linjer (M88 og M102) og en colocarcinoma cellelinje (HT29), behandlet eller ikke med IFN-α, IFN-γ eller TNF-α (10 ng /ml, 48 timer). Signifikante forskjeller mellom kontroll- og behandlings verdier er angitt (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). B /sHLA-E deteksjon i kultursupernatanter av M102 som ble behandlet med serielle konsentrasjoner av IFN-α, IFN-γ og TNF-α i 48 timer. C /Tid løpet av sHLA-E produksjon i kultursupernatanten M102 behandlet i opptil seks dager med 10 ng /ml IFN-γ.
Diskusjoner
Denne studien gir bevis for at serum sHLA-E er betydelig økt hos pasienter som lider av melanom i forhold til normale individer, uavhengig av alder og kjønn. Vi har gjennomført denne analysen gjennom, ved hjelp av en spesifikk og følsom ELISA som vi utviklet og validert for bestemmelse av sHLA-E-nivåer i biologiske væsker. I dette store studien inkludert 221 individer, observerte vi forhøyede konsentrasjoner av serum sHLA-E, så vel som høyere frekvens av sHLA-E positive sera hos pasienter med melanom sammenlignet med friske donorer. Vurderer svulsten gradering, mens sHLA-E nivåer så ut til å stige med avansert sykdom stadier før fase III, fant vi ikke signifikant sammenheng mellom serum sHLA-E nivåer og melanom stadium, noe som kan være forårsaket av skjev partisjonere av pasienter ved undergruppe. Imidlertid, hvis sammenlignet med friske donorer, pasienter med stadium III melanoma oppviste sterkt forhøyet sHLA-E serumnivået i form av både konsentrasjonen og hyppighet av positive sera. På den annen side, pasienter med stadium IV sykdom oppviste lavere nivåer av sHLA-E, som er i overensstemmelse med svak spontan ekspresjon av HLA-E av metastatiske tumorsnitt som vi tidligere har rapportert av immunhistokjemi [12].
Disse data understreket interesse for løselige ikke-klassiske HLA-i-molekyler i ondartede sykdommer. En annen ikke-klassisk HLA-I-molekylet, HLA-G, er blitt identifisert i forskjellige maligniteter inkludert kreft og har fått mye oppmerksomhet de siste publikasjoner. Kliniske studier har vist at sHLA-G nivåene var signifikant forhøyet i serum hos pasienter med maligne melanomer, gliomer, bryst og eggstokkreft, ikke-småcellet-lungekreft (NSCLC), kronisk lymfatisk leukemi, B-celle og T-celle non-Hodgkins lymfomer [17] – [21]. Dessuten, Zhu et al. vist at serum sHLA-G-nivåer kan være en nyttig indikator på sært kolorektal kreft fra godartede kolorektal sykdommer [22]. Endelig sHLA-G nivåer var også signifikant høyere i maligne ascites ovarier og brystcarsinomer enn i godartede kontroller [23]. Tilsvarende, forhøyede nivåer av stress-induserbar MHC klasse I kjedemessige overflate glykoproteiner, glimmer og MICB, har blitt funnet å korrelere med krefttrinn og metastaser i mange karsinomer [24] – [26]. Til sammen er disse studiene congruently viste økte mengder av ikke klassiske HLA-I-molekyler i biologiske væsker (blod og ascites) hos pasienter som lider av forskjellige kreftformer.
Gitt det faktum at vi og andre har tidligere oppdaget at sHLA-E i de supernantants av melanom og kolorektal cellelinjer ved Western blot analyse, vi undersøkt ved hjelp av vår utviklet ELISA, produksjon av sHLA-E av tumorcellelinjer avledet fra store kreft kategorier, inkludert solide tumorer som melanom, kreft i bryst, tykktarm og nyre og flytende tumorer som mesotheliomas og myelomer [12], [27]. Vi viste at sHLA-E blir spontant fremstilt ved 25% av testede cellelinjer (24 av 98), avledet fra flere typer humane tumorer, særlig fra melanom, kolorektal og nyrekreft. Så vil det være interessant å ta opp potensialet forutsigbar og prognostisk verdi av sHLA-E nivåer i blodet av pasienter som lider av disse kreftformene.
Vi har også undersøkt forholdet mellom ulike cytokiner på HLA-E produksjon av tumorcellelinjer. Ifølge våre tidligere resultater i melanomcellelinjer [12], viste vi at IFN-γ indusert eller økt sHLA-E produksjon, noe som fører til produksjon av sHLA-E med 50% av tumorcellelinjer ble testet (48 av 98) . Videre frigjøring av sHLA-E ble også drevet av IFN-α og TNF-α i en mindre grad. Tatt i betraktning at IFN-γ og IFN-α er høye indusere av HLA-I molekyler uttrykk, deres innvirkning på sHLA-E produksjon sannsynligvis gjenspeiler økningen av HLA-E uttrykk ved tumorceller. Siden sHLA-E frigivelse av melanomceller er hovedsakelig matriks-metalloproteinase-avhengige, kan TNF-α effekt på HLA-E produksjon være på grunn av evnen til TNF-α for å fremme matrise-metalloproteinase-ekspresjon [12], [28]. Disse resultatene er i samsvar med de av coupel
et al.
Viser sHLA-E produksjon av endotelceller etter behandling med IFN-γ og TNF-α [29]. Likevel, i opposisjon til sin studie, at vi ikke observere noen effekt av IL-1β behandling på sHLA-E produksjon av kreftceller, sannsynligvis på grunn av en lav ekspresjon av IL-1-reseptor (IL-1R1) av tumorcellelinjer som ble testet i vår studie. Men, som det har blitt rapportert at tumorcellelinjer, inkludert melanom cellelinjer, kan uttrykke IL-1R1, kan vi postulere at IL-1β, som er kjent for å fremme matrise-metalloproteinase-ekspresjon, kunne øke produksjonen av sHLA-E ved hjelp av IL -1R1 uttrykkende tumorceller [30], [31].
på grunn av sin virkning på proliferasjonen av tumorceller, angiogenese og dens immunomodulerende kapasiteter, er IFN-α brukes som immunterapi i behandlingen av forskjellige faste tumorer , som melanom og renal karsinom [32]. Derfor, som viser vi dens evne til å oppregulere sHLA-E produksjon av tumorcellelinjer, systemisk terapi med IFN-α kan øke sHLA-E produksjon i melanomapasienter. I denne støtten, er IFN-α behandling assosiert med forhøyet sHLA-G serumnivåer hos pasienter med melanom [33]. Videre har det blitt rapportert at γ-bestråling nedregulerer overflaten ekspresjon av HLA-G1 på melanomceller, ved å styrke den proteolytiske spaltning av dette molekylet [34]. Så vil det være interessant å finne ut om denne mekanismen er også observert med HLA-E, som da ville bli sluppet inn i svulsten mikromiljøet og påvirke herved den lokale immunologiske status.
Uavhengig av mulig mekanisme for sHLA- E produksjon, er det viktig å synliggjøre hvordan den generasjonen av sHLA-E av tumorceller kan bidra for immunosurveillance flukt. Siden samspillet av membran-bundet HLA-E med hemmende reseptorer CD94 /NKG2-A indusert hemming av NK og T-celle responser, den immunosuppressor aktiviteten sHLA-E bør undersøkes. Til støtte for en potensiell immunoregulatory fonction, coupel
et al.
Rapporterte at sHLA-E beskytter endotelceller fra NK-mediert cellelyse [29]. Videre sHLA-G og sMICA har vist seg å redusere immungjenkjennelse og ødeleggelse av tumorceller. sHLA-G, gjennom dets interaksjon med inhibitor reseptorer ILT-2 og ITL-4, er blitt vist å inhibere lytisk aktivitet av NK-celler, for å indusere apoptose av CD8
+ CTL, for å påvirke CD4
+ alloproliferation og til forringe NK /DC crosstalk [35] – [38]. Videre tumoravledet oppløselig MICA indusert endocytose og nedbrytning av beslektede activatory reseptor NKG2-D på tumor-infiltrerende lymfocytter, svekke deres aktivering [29], [39]. Til sammen disse dataene understreket viktigheten av tumor-avledet løselige NKR ligander i å gi en svulst mikro favorisering immun flukt. Videre har det blitt rapportert at sHLA-G fremstilles
in vitro
som monomere og multimere former, og at sHLA-G dimerisering forsterker ILT-2-mediert inhibering av T-celle-alloresponse [40]. Så, eksistensen av sHLA-E multimerer bør også undersøkes.
I konklusjonen, gir denne studien for første gang bevis for en forhøyet sHLA-E i sera fra melanom pasienter, noe som indikerer at HLA-E makt tjene som en markør for kliniske prognosen eller forutsigelse av de kliniske resultatene av disse kreftformer, spesielt i sammenheng med immunterapi. Fordi en følsom sHLA-E-ELISA har praktiske fordeler for storskala screening, kan det bli vedtatt for rutinemessig bruk i immunologiske oppfølging av melanomer og andre menneskelige kreftformer. Selv om funksjonen av tumoravledet oppløselig HLA-E gjenstår å bli definert, kan vi postulere at disse molekylene kan forsterke vertens immun undertrykkelse gjennom inhibering av funksjonene til NK og T-celler, og derved begunstiger overlevelsen av tumorceller. Den klinisk relevant funksjonen til disse sHLA-E molekyler må være nøye analysert for å utvikle hensiktsmessige immunterapeutiske strategier.
Materialer og metoder
Antistoffer
MEM-E /07 og MEM-E /08 mAbs (Exbio, Tsjekkia), som binder innfødte HLA-E proteiner ble brukt for ELISA.
peptider og rekombinant løselige HLA
peptider ble kjøpt fra Eurogentec (Angers , Frankrike). Renhet (mer enn 85%) ble kontrollert ved revers-fase høy-ytelse væskekromatografi. Diverse HLA og β2-mikroglobulin rekombinante proteiner ble refolded med fulgt indikerte syntetiske peptider. HLA-E * 0101 /VMAPRTLVL (HLA-A * 0201 signal peptid) og HLA-A * 0201 /AAGIGILTV (Melan-A
27-35) monomerer ble generert av rekombinant protein anlegget (IFR 26, Nantes). HLA-A * 2301 /PYLFWLAAI, HLA-B * 0702 /GILGFVFTL, HLA-B * 0801 /QAKWRLQTL og HLA-B * 2705 /HRCQAIRKK monomerer ble levert av tetramer produksjonsinnretning (Ludwig Institutt for kreftforskning, Lausanne, Sveits) .
pasienter og prøver
Sera prøver ble samlet fra pasienter med melanom (n = 127), alle med formell tillatelse. Sera fra friske donorer (n = 94) ble levert av Etablissement Français du Sang (EFS) (Nantes, Frankrike) og brukt som kontroller.
Etikk erklæringen
Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter og friske donorer. Alle disse studiene ble godkjent av de lokale etikk commmitees «Comité de Protection des Personnes Ouest IV-Nantes» og «Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé».
Cellelinjer kultur
melanomcellelinjer ble etablert i GMP Enhet for Cellular Therapy og i vårt laboratorium (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrike) og tilhører den Biocollection PC-U892-NL (CHU Nantes). Kolorektal karsinom cellelinjer ble kjøpt fra ATCC eller etablert i vårt laboratorium UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-FJ, CHU Nantes). Nyrekreft cellelinjer ble etablert i INSERM U1016 /CNRS UMR 8104, Paris, Frankrike) [41]. Brystkreftcellelinjer ble kjøpt fra ATCC eller etablert i vårt laboratorium UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-NG, CHU Nantes). Lungekreft cellelinjer og mesothelioma cellelinjer ble kjøpt fra ATCC eller gaver fra M. Grégoire (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrike, Biocollection PC-U892-MG, CHU Nantes). Myelomcellenes linjene var gaver fra C. Pellat (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrike, Biocollection PC-U892-MA, CHU Nantes). Eggstokk karsinom, glioma, leukemi, skjoldbruskkjertel, livmorhalsen og prostatakreft cellelinjer ble kjøpt fra ATCC og vennlig levert av C. Sai, F. Vallette og F. Paris (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Frankrike). Osteosarcom cellelinjer ble kjøpt fra ATCC og gaver fra M. Padrines (EA3822, INSERM U957, Nantes, Frankrike). Alle cellelinjer ble dyrket i RPMI eller DMEM med 10% føtalt kalveserum (FCS, PAA, Østerrike).
Tumor supernatanter produksjon
For sHLA-E produksjon screening, 500 000 kreftceller ble dyrket i 6-brønns plater i 3 ml 10% FCS-RPMI, supplementert eller ikke med IFN-γ (20 ng /ml). Etter 48 timer kreft supernatanter ble samlet, sentrifugert 5 minutter ved 2500 g og holdt frosset før testing i ELISA.
Virkningen av andre cytokiner etter sHLA-E produksjon, har i utgangspunktet blitt testet på 20 ng /ml i løpet av 48 timer med to melanom cellelinjer (M88 og M102) og en kolorektal adenokarsinom-cellelinje (HT29). Dose-responskinetikk og vurderinger av IFN-γ, IFN-α2a og TNF-α ble dernest foretatt som beskrevet (konsentrasjon i området fra 40 til 0,02 ng /ml i løpet av 1 til 6 dager) med disse tre tumor cellelinjer.
Påvisning av sHLA-E ved hjelp av ELISA
Nunc-Immuno MaxiSorp mikrotiterplater ble belagt (50 pl /brønn) med MEM-E /08 mAb ved 1 ug /ml i karbonat /bikarbonat-buffer (CO
3HNa 35 mm, CO
3NA
2 15 mM, pH 9,5) over natten ved 4 ° C. Etter fire vaskinger med PBS-0,05% Tween 20 (200 ul /brønn), ble platene mettet med PBS inneholdende 10% FCS i 2 timer ved romtemperatur (200 ul /brønn). Etter fire vaskinger, de biologiske prøvene (50 ul /brønn, eventuelt fortynnet i metningsbuffer) ble tilsatt (i triplikat) og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Kultursupernatanter ble undersøkt ufortynnet mens seks dobling fortynninger av sera ble anvendt. Den påvise biotinylerte MEM-E /07 mAb ble fortynnet til 1 pg /ml i metningsbuffer ble tilsatt etter fire vaskinger (50 ul /brønn) og inkubert på nytt i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket fire ganger og inkubert med strepta-HRP-reagens (BD Pharmingen) fortynnet 1/1000 i metningsbuffer i 1 time ved romtemperatur. Til slutt, Platene ble vasket fire ganger og inkubert med substrat (3,3 «, 5,5»-tetrametylbenzidin væske, Sigma, ST Qentin Falla, Frankrike) i 30 minutter ved romtemperatur i mørke (100 ul /brønn). Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 100 pl /brønn av 1 M H
3PO
4. Absorbansen ble målt ved 450 nm med en Thermo Scientific Multiskan EX. Analyse av standardkurven og interpolering av prøvene konsentrasjoner ble utført ved hjelp av Prism 5 programvare (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
Statistisk analyse
Sera av kreftpasienter ble sammenlignet med sera fra friske donorer. Ifølge ikke-parametrisk fordeling av sHLA-E serumnivåer, ble data presentert som gjennomsnitt, median, komfyrer og prosenter av positive sHLA-E sera. For generell sammenligning av to grupper, var statistisk analyse utført ved Mann-Whitney U-test. Fordeling av konsentrasjoner over scenen ble vurdert ved hjelp Kruskal-Wallis test. Å sammenligne frekvensen av positive sHLA-E sera ble Fisher test som brukes. Statistisk analyse av den modulerende effekt av cytokiner på sHLA-E produksjon av tumorcellelinjer ble utført ved enveis ANOVA og etterfulgt av post hoc Bonferroni-test. En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Prism 5 programvare (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
Takk
Vi takker Pr Marie-Françoise Avril (APHP, Hôpital Cochin, service de Dermatologie, Paris, Frankrike) for å gi melanom blodprøver. Forfatterne takker også Philippe Guillaume fra tetramer produksjonsanlegg av Ludwig Institutt for kreftforskning (Lausanne, Sveits) for produksjon av HLA monomerer.
