Abstract
Noen
Escherichia coli
stammer produserer toksiner utpekt cyclomodulins (CMS) som forstyrrer eukaryot cellesyklus av vertsceller, tyder på en mulig kobling mellom disse bakterier og kreftformer. Det er relativt få data om koloniseringen av tykktarmskreft ved cyclomodulin- og gentoksisk produserende
E. coli
. Vi gjorde en kvalitativ og fylogenetisk analyse av slimhinne-assosiert
E. coli
husing cyclomodulin-koding gener fra 38 pasienter med tykktarmskreft (CRC) og 31 med diverticulosis. Funksjonaliteten til disse genene ble undersøkt på cellekulturer og gentoksisk aktivitet av stammer blottet for kjent CM-koding genet ble undersøkt. Resultatene viste en høyere prevalens av B2 phylogroup
E. coli
husing de colibatin-produserende gener i biopsier av pasienter med CRC (55,3%) enn i de av pasienter med tykktarmsbetennelse (19,3%), (p 0,01). Likeledes, en høyere forekomst av B2
E. coli
husing de CNF1-koder gener i biopsier av pasienter med CRC (39,5%) enn i de av pasienter med tykktarmsbetennelse (12,9%), (p = 0,01). Funksjonell analyse viste at de fleste av disse genene var funksjonell. Analyse av evne til
E. coli
å overholde intestinal epitelceller Int-407 er angitt som svært tilhenger
E. coli
stammer hovedsakelig tilhørte A og D phylogroups, uansett opprinnelse stammer (CRC eller tarmbrokk), og at de fleste
E. coli-
stammer tilhørende B2 phylogroup vist meget lave nivåer av adhesjon. I tillegg 27,6% (n = 21/76)
E. coli
stammer blottet for kjente cyclomodulin-koding gener indusert DNA skade
in vitro
, som vurdert av kometen analysen. I motsetning til cyclomodulin produserende
E. coli
, disse stammene hovedsakelig tilhørte A eller D
E. coli
phylogroups, og viste en ikke-signifikant forskjell i fordelingen av CRC og tarmbrokk prøver (22%
versus
32,5%, p = 0,91). I konklusjonen, cyclomodulin produserende
E. coli
tilhører det meste til B2 phylogroup kolonisere tarmslimhinnen av pasienter med CRC
Citation. Buc E, Dubois D, Sauvanet P, Raisch J, Delmas J, Darfeuille-Michaud A, et al. (2013) høy forekomst av Slimhinner-Associated
E. coli
Producing Cyclomodulin og Genotoxin i Colon Cancer. PLoS ONE 8 (2): e56964. doi: 10,1371 /journal.pone.0056964
Redaktør: John R. Battista, Louisiana State University and A M College, USA
mottatt: 12. mai 2012; Godkjent: 18 januar 2013; Publisert: 14. februar 2013
Copyright: © 2013 Buc et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ministère Français de l’Education Nationale, de la recherche et de la Technologie, l’Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE (Inserm U1071), l’Institut National de la recherche Agronomique (USC-2018) og la Ligue contre le cancer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er i dag den tredje vanligste kreftformen hos menn og kvinner, og den fjerde største årsaken til kreftdød på verdensbasis, med 1,2 millioner estimerte tilfeller og 609.000 estimerte dødsfall per år [1]. Sporadiske CRC står for ca 95% av kolorektal tilfellene [2]. Genetiske faktorer er vanligvis antatt å utgjøre om lag 20% av kreft årsakssammenheng med miljø bidrar de resterende 80% risiko [3]. CRC er derfor sterkt knyttet til miljøeksponeringer inkludert bakterier som bidrar vesentlig til colonic miljø. Bevis har samlet viser at sammensetningen av human tarmfloraen påvirker verten helsestatus. Mikrobiell dysbiosis er observert i CRC pasienter og bevis for bakterielle interaksjoner i CRC har blitt rapportert for
Streptococcus bovis
,
Enterococcus spp.
,
Helicobacter pylori
,
Bacteroides fragilis Hotell og
Escherichia coli plakater (for oversikt se [4]). Ulike studier viser tydelig en sammenheng mellom mukosalt tilhenger
E. coli Hotell og CRC. Studier av kreftpasienter i Storbritannia og Tyskland viste at slimhinne-assosiert
E. coli
er oftere identifisert i colon vev fra pasienter med adenokarsinomer enn i den av kontrollene [5], [6]. Swidsinski
et al.
Rapporterte at bare 3% av kolon slimhinner biopsier fra asymptomatiske kontroller testet var positive for
E.
Coli med en bakteriell universell PCR [5]. I kontrast, biopsier fra 92% av pasientene med colonic adenom eller karsinom næret bakterier, med
E. coli
å være fremherskende i 70% av pasientene [5]. Tilsvarende Martin
et al.
Funnet at 70% av pasientene hadde CRC slimhinne-assosierte bakterier, og at en betydelig andel av bakterier tilhørte
E. coli
arter. Interessant, Bronowski
et al.
Viste at noen
E. coli
stammer bære virulens gener tidligere kategorisert som er spesifikke for uropathogenic
E. coli product: (UPEC) [7]. Slike
E. coli
stammer kan utløse celle spredning i tarmkanalen [8], sett med andre bakterier [9], [10].
E. coli
er de dominerende aero-anaerobe gramnegative arter av den normale tarmfloraen og deltar i å fremme stabiliteten av luminal mikrobielle flora og i å opprettholde normal intestinal homeostase [11]. Som et commensal,
E. coli
eksisterer på sin pattedyr vert i god harmoni og sjelden forårsaker sykdom. Men noen stammer bære en kombinasjon av virulens gener som gjør dem i stand til å forårsake intestinal (InPEC, Intestinal patogene
E. Coli
) og ekstra tarm (expec, Extraintestinal patogene
E. Coli
) infeksjoner (for se [12] – [14]). Fylogenetisk analyse har vist at
E. coli
består av fire hoved fylogenetiske grupper (A, B1, B2, og D) [15], [16]. Patogene stammer hører hovedsakelig til grupper B2 og D, mens de fleste fekal stammer tilhører gruppe A og B1. Stammer av grupper B2 og D ofte bære virulensfaktorer som mangler i gruppe A og B1 stammer [17] -. [19]
Blant
E. coli
virulensfaktorer, flere giftstoffer, kalt cyclomodulins, er å tiltrekke økende oppmerksomhet fordi de er gentoksiske og /eller modulere cellulær differensiering, apoptose, og spredning (for oversikt se [4]). Cytotoksisk nekrotiserende faktor (CNF) aktiverer Rho GTPases, noe som fører til cytoskeletal endringer og påvirker cellesyklusen. Syklusen hemmende faktor (CIF) målrette NEDD8-konjugert cullins å kapre vertscellesignalveier [20], [21]. Den genotoxin colibactin er en hybrid polyketide-non ribosomale peptid forbindelse [22]. Dens biosyntesen maskiner kodes av
pks
genomisk øya. Colibactin forårsaker DNA dobbel-tråd pauser og en kromosom ustabilitet i humane eukaryote celler [22], [23]. Den cytolethal distending toksin (CDT) induserer også DNA skade sannsynligvis gjennom DNAse aktivitet, og en nært beslektet enzym som produseres av
Helicobacter hepaticus
fremmer utviklingen av hepatitt til pre-ondartet, dysplastiske lesjoner og øker spredning av hepatocytter, gir det første bevis på at CDT har karsinogenitet
in vivo product: [24] – [26]
i denne studien sammenlignet vi utbredelsen av cyclomodulin- og genotoxin-koding gener i slimhinnene. -associated
E. coli
stammer fra reseksjon eksemplarer av CRC og diverticulosis. Vi undersøkte også gentoksisk aktivitet av slimhinne-assosiert
E. coli
blottet for kjente genotoxin-koding gener og deres evne til å forholde seg til epitelial tarmceller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Etisk godkjenning for studien ble gitt av Clermont-Ferrand forskningsetisk komité. Dette IRB tillatt for frafallelse av skriftlig samtykke og godkjent prosessen med å skaffe verbale samtykke fra potensielle fag, fordi forskningen innebærer ingen prosedyrer som skriftlig tillatelse er normalt kreves utenfor forskningssammenheng og utgjør ingen risiko for skade på fag. De biologiske prøver ble samlet inn fra tykktarm resections, som var nødvendig for behandling av pasienter. Etterforskerne forklarte studie av potensialet faget verbalt, og gir all relevant informasjon som formål, prosedyrer, mulige risikoer. Etter dette verbal forklaring, ble forsøkspersonen utstyrt med en studie informasjonsarket. Etter at forsøkspersonen tid til å lese studien informasjonsark, etterforskeren besvart flere spørsmål potensialet faget kan ha hatt. En muntlig avtale om å delta i undersøkelsen ble innhentet for alle pasienter inkludert i studien. Datoene for muntlig samtykke ble sporet i en ikke-identifiserbar måte.
Pasienter
For å studere makroskopiske prøver fra reseksjon av kolon prøver, vi sammenlignet pasienter med CRC og pasienter med tykktarmsbetennelse som en ikke-kreft gruppen. Seksti-ni pasienter ble undersøkt mellom mars 2007 og november 2009 kl universitetssykehuset i Clermont-Ferrand, Frankrike. Trettiåtte hadde CRC, og 31 hadde komplisert tarmbrokk (tabell S1, S2, S3). Pasienter fra CRC-gruppen hadde ukomplisert og resectable tykktarmskreft utvikles enten i den proksimale kolon (fra cecum til lever bøyning av ascendant tykktarmen) eller i den distale colon (sigmoid kolon). CRC for den tverrgående eller den etterkommer kolon ble ekskludert på grunn av deres lave forekomst, og for å unngå risiko for skjevhet. I alle tilfeller, den operasjon besto i segmental reseksjon av tykktarmen som er involvert ved svulsten med umiddelbar anastomose uten å avlede stoma. Pasienter med kompliserte CRC (obstruksjon, perforasjon eller infeksjon) ble ekskludert fra studien. Pasienter fra diverticulosis gruppen hadde diverticulosis involverer sigmoideum og måtte opereres på grunn av en historie med komplikasjoner (tilbakevendende divertikulitt, abcess, peritonitt). Vi utelatt pasienter med akutt eller kronisk inflammasjon ved tidspunktet for kirurgi, og de med stenose. I tilfelle av en nylig angrep av divertikulitt, ble antibiotika stanset minst 3 uker før operasjonen. Sex ratio var henholdsvis 1,05 og 0,72 for CRC og DIV pasienter. Aldersspredningen var 35-95 år for kreftpasienter (median alder 71 år og gjennomsnittsalder, 67 år) og 34-81 år for tarmbrokk pasienter (median alder 58 år og gjennomsnittsalder, 60 år). Prøvene ble tatt på resected kolon, på stedet av ondartede svulster for CRC pasienter og i normal slimhinne for tarmbrokk pasienter. Patologisk analyse bekreftet neoplastiske funksjonene prøvene i CRC pasienter, og mangel på betennelse eller dysplasi i tarmbrokk pasienter. CRC-serien består 21 proksimale og 17 distale kolon prøver. TNM stadium er rapportert i tabell S1 og S2. Tarmarbeidet ved oral natriumpikosulfat eller muntlig polyetylenglykol kvelden før operasjonen. Alle reseksjon pasientene hadde fått cefoxitin (2 g intravenøst) ved innsnitt og ingen hadde fått antibiotika i de 4 ukene før prøvetaking.
Prøve behandling
De slimhinneprøver ble plassert i 10 ml sterilt fosfatbufret saltvann pH 7,4 (PBS) og transportert på is til laboratoriet. Prøvene ble veiet (50 til 100 mg hver) og vasket grundig tre ganger i 10 ml PBS for å fjerne det meste av fecal bakterier. Hvert vasketrinn ble etterfulgt av sentrifugering ved 900 g i 5 minutter. Prøvene ble deretter knust (Ultra-Turrax, IKA) og inkubert i 15 minutter på et rør rotator ved romtemperatur i nærvær av Triton 0,1X. Ti gangers fortynninger av lysatet ble deretter sådd ut på agar Drigalski og kromogen agar chromID CPS3® (bioMérieux), som tillater identifisering av
E. coli
.
E. coli-
kolonier ble samlet etter 24 timers inkubering ved 37 ° C og identifisering av bakterier ble bekreftet med den automatiserte Vitek II® (bioMérieux) system. Når det er mulig maksimalt 96
E. coli
kolonier per prøve ble samlet for molekylær typing. Bakteriene ble dyrket i 24 timer ved 37 ° C i 96-brønners plater i Luria Bertani medium, supplert med 15% glycerol og deretter lagret ved -80 ° C.
Molecular typing og fylogenetisk gruppering
ti kolonier per prøve ble skrevet med molekylære metoder for å identifisere
E. coli
stammer (
E. coli
genotyper) kolon prøvene. To genotyping metoder ble brukt, en «Enterobacterial Repeterende intergeniske konsensus» sekvens (ERIC) -PCR ved bruk av primer ERIC2 (5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3 «) og en «Random Amplifisert polymorfe DNA» (RAPD) – PCR ved anvendelse av primer 1283 (5»-GCG ATC CCC A-3 «) [27], [28]. En representant stamme ble deretter analysert og lagret ved -80 ° C i Luria-Bertani-medium supplert med 15% glycerol.
E. coli
stammene ble deretter klassifisert i henhold til
E. coli
Reference Collection (EcoRI) system [16] inn i fylogenetiske gruppe A, B1, B2 og D ved hjelp av et multipleks PCR-teknikken [29]. Strain RS218, som havner alle genene målrettet av multipleks PCR, ble brukt som positiv kontroll.
Påvisning og identifisering av cyclomodulin-produserende gener
Cyclomodulin-koder ble påvist gener ved dot-blot DNA hybridisering eksperimenter i alle
E. coli
stammer. Probene ble oppnådd ved PCR som beskrevet tidligere [30] (tabellene S4 og S5) ved hjelp av PCR-DIG sonden syntese-sett (Roche Applied Sciences, Switserland) i henhold til produsentens instruksjoner. To mikrogram DNA-prøver ble festet på positivt ladet nylonmembraner ved UV-belysning i 20 min. Hybridisering ble utført med Roche merking og deteksjonssett (Roche Applied Sciences) som angitt av produsenten. Hvert sted ble sjekket med en 16S rRNA-genet sonde.
pks
øya, som inneholder colibactin produserende clusteret, ble screenet med en sonde overlappende
clbK
og
clbJ
gener.
CNF
genene ble oppdaget med en blanding av sonder spesifikke for
cnf1
,
cnf2
, og
cnf3
.
cdtB
genene ble oppdaget av to hybridisering eksperimenter med
cdtB-II-cdtB-III-cdtBV Hotell og sonde blandinger
cdtB-I-cdtB-IV
.
cif
genet ble oppdaget ved hjelp av en intern spesifikk probe. De følsomhet og spesifisitet av sondene ble kontrollert på hver membran ved å fange opp DNA-ekstrakter av alle cylomodulin kontrollstammer. Positive hybridiseringer med en cyclomodulin probe ble utsatt for bekreftende PCR-analyser som tidligere rapportert [30]. Reaksjonsblandingen inneholdt 50 ng DNA-prøve, 0,2 mM av hver deoxynucleosid trifosfat (dNTP), 0,4 M av hver primer, 3 mM MgCl2, og 1,0 U RedGoldStar DNA-polymerase (Eurogentec, Belgia) i den tilsvarende reaksjonsbuffer. Primere som ligger i den 5 «og 3» regioner av pks øya (clbA og clbQ gener) ble anvendt for å bekrefte fullstendig nærvær av colibactin-produserende øy.
cytopatisk assays
HeLa -celler (avledet fra livmorhalskreft) kjøpt fra ATCC (ATCC® CCL-2
TM) ble opprettholdt i en atmosfære inneholdende 5% CO2 ved 37 ° C i passende medium. Cellene ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% (volum /volum) føtalt kalveserum (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% L-glutamin (Life-Technologies), 200U penicillin, 50 mg streptomycin, 0,25 mg av amphoterocin B per liter, og 1% HEPES-bufret saltvannsoppløsning (Lonza). De ble sådd ut i 96-brønners vevkulturplater ved 5 x 10
4 celler /brønn i 24 H. Den cytopatiske virkninger av CNF og CDTs ble undersøkt i alle stammer fra celle-lysat, som tidligere beskrevet [31]. I korthet, ble virkningene av CDT og CNF detektert av en celle-lysat-veksel test. Etter 48 H kultur ved 37 ° C med risting i Luria-Bertani buljongmedium, ble bakteriecellene ultralydbehandlet, og sterilfiltrert separat ved 0,22-um-pore-størrelse filtre. HeLa-celler ble behandlet med sterilt sonikerte lysatet (endelig proteinkonsentrasjon: 4 ug /ml) inntil analyse. Virkningene av colibactin og Cif ble påvist ved en celle-bakterie-veksel test, basert på interaksjonen mellom HeLa-celler og bakterier. Overnattings Luria-Bertani kjøttkraft kulturer av
E. coli
ble vasket tre ganger og fortynnet i samspill medium. HeLa-cellekulturer ble infisert ved multiplisiteter av infeksjon (MOI, antall bakterier per celle i begynnelsen av en infeksjon) av 100 og 200. Cellene ble vasket fire timer etter inokulering og inkubert i cellekulturmedium med 200 ug /ml gentamicin inntil analyse . Etter 72 timers inkubering ved 37 ° C under en 5% CO2-atmosfære, ble mediet fjernet ved tre vaskinger av HeLa-cellemonolagene. Det ble ikke observert de morfologiske endringene karakteristisk for CDT, CNF, colibactin, og Cif etter farging med Giemsa beis. Identifikasjons var basert på evnen av enten bakteriell lysat inneholdende CNF og CDT eller hele levende bakterier som produserer colibatin og CIF å indusere en cytopatisk effekt på epitelceller analysert ved 3 dager etter infeksjon. Colibactin, CDT og CIF induserte cytopatiske effekter, noe som gjenspeiles av forstørrede kjerner og celle distensjon (megalocytosis), mens CNF indusert multinucleation, og utvidelse av HeLa celler. Multinucleation er observert i 50% av celler som er infisert av CNF-produserende bakterier og i omkring 10% av ikke-infiserte celler eller celler infisert med andre CM-produserende stammer. For CNF og CDT, er cytopatisk effekt bare observerbar med bakterielle lysater. I motsetning til dette, for colibactin og CIF, er nødvendig kontakt mellom bakterier og vertsceller. Påvisning av a-hemolysin ble utført for alle stammer undersøkt ved vekst over natten ved 37 ° C på Columbia saueblod (5%) agar (Oxoid, Dardilly, Frankrike).
E. coli
25922 (ATCC) ble brukt som referanse påkjenning for alpha-hemolysin produksjon.
encellede gelelektroforese
gentoksisk aktivitet av
E. coli
stammer blottet for kjente CM-koding gener ble undersøkt ved hjelp av encellede gelelektroforese (kometmetoden). HeLa cellekulturer ble smittet ved MOI på 500 med
E. coli
dyrket over natten i Luria-Bertani kjøttkraft. Cellene ble vasket to ganger 3H etter inokulering og ble inkubert over natten i cellekulturmedium med 200 ug /ml gentamycin ved 37 ° C under en 5% CO
2 atmosfære. De ble deretter vasket med PBS medium og kombinert med 0,5% lavt smeltepunkt agarose (Bio-Rad, Marnes La Coquette, Frankrike) ble oppløst i steril PBS ved 37 ° C. Den celle-agarose blanding ble påført på et objektglass forbelagt med 1,5% normal-smeltepunkt agarose (Molecular Biology Grade, Bio-Rad) ble oppløst i steril PBS ved 37 ° C. Et dekkglass ble påført og tillatt å stivne ved 4 ° C i 60 min. Objektglass ble deretter plassert i 50 ml lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl, 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA inneholdende 1% Triton X-100, 10% DMSO, pH 10) for 2 timer ved 4 ° C i mørket. Objektglass ble neddykket i elektroforese buffer (1 mM EDTA 300 mM NaOH pH 13) i 1 time ved 4 ° C, og et elektrisk felt ble påført (1 V /cm) i 40 minutter. Glassene ble nøytralisert med 400 mM Tris-HCl pH 7,5 og tørket. 40 ul av en 1: 10.000 fortynning av SybrGreen ble brukt direkte til raset. Individuelle celler eller kometer ble sett av Zeiss Axioplan2 fluorescens mikroskop. B2
E. coli
belastning IHE3034 og
E. coli
DH10β pBACpks ble brukt som positive kontroller [22]. B2
E. coli
belastning IHE3034 Δ
ryggplager Hotell og
E. coli
DH10β pBAC ble brukt som negative kontroller [22].
Heft analysen
Int-407 celler (avledet fra human intestinal embryonale jejunum og ileum) kjøpt fra ATCC (ATCC® CCL -6
TM) ble opprettholdt i en atmosfære inneholdende 5% CO2 ved 37 ° C i passende medium. De ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% (volum /volum) føtalt kalveserum (Lonza, Walkersville, MD USA), 1% L-glutamin (Life-Technologies), 200U penicillin, 50 mg streptomycin, 0,25 mg amphoterocin B per liter, og 1% HEPES-bufret saltvannsoppløsning (Lonza). I korthet ble cellene sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5 celler /cm2 i kulturplater i 48 H. Infeksjonen ble utført ved en multiplisitet for infeksjon på 10 bakterier pr celle. Infiserte celler ble sentrifugert ved 900 g i 10 minutter ved 25 C og plassert ved 37 ° C i 3 H. Cellene ble vasket tre ganger i fosfat-bufret saltløsning (PBS; pH 7,2). Epitelcellene ble deretter lysert med 1% Triton X-100 (Sigma) i avionisert vann. Prøvene ble fortynnet og sådd ut på Luria-Bertani (LB) agarskåler for å bestemme antall CFU svarende til det totale antall celleassosierte bakterier. Stammer
E. coli
K12 og
E. coli
LF82 ble anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis [32]. Resultatene er uttrykt som antall heftende bakterier per celle etter en 3 H infeksjon periode.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Fisher nøyaktige og chi-kvadrat tester. For flere gruppesammenligninger, ble en innledende chi-kvadrat test for heterogenitet gjort, og bare hvis dette ga en P-verdi på 0,05 var de individuelle parvise sammenligninger testet
Resultater
E. coli
stammer i tykktarmskreft og diverticulosis prøver
Analysen av
E. coli
stammer indikerte at antall prøver uten
E. coli
var signifikant høyere i tarmbrokk pasienter (19,4%, n = 6/31) enn hos pasienter med CRC (2,6%, n = 1/38), p = 0,04 (tabell 1). Mange colonic prøver næret bare en
E. coli
genotype. Dette ble observert i 42,1% (n = 16/38) av CRC prøver og i bare 25,8% (n = 8/31) av tykktarmsbetennelse, men forskjellen var ikke signifikant (p = 0,12). De fleste stammer isolert fra CRC tilhørt B2 phylogroup (73,7%, n = 28/38) i motsetning til de som er isolert fra divertikulose (41,9%, n = 13/31), p 0,01 (tabell 2). Ingen signifikant forskjell i
E. coli
phylogroup fordeling ble observert, også for B2
E. coli
stammer isolert fra proksimal (82,4%, n = 14/17) og distale colontumorer (66,7%, n = 14/21), p = 0,23 (tabell 2). Samlet
E. coli
stammer som tilhører B2 phylogroup kolonis colontumorer oftere enn de gjorde tarmbrokk prøver.
Distribusjon av CM-koder gener i henhold til
E. coli
fylogenetiske grupper
Fordelingen av CM-koder gener i
E. coli-
stammer er vist i tabell 3 og tabell S1, S2, S3. Den hyppigste egenskap var colibactin-koding
pks
øya (80% av CM-produserende
E coli
, n = 28/35 og 24,1% av total
E. Coli.
stammer, n = 28/116). Alle stammer forbundet med colonic slimhinnene i pasienter med CRC eller diverticulosis huse den colibactin-koding
pks
øya tilhørte phylogroup B2 (p 0,001 for gruppe B2
versus
gruppene A, B1 og D, individuelle eller kombinert). I tillegg 16,4% (n = 19/116) av stammer besatt
CNF
genet; av disse bare var
cnf2
-positivt og ingen var
cnf3
-positivt, noe som indikerer at disse stammene var ikke av animalsk opprinnelse [33], [34]. Alle
cnf1
-harboring stammer tilhørte også phylogroup B2, og utgjorde 36,7% (n = 18/49) av stammer av denne phylogroup. Som for
pks
øya, foreningen
cnf1
med phylogroup B2 var sterk (p 0,001 for gruppe B2
versus
gruppene A, B1 og D, individuelle eller kombinerte ), og 33% (n = 16/49) av B2 stammer besatt både
pks
øya og
cnf1
genet (p 0,001 for gruppe B2 versus gruppene A, B1 og D , individuelt eller kombinert), som tidligere observert [30], [35]. Alle bortsett fra tre stammer som bærer
cnf1
genet utstilt alfa-hemolytiske fenotype. Men de tre ikke-hemolytisk
cnf1
-positive stammer næret
hlyC
genet.
cdtB
gener ble observert i seks stammer. Selv om fire av seks
CDT
-positive stammer tilhørte phylogroup B2, ble ingen signifikant sammenheng med en spesiell fylogenetisk gruppe observert, selv med de forskjellige
cdtB
genet subtyper.
cdtB-I Twitter /
cdtB-IV
gener (n = 5) er sett oftere enn i
cdtB-II-cdtB-III-cdtBV
genet gruppe (n = 1). Den eneste
CDT-III
-positivt belastning også næret
cnf2
genet, en kombinasjon av gener ofte rapportert i pVir plasmid og hovedsakelig sett i stammer av bovin opprinnelse [36], [37 ].
cdtB
gener viste ingen spesiell tilknytning til colibactin-koding
pks
øya eller
cnf1
genet. Siden
CDT
gener har blitt grundig studert i Shiga toksin-produserende
E. coli product: (STEC) stammer [38] – [40], ble det besluttet å undersøke
cdtB
-positivt stammer for
stx Hotell og
EAE
gener. Nei
stx
eller
EAE
genet ble oppdaget i
cdtB
-positive stammer.
cif
genet ble påvist i tre stammer som tilhørte phylogroups A (n = 1) og B1 (n = 2) og næret ingen andre CM-koder gener. CIF er en effektor av type 3 sekresjon system kodet av locus av enterocyte utslettelse (LEE) observert i enteropatogen
E. coli product: (EPEC) og enterohemorrhagiske
E. coli product: (EHEC) [41], [42] og de tre positive stammer i denne studien hadde den
EAE
genet men verken
stx1
eller
stx2
gener , og derfor tilhørte EPEC patotype.
Fenotypisk påvisning av cyclomodulins
Cell-lysat-samspill tester ble brukt for å undersøke CNF og CDT produksjon i alle stammer. Påvisningen av colibactin og CIF produksjon, noe som krever celle-bakterie-veksel tester, var bare mulig i ikke-hemolytiske stammer, fordi hemolysin-produserende stammer, i motsetning til de tilsvarende lysatene, induserte hurtig celledød. Resultatene er angitt i tabell S1, S2, S3. Colibactin, CDT og CIF induserte cytopatiske effekter, noe som gjenspeiles av forstørrede kjerner og celle distensjon (megalocytosis), mens CNF indusert multinucleation i ≥50% av celler og utvidelse av HeLa-celler (figur 1). For CNF og CDT, den cytopatisk effekt var bare observeres med bakterielle lysater, mens en kontakt mellom bakterier og vertsceller som var nødvendig for colibactin og CIF, som tidligere rapportert (figur 1) [22], [31], [42]. Observasjon av en cytopatisk effekt ble knyttet til nærværet av CM-kodende gener. Tre stammer som bærer en
pks
øy isolert fra diverticulosis, fjerne og nære kolon prøver fremkalte ikke noen cytopatisk effekt. En stamme isolert fra en diverticulosis prøven hadde en ikke-fungerende
cnf1
genet og to
CDT
-positive stammer viste ingen cytopatisk effekt. For belastningen husing
cnf2 Hotell og
CDT
iii gener, 50% celle multinucleation atte til produksjon av CNF og den brede megalocytosis tilskrives CNF produksjon eller dens kombinasjon med CDT-III . En cytopatisk effekt ble observert for de stammer som bærer den
cif
genet. Totalt sett, de fleste CM-koder gener var funksjonelle, spesielt
CNF Hotell og
cif plakater (93% og 100%, henholdsvis).
For CNF og CDT, den cytopatisk effekt er bare observerbar med bakterielle lysater. I motsetning til dette, for colibactin og CIF, kreves en kontakt mellom bakterier og vertsceller. Colibactin, CDT og CIF induserte cytopatiske effekter som sett av forstørrede kjerner og celle distensjon (megalocytosis), mens CNF indusert multinucleation og utvidelse av HeLa celler.
Distribusjon av CM-koder gener i henhold til prøven opprinnelse og den phylogroupe
resultatene er vist i tabell 4, figur 2 og tabell S1, S2, S3. Tjuefem CRC prøver blant 38 (65,8%) inneholdt CM-positive
E. coli Hotell og bare 6 tarmbrokk eksemplarer blant 31 (19,4%), noe som indikerer at CM-husing stammer ble fortrinnsvis i forbindelse med CRC (p 0,01). Denne forskjellen var assosiert med et høyt antall CM-positive B2
E. coli
i CRC eksemplarer sammenlignet med det som ble observert i tarmbrokk prøver (figur 2). Følgelig stammer colibactin-koding
pks
øya var til stede i 55,3% av CRC prøver (n = 21/38), og bare i 19,3% av tarmbrokk prøver (n = 6/31), noe som indikerer at
PKS
positive stammer var signifikant (p 0,01) mer utbredt i CRC. I mindre grad,
CNF Hotell og
CDT
positiv
E. coli
var signifikant (p≤0.02) mer utbredt i barnekonvensjonen enn i diverticulosis prøvene. Disse forskjellene var hovedsakelig på grunn av den høye forekomsten av
pks
-,
CNF
– og
CDT
-positivt
E. coli
i distale CRC eksemplarer sammenlignet med i tarmbrokk prøver (p≤0.01). Til sammen disse resultatene tyder på at CM-positive
E. coli
fordeling varierer i henhold til prøven opprinnelse.
A,
E. coli
stammer (n = 70) isolert fra CRC prøver (n = 38), og B,
E. coli
stammer (n = 46) isolert fra tarmbrokk prøver (n = 31).
Genotoksisitet av
E. coli
blottet for CM-koding gener
Vi undersøkte om
E. coli
blottet for kjente CM-koding gener kan indusere DNA-skade i vertsceller. Ved hjelp av HeLa dyrkede celler ble gentoksisitet av stammer undersøkt av encellede gelelektroforese analysen (eller komet assay), state-of-the-art teknikk for å påvise DNA-skader forårsaket av kjemiske genotoxins. Totalt 76 klinisk
E. coli
stammer ble undersøkt; 15 stammer fra proksimale tykktarmskreft, 21 fra distal tykktarmskreft og 40 fra diverticulosis. Disse stammer tilhørte A (n = 29), D (n = 21) og B2 (n = 17) phylogroups. Interessant, 27,6% (n = 21/76) av
E. coli-stammer
blottet for kjente CM-kodende gener induserte dannelsen av komet, som er typisk av vertscelle DNA-skade (figur 3 og tabell S1, S2, S3). I tillegg, i motsetning til CM-produserende
E. coli
stammer, som tilhører hovedsakelig til B2 phylogroup disse komet positive stammer tilhørte hovedsakelig til A (52%, n = 11/21) og D (29%, n = 6/21) phylogroups. Komet ble observert med 13 stammer (32,5%) blant 40 isolert fra pasienter med divertikulose, og med 8 stammer (22%) blant 36 hos pasienter med CRC. Fordelingen av disse antatte gentoksiske stammer i prøvene ble derfor forskjellig fra CM-koder stammer.
DNA-skader ble ikke påvist i HeLa celler infisert med
E.
