Abstract
Innledning
Deksametason (DEX) co-behandling har vist seg nyttig i NSCLC pasienter, forbedre kliniske symptomer ved reduksjon av bivirkninger etter cellegift. Imidlertid har nyere studier vist at DEX kunne gjengi kreftceller mer ufølsomme til cytotoksiske medikamentell behandling, men det er ikke kjent om DEX co-behandling kan påvirke terapi-indusert senescence (TIS), og ukjent om det er i en p53-avhengige eller p53-uavhengig måte.
Methods
Vi undersøkte i forskjellige humane NSCLC-cellelinjer og detekteres cellulær begynnende alderdom etter cisplatin (DDP) behandling i nærvær eller fravær av DEX.
in vivo
effekt av kombinasjonen av DEX og DDP ble vurdert av tumorvekst eksperimenter med humane lungekreftcellelinjer voksende som xenografttumorer i nakne mus.
Resultater
samtidig behandling med DEX under kjemoterapi i NSCLC resulterte i øket tumorcellelevedyktighet og inhibering av TIS sammenlignet med DDP-behandlede gruppe. DEX co-behandlings celler viste reduksjon av DNA-skade signalveien proteiner, den nedre ekspresjon av p53 og p21
CIP1, den nedre cellulære sekretoriske program og nedregulering av NF-kB og dets signalkaskade. DEX også betydelig redusert DDP følsomhet
in vivo
.
Konklusjoner
Våre resultater understreker at DEX reduserer kjemoterapi følsomhet ved blunting terapi ga mobilnettet senescence etter kjemoterapi ved NSCLC som kan, i det minste delvis, i et p53-avhengig måte. Disse dataene derfor heve bekymringer om den utbredte kombinert bruk av gluocorticoids (GCS) med antineoplastiske legemidler i den kliniske behandlingen av kreftpasienter
Citation. Ge H, Ni S, Wang X, Xu N, Liu Y, Wang X, et al. (2012) Dexamethasone Reduserer Følsomhet til Cisplatin av Blunting p53 avhengig cellulær Senescence i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (12): e51821. doi: 10,1371 /journal.pone.0051821
Redaktør: Maurizio D’Incalci, Istituto di RICERCHE Farmacologiche Mario Negri, Italia
mottatt: 19 juli 2012; Godkjent: 06.11.2012; Publisert: 18.12.2012
Copyright: © 2012 Ge et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra tredje program av National Project «973» (til Spring Snow Jian Bai), tredje program av National Project «985» (til Spring Snow Jian Bai), National Natural Key Science foundation of China (30930090) (til Spring Snow Jian Bai), og National Natural Science Foundation of China (30971306 /H0107) (til Songshi Ni) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Glukokortikoider (GCer) som deksametason (DEX) er mye brukt som et ko-behandling med kjemoterapi på grunn av deres effektivitet for å forhindre ødem, kvalme og toksisk reaksjon forårsaket av cytotoksisk behandling i tumorpasienter [1]. GCer co-behandlingen forbedrer også appetitt, vekttap og lindrer smerter i skjelettet [2]. Imidlertid nyere studier indikerer at GCer kan hemme effekten av kjemoterapi ikke bare i etablerte cancercellelinjer og tumorxenografter [3], [4], [5], men også i de nylig isolerte celler fra kirurgiske resections fra tumorer av forskjellig opprinnelse [6], [7], [8]. Videre reduserer GCer co-behandlingen flere cytostatika følsomhet, inkludert DDP [3], paclitaxel [9], [10], trastuzumab [4], gemcitabin [6] og camptothecin [11]. En økende mengde bevis antydet at GCer nedsatt cellulær følsomhet overfor kjemoterapi kan skje gjennom flere mekanismer, for eksempel ved å forsterke DNA-reparasjon kapasitet, undertrykker vert anti-tumor immunrespons, og å blokkere apoptose [5], [11], [12] . Men de molekylære mekanismene bak effekten av GCer er fortsatt i stor grad ukjent.
Worldwide, lungekreft teller for det største antallet nye krefttilfeller og dødsfall fra kreft årlig [13], og en stor mengde bevis indikerer at DDP-basert adjuvant kjemoterapi øker overlevelse hos pasienter med fullstendig reseksjon ikke-småcellet lungekreft [14], [15], [16]. Cytotoksiske medikamenter så som DDP kan aktivere DNA-skade signalveien [14], [17] og føle proteiner, så som γH2AX og 53BP1, som er medvirkende til å lede celle senescens [18], [19]. Cellular senescens er kjennetegnet ved en irreversibel arrest av cellevekst, slik at det kan forhindre avvikende og ubegrenset proliferasjon av tumorceller [20]. Senescent celler vise forstørrede morfologiske endringer og mindre bevegelighet enn unge celler, som kan bidra til undertrykkelse av celle migrasjon, invasjon og metastasering [21]. Derfor cellulære senescence fungerer som en viktig barriere mot kreft og spiller en viktig rolle i tumor undertrykkelse.
For å analysere om DEX kan også redusere DDP følsomhet ved blunting mobilnettet senescence, undersøkte vi mobilnettet senescence i forskjellige humane NSCLC cellelinjer og xenotransplantater etter DDP behandling i nærvær eller fravær av DEX. Vi fant at DEX hadde en sterk anti-senescens effekt i de benyttede carcinoma celler så vel som i humane xenotransplantater i nakne mus. Dette var på grunn av hemmingen av NF-kB aktivitet som resulterer i en blokade av p53 signalveien. Direkte overføring av p53 og NF-kB restaurert senescence følsomheten DEX-behandlet karsinomer i NSCLC cellelinjer. Disse
in vitro Hotell og
in vivo
data tyder på et behov for nøye vurderer bruk av DEX og andre GCer sammen med kjemoterapi ved behandling av pasienter med lungekreft.
Materialer og metoder
cellekulturer og Stimulering av celler
NSCLC cellelinjer A549, NCI-H292 og NCI-H1299 ble kjøpt fra Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) [22], [23], [24]. A549-celler ble dyrket i F12-K-medium. H292 og H1299-celler ble dyrket i RMPI 1640-medium. DDP (Sigma Aldrich) ble løst i DMF ved en konsentrasjon på 10 mM. En 10 mM stam av DEX (Sigma Aldrich) ble fremstilt i dobbeltdestillert vann. Etter forbehandling av DEX i 24 timer, ble cellene behandlet med DDP i 48 timer. Cellene ble deretter vasket for å fjerne narkotika og inkubert i ytterligere 3 dager i frisk media.
Proliferation Screening og Cell Proliferation Assay
Antall levedyktige celler ble beregnet ved hjelp av Cell Counting Kit-8 ( Dojindo, Kumamoto, Japan) assay som ga effektiv og reproduserbar bestemmelse av proliferativ aktivitet av celler. For å måle den proliferative aktivitet av celler i 96-brønners mikroplater ble CCK-8 tilsatt (10 ul /brønn), og inkubasjonen ble fortsatt i 1 time. Absorbansen ble målt ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser (Molecular Devices) med en referanse bølgelengde på 650 nm.
Alive Måling av Cell Bio-atferd
Cell bio-atferd ble målt ved real- tid celle overvåkingssystem, ved bruk av en Cell-IQ celledyrking plattform utstyrt med en fasekontroll mikroskop og et kamera [25]. Bilder ble tatt med 5 minutters intervaller i 48 timer. Analysen ble gjennomført med et fritt distribuert bildeprogramvare (McMaster biophotonics Facility, Hamilton, ON, Canada), ved hjelp av manuell tracking plugin opprettet av Fabrice Cordeliéres (Institut Curie, Orsay, Frankrike). Behandlet med DDP i nærvær eller fravær av DEX, deretter A549 og H292-celler ble dyrket i celle-IQ system med 24-brønners plater i 48 timer. Cell-IQ systemet automatisk diskriminert cellestadiet og beregnede totale celle tall. Hver gruppe inneholdt seks replikere bildesider.
immunfluorescens
Celler ble fiksert i 4% paraformaldehyde i 15 min og permeabilized i PBS-0,2% Triton i 10 min. Etter blokkert i en time, primære antistoffer (γH2AX: 2212-1, epitomics, 1:100, 53BP1: AB36823, Abcam, 1:100, NF-kB: Cell Signaling Technology, 1:100) ble fortynnet i blokkeringsbuffer og inkubert med faste celler over natten ved 4 ° C. Cellene ble vasket, inkubert med sekundære antistoffer (Jackson, 1:100) i 1 time ved romtemperatur. Alle snittene ble motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Immunfluorescens ble utført ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskopi (Lecia) eller fluorescens mikroskopi (Olympus).
apoptose Analyser, BrdU innlemmelse
tunel reaksjonen ble utført ved hjelp av TUNEL in situ celledød deteksjon kit fluorescein (Roche anvendt vitenskap, Laval, Quebec, Canada) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 min. Cellene ble deretter permeabilisert i 2 minutter på is før merking med 50 ul TUNEL reaksjonsblanding og inkubering ved 37 ° C i 1 time. Etter vasket, ble lysbilder montert og undersøkt ved fluorescens mikroskopi. Prosentandelen av apoptotiske celler ble beregnet som (TUNEL-positive celler /totalt antall celler x 100)%. Inkorporerte BrdU ble gjenkjent av BrdU celleproliferasjonsanalyse (QIA58, Calbiochem, Merck, Tyskland). BrdU ble tilsatt og inkubert i ytterligere 24 timer, og deretter fikser /denaturerende oppløsning ble tilsatt i 30 min. Anti-BrdU-antistoff (1:100) ble tilsatt for å samhandle med inkorporerte BrdU i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble cellene inkubert med anti-BrdU-antistoff (1:1000) i 30 min. Etter vaskes, slutte-løsning ble tilsatt, og absorbansen ble målt ved anvendelse av en spektrofotometrisk plateavleser ved to bølgelengder på 450-540 nm.
Senescence-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) Farging og Kvantifisering
Celler ble vasket for å fjerne stoffer og inkubert i ytterligere 3 dager i friskt medium. In situ farging av SA-β-gal med celler eller frosne snitt ble utført ved hjelp av en begynnende alderdom-β galaktosidase flekker kit (Beyotime Institutt for bioteknologi, Kina) etter produsentens anvisninger. Celler ble ansett som positivt når cytoplasma ble farget med SA-β Gal. Alle forsøk ble utført in triplo.
FACS analyse
Celler ble fiksert i 70% iskald etanol og farget med PBS inneholdende 50 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich) og 100 ug /ml RNase A for DNA-innhold analyse ved strømningscytometri-analyse på en FACSCalibur system (BD). Prosentandelen av celler i ulike cellesyklusfaser ble beregnet ved hjelp FlowJo programvare (Tre stjerners Inc., Ashland, OR, USA).
RNA Utvinning og Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert bruker RNeasy MINIKIT (Qiagen, Hamburg, Tyskland). RNA (2 mikrogram) ble omvendt transkribert til komplementære deoksyribonukleinsyre og 40 ng av komplementære DNA ble brukt som mal for real-time PCR. Den forsterkning sykkel reaksjonene (40 sykluser) ble utført som følger: 5 sek ved 95 ° C og 30 sekunder ved 60 ° C. Relative kvantifisering verdier av målgener ble standardisert i henhold til den komparative terskelen syklus (2
-ΔΔCT).
Western Blot analyse
Proteiner (30 mikrogram) i total cellelysat var separert ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert i 1 time ved romtemperatur og vasket 3 ganger med 15 ml TBS /0,1% Tween. Blottene ble deretter inkubert med anti-PCNA (1:1000 Millipore), anti-trime H3K9 (1:1000, Cell signalering), anti-trime H3K27 (1:1000, Cell signalering), anti-53BP1 (1:1000; Abcam), anti-γH2AX (1:1000; Epitomics), anti-PCNA (1:1000, Sigma-Aldrich), anti-p53 (1:1000, Cell Signaling), anti-p21
CIP1 (1:1000 ; Cell Signaling), anti-p27
KIP1 (1:1000, Cell signalering), anti-pRb (1:1000, Cell signalering), anti-cyclin A (1:1000, Cell Signaling) og anti-GAPDH ( 1:1000, Sigma-Aldrich). Membranene ble vasket og deretter inkubert med sekundært antistoff (1:1000) i 1 time. Bånd ble visualisert ved kjemiluminescens (ECL, Amersham), etterfulgt av eksponering for røntgenfilm (RX-U; Fujifilm). Bands tetthet ble densitometrically kvantifisert ved hjelp ImageJ (National Institutes of Health).
luciferaserapportørplasmid Analyser
pGL3-p53 og pGL3-NF-kB ildflue luciferase reporter plasmider (gave fra Dr HO Liu) ble anvendt i forbindelse med kontroll pGL3-basisvektor (Promega) og intern kontroll plasmid PRL-SV40 (Promega). Cellene ble dyrket i 24-brønners plater 1 × 10
5 /godt over natten og transfektert med den angitte plasmid bruker X-tremeGENE HP DNA Transfeksjon Reagens (Roche, 06366236001) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon og lysater ble analysert for firely og Renilla luciferase-aktivitet ved anvendelse av den doble luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI). Data ble representert som folden induksjon i forhold til pGL3-Basic vektor. Tre uavhengige transfeksjon eksperimenter ble utført i tre eksemplarer for hver eksperimentell konstruksjon.
Nude Mus og xenografter
Vår dyreforsøk ble godkjent og utført i streng overholdelse av regler og retningslinjer fastsatt av Fudan University Animal Care og bruk Committee. I korthet, en x 10
7 A549 cellene med 100 ul PBS ble injisert til flanken av 4-uker gamle nakne mus. DDP 5 mg /kg ble injisert intraperitonealt ukentlig over en periode på 4 uker når tumorstørrelsene nådde et volum på 200 mm
3 i fravær eller nærvær av DEX. DEX 0,2 mg /kg ble gitt via sonde to ganger daglig dagen før, samme dag og dagen etter DDP administrasjon. Tumorvekst ble serie overvåket med calipers måling av to vinkelrette diametre. Tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av formelen:. Mus ble humant avlivet ved tumor størrelser . 3000 mm
3
Statistical Analysis
Alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Gruppe forskjeller ble evaluert ved en-veis ANOVA eller ved Student «s
t
-test som er hensiktsmessig. Kaplan-Meier-analysen ble anvendt for å beregne overlevelse sannsynligheter. Forskjeller mellom eksperimentelle grupper med
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
DEX Co-behandling Økt celleviabilitet i DDP Behandlet NSCLC cellelinjer
for å undersøke effektene av DDP alene eller pluss DEX på overlevelse
in vitro
, brukte vi CCK8 analyse og undersøkt i NSCLC cellelinjer A549 og H292. DDP kunne gi en betydelig redusere overlevelse celle tall på en doseavhengig måte i NSCLC celler. I A549 og H292-cellelinjer IC50 var 7,12 uM og 5,44 uM, respektivt. Samtidig behandling med en mikrometer DEX økt betydelig de overlevelse celle tall og IC50 (A549:15.78 mikrometer, H292:11.60 mm) sammenlignet med DDP alene (
P
0,05). (Figur 1A)
(A) påvisning av IC50 av CCK-8-analyse. NSCLC-cellelinjer ble dyrket i et medium inneholdende forskjellige doser av DDP (0 um, 1 uM, 2 uM, 4 uM, 8 uM, 16 uM, 32 uM, 64 uM, 128 uM) som angitt i fravær eller nærvær av 1 pM DEX i to dager, og deretter levedyktigheten til cellene ble målt. (B) Celleviabilitet assay som reaksjon på de angitte DDP konsentrasjoner (0 M, 5 x 10
-7 M, 1 x 10
6 M, 2 x 10
-6 M, 4 x 10
-6 M og 8 x 10
-6 M) ble målt ved hjelp av CCK-8-analysen i 5 dager, inkludert 2 dager med DDP behandling og ytterligere 3 dager med legemiddel fritt medium inkubasjon. (C) Representative fluorescens mikroskopiske bilder av A549 og H292-celler etter TUNEL assay (til venstre) og kvantitativ analyse av apoptose (høyre). (D) Påvisning av økt andel av det totale antall celler av Cell-IQ og CCK-8. Totale celletall av A549 og H292 ble målt 72 timer etter dyrket med forskjellige stoffer. (E) BrdU-inkorporering i A549 og H292-celler. BrdU ble inkubert i 24 timer, og deretter ble cellene fiksert og detektert med BrdU. For kvantitet analyse av BrdU innlemmelse, ble relative OD verdier analysert i forhold til kjøretøygruppe. (F) Western blot-analyse viste PCNA proteinnivåer i A549 og H292-celler og kvantitative data for PCNA proteinnivåer. Data representerer hjelp av seks bestemmelser ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). *
p
0,05 og **
p
. 0,01 analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA)
inkubasjon av cellelinjer A549 og H292 celler med DDP for 2 dager etterfulgt av en rusfri medium for 3 dager. Avhengig DDP konsentrasjoner, spredning arrest og /eller celledød oppstått som et resultat. Vi valgte seks forskjellige konsentrasjons gradienter av DDP (0 M, 5 × 10
-7 M, 1 × 10
-6 M, 2 × 10
-6 M, 4 × 10
-6 M og 8 x 10
-6 M) og undersøkt med CCK-8-analyse. Ved konsentrasjoner mindre enn 2 × 10
-6 M, DDP forsinket cellulær proliferasjon, og ved 2 × 10
-6 M, forble celle nummer konstant under hele perioden av inkubasjon tyder irreversibel vekst arrest, noe som betydde senescence . I motsetning til dette høyere konsentrasjoner DDP-indusert celledød (figur 1B). For å bekrefte denne effekten, valgte vi også over seks forskjellige konsentrasjonsgradient av DDP og evaluert i A549 og H292 celler med TUNEL analysen. Behandling med DDP hvilke konsentrasjoner mindre enn eller lik 2 x 10
-6 M viste ingen signifikant endring, mens DDP hvilke konsentrasjoner som er større enn 2 x 10
-6 M økte prosentandelen av TUNEL-positive celler signifikant (figur 1C). Derfor brukte vi 2 x 10
-6 M DDP, hvor konsentrasjonen kan indusere cellulær senescens stedet for apoptose i det følgende eksperiment.
Deretter bedømmes vi effektene av DEX co-behandling på prosentandelen av totalt celle tall med Cell IQ i A549 og H292 cellelinjer. Den prosentandel av totalt celleantall betydelig redusert etter stimuleringen av DDP i forhold til kjøretøyet. DEX co-behandlingen økte det totale celle nummer med 17,21%, 15,51% (0,1 mikrometer DEX, A549, H292, henholdsvis), 95,06%, 118,43% (1 mikrometer DEX, A549, H292, henholdsvis), 131,18%, 150,11% ( 10 pM DEX, A549, H292, henholdsvis) i nærvær av DDP (figur 1D). Siden konsentrasjonen av 1 pM DEX eller høyere i betydelig grad kan øke den totale cellenummer, anvendte vi en pM DEX i det følgende eksperiment. Forbehandling med glukokortikoid reseptor (GR) antagonist, RU486, kan blokkere påvirkning av DEX, noe som tyder på at DEX redusert DDP følsomheten ved å handle gjennom GR. Dessuten også utførte vi CCK-8-analysen og bekreftet DEX comedication rolle (figur 1D). Effektiviteten av forskjellige doser av DDP (1 uM, 2 uM, uM 4, 8 uM, 16 uM, 32 uM) i nærvær eller fravær av DEX ble også påvist ved CCK-8. DEX samtidig medisinering indikert beskyttende effekt på ulike doser av DDP (2 mikrometer, 4 mikrometer, 8 mm) og ineffektivitet når dosene overskredet 16 mikrometer (Figur 1D).
For å komplettere de ovennevnte funn, vi neste undersøkt celle spredning med BrdU, en tymidinanalogen som kan innlemme i den nysyntetiserte DNA av S-fase. DDP redusert normal spredning av A549 og H292-celler, mens DEX dempes denne nedgangen (figur 1E). Videre har vi også oppdaget et uttrykk for voksende cell nuclear antigen (PCNA), et protein som er involvert i DNA replikasjon og DNA-reparasjon, gjennom Western-blot analyse. DDP også redusert protein uttrykk for PCNA, og kombinert DEX behandling kan redusere denne nedgangen (figur 1F). Disse data tyder på at DEX co-behandling økning celleviabilitet i DDP behandlet NSCLC cellelinjer.
DEX Beskyttet Svulster ved Hemming av TIS
Siden 10 mm DEX alene førte til en svak hemming av celle vekst i A549 og H292-celler (figur 1D), den økte overlevelse celle nummer når cellene ble ko-behandlet med DEX og DDP var ikke på grunn av akselerasjon av cellevekst, men mest sannsynlig skyldtes å påvirke TIS. For å teste denne sannsynlighet, undersøkte vi ytterligere endring i celle senescens av A549 og H292-celler med DDP eller DEX alene eller med en kombinasjon av DEX og DDP i 48 timer. Og vi identifisert senescent celler på grunnlag av flere egenskaper. Først må vi bemerket at DDP forårsaket bemerkelsesverdige og karakteristiske morfologiske endringer, blant annet forstørret cellestørrelse og en flat form i A549 celler og H292-celler, og DEX co-behandling svekket disse morfologiske endringer (figur 2A). DEX co-behandling også påvirke veksten av A549 og H292 cellelinjer (figur 2B).
(A) Cellene ble dyrket i stoff-fri medium, fast og beiset. Celler ble visualisert under × 200 forstørrelse ved hjelp av fasekontrastmikroskop. (B) Celle proliferasjonsanalyse ble utført etter medikament vask, og cellene ble tellet i 5 dager. (C) SA-β-gal-aktivitet ble analysert ved hjelp av mikroskopi på dag 3 etter medikament vask (til venstre). Prosentandelen av SA-β-gal-positive celler ble presentert i histogrammet (høyre). (D) Representative bilder for SAHF dannelse i A549 og H292-celler på dag 3 etter narkotika vask. SAHF Dannelse ble kvantifisert ved å telle 200 celler fra 10 tilfeldige områder, og resultatene er vist i den høyre histogram. (E) Proteiner av A549 og H292-celler ble inkubert med antistoffer som er spesifikke for trimetylert lysiner H3K9 og H3K27 og analysert ved western bolt. Ekspresjon av GAPDH ble tatt som en intern kontroll lasting. Data representerer hjelp av seks bestemmelser ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). *
p
0,05 og **
p
. 0,01 analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA)
Neste, vi har oppdaget en allment akseptert markør, SA-β-gal aktivitet, som flekker på perinukleær rommet blå. DDP induserte signifikant økt SA-β-gal-aktivitet, og interessant, redusert DEX ko-behandling SA-β-gal aktivitet sammenlignet med den til DDP behandling alene (figur 2C). Videre har vi også observert åpenbart senescence-forbundet heterochromatin foci (SAHF) formasjon, som antas å være en senescence atomkjerner biomarkør, i DDP behandlet A549 og H292-celler. Prosentandelen av SAHF-positive celler ble signifikant øket med DDP behandling. DEX samtidig behandling kan redusere prosentandelen av SAHF-positive celler, sammenlignet med den til DDP behandling alene (figur 2D). Den sammensatte foci av SAHF inneholder denaturert og deacetylert histoner og andre tilknyttede proteiner. Mye testet markører i denne kategorien omfatter metylering av histoner tre på lysines 9 og 27 og fosforylering av H2AX histone familie, medlem X (γ-H2AX), som alle colocalize i SAHF [19], [26]. Vi oppdaget uttrykk for trime H3K9 og trime H3K27 og resultatene viste den samme tendensen i SAHF (figur 2E).
DDP-indusert DNA Damage ble hemmet i nærvær av DEX
Fordi DEX påvirkninger terapi-indusert og replicative senescence, og DNA-skade respons signalering spiller en sentral rolle i begge, neste undersøkte vi om DEX modulerer DNA skade sjekkpunkt. Vi overvåkes terapi-indusert DNA skade ved å undersøke to brukte markører for DNA-skade, γH2AX og 53BP1. DDP behandlede celler, som forventet, hadde en økning i DNA-skade enn kontrollcellene, og DEX samtidig behandling med DDP dempet graden av DNA-skade, som bedømt ved enten γH2AX eller 53BP1 (figur 3A, 3B og 3C).
(A) Cellene ble fiksert og farget for γH2AX foci (grønn) 48 timer etter narkotika vask. DAPI farging ble utført for å visualisere kjerner (blå). Andel γH2AX-positive celler er presentert i histogrammet (til høyre). (B) Cellene ble fiksert og farget for 53BP1 foci (grønn) 48 timer etter legemiddel vask. DAPI farging ble utført for å visualisere kjerner (blå). Andel 53BP1-positive celler er presentert i histogrammet (til høyre). (C) Etter DDP behandling i 48 timer i nærvær eller fravær av DEX ble cellene vasket og dyrket i ytterligere 48 timer. γH2AX og 53BP1 proteinnivå ble undersøkt med Western blot analyse. Ekspresjon av GAPDH ble tatt som en intern kontroll lasting. (D) cellesyklus-analyse ble utført ved 48 timer etter medikament vask. Prosentandelene av G1, S og G2 er demonstrert som vist. Histogrammet viser de relative endringene i G1 fasen sammenlignet med S-fasen. (E) Uttrykk for p21, p27, cyclin D1, CDK2 og cyclin A proteinnivå ble undersøkt med Western blot analyse. Ekspresjon av GAPDH ble tatt som en intern kontroll lasting. Data representerer hjelp av seks bestemmelser ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). *
p
0,05 og **
p
. 0,01 analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA)
senescent celler aldri oppgi cellesyklus og ser ut til å minske i DNA-syntese, er veksthemming oppnådd og opprettholdt i enten G1 eller G2 /M-fasen av cellesyklusen, delvis av den økte ekspresjon av spesifikke cyklin-avhengige kinase inhibitorer (CDKIs). Vi utførte FACS-analyse og funnet DDP terapi-indusert cellesyklus-stans ved G1 fase, fulgt av reduksjonen i prosenter av S-fasen, og DEX reduserte graden av disse endringene (figur 3D). Påvisning av senescence-forbundet cellesyklusregulerende proteiner oppdaget up-regelverket i p21 og p27, og ned-regler i cyclin D1 og CDK2 i DDP-behandlede celler, og tilsvarende svekket trender i DEX co-behandlede celler (Figur 3E). Disse resultatene støtter antakelsen om DEX innflytelse over DNA-skader sjekkpunkt. Disse resultatene er i samsvar med DEX påvirker senescence ved å påvirke aktiveringen av DNA-skade sjekkpunkt.
DEX Co-behandling Redusert DDP følsomhet i en p53-avhengig måte
p53 veien er viktig for å etablere og opprettholde den begynnende alderdom vekststans forårsaket av cytotoksiske stress. Vi har derfor bedt om DEX co-behandling påvirket kjemoterapi følsomhet av p53 veien. Etter DDP behandling, p53 protein gradvis akkumulert, og effekten var påfallende svekket i nærvær av DEX. Den samme trenden ble også påvist om protein uttrykk for p21
CIP1, et veletablert transkripsjonen målet og nedstrøms effektor av p53 med funksjoner i cellesyklus arrest, senescence induksjon og apoptose (figur 4A). Sterk induksjon av p21 var forventet å inhibere aktiviteten av G1 cyclin /CDK-komplekser for å resultere i hypofosforylering av retinoblastom protein (pRb) og induksjon svikt i S-fasen cykliner (figur 4A). Tilsvarende p53 mRNA nivået ble også øket etter DDP behandling, og DEX samtidig behandling svekkede denne økningen (figur 4B). Videre har vi også brukt luciferase reporter metoder for å detektere p53 promoter-aktivitet, og analysen viste DEX samtidig behandling kan også svekke p53 promoter-aktivitet sammenlignet med den til DDP behandlede gruppen (figur 4C). Disse endringene bekreftes G1 fase oppbevaring observert i DNA-histogram og samsvarende med den irreversible G1 arrest observert i kjemoterapi-indusert alderdom. Således forskjellige biologiske utfall av DDP behandling i fravær eller nærvær av DEX oppsto fra differensial regulering av p53 og dets nedstrøms mål P21.
(A) p53, p21 og pRb i lysater fremstilt av A549 og H292-celler ble bestemt ved Western-blot, ble tilsvarende protein lasting mellom banene bekreftet ved Western-analyse av GAPDH nivåer. (B) Endring av mRNA ekspresjonsnivåer av p53 etter DDP behandling i nærvær eller fravær av DEX ble påvist ved kvantitativ sanntid PCR. Brett endringer ble beregnet ut fra p-aktin normalis Ct verdier. (C) Cellene ble transient transfektert med p53 promoter-luciferase reporter plasmid. Luciferaseaktiviteten i hele cellelysater ble bestemt 24 timer etter transfeksjon. Data er middel (± standardfeil av middelverdien) av forholdet ildflue luciferase aktivitet over Renilla luciferaseaktivitet og normalisert til forholdet mellom kjøretøygruppe. (D) A549 og H292-celler transfektert med p53-ekspresjonsvektor (pcDNA3.1- /p53) ble behandlet med DDP i nærvær eller fravær av DEX. SA-β-gal-aktivitet ble analysert ved hjelp av mikroskopi på dag 3 etter medikament vask. Prosent av SA-β-gal celler ble presentert i histogrammet. (E) H1299 (p53 mangelfull type) celler ble anvendt for å detektere hvorvidt DDP ufølsomhet forekom hos p53-avhengig måte av CCK-8-analyse ved å bruke forskjellige doser av DDP (0 um, 1 uM, 2 uM, 4 uM, 8 uM, 16 uM , 32 mikrometer, 64 mikrometer, 128 mm). P53 statusene ble bekreftet ved å undersøke p21
CIP1 og hdm2 uttrykk. (F) SA-β-Gal-aktivitet ble påvist i H1299 celler behandlet med DDP i nærvær eller fravær av DEX. (G) Effekten av sirnas utformet mot p53 ble målt ved western-blot i A549-celler. SA-β-Gal-aktivitet ble påvist og analysert. Data representerer hjelp av seks bestemmelser ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). *
p
0,05 og **
p
0,01 analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA)
For ytterligere å bekrefte effekten. av p53 /p21
CIP1 vei, A549 og H292-celler ble behandlet med pcDNA3.1- /p53. Etter 2 dager med DDP behandling med eller uten pcDNA3.1- /p53, undersøkte vi at overekspresjon av p53 kan hindre reduksjon av SA-β-Gal-aktivitet i DEX ko-behandlingsgruppen (figur 4D). Videre, for å analysere om DEX-forbundet DDP ufølsomhet avhang co-behandling reduserer DDP følsomhet er p53 avhengige, brukte vi to cellelinjer forskjellig i p53-funksjon, A549 (p53 villtype) og H1299 (p53 mangelfull type). P53-status for A549 og H1299-celler ble bekreftet ved å undersøke p21
CIP1 og hdm2 uttrykk, og CCK-8-analysen viste at det var ingen signifikant forskjell fra DDP IC50 mellom DDP alene og DEX samtidig medisinering gruppe på H1299-celler (figur 4E). Vi har også funnet i H1299 celler, gjorde DEX ikke påvirke SA-β-Gal aktivitet (figur 4F). A549-celler ble transfektert med p53 siRNA og kontrollere siRNA. Western blot for p53 bekreftet undertrykkelse av p53 siRNA. Som ventet kunne p53 siRNA ytterligere redusere SA-β-Gal-aktivitet (figur 4G). Til sammen tyder resultatene på at p53 kan aktiveres ved cytotoksisk stress, og DEX co-behandling innflytelse TIS er p53-avhengig.
NF-kB var en viktig formidler av DEX rolle i Kjemoterapi ufølsomhet
For ytterligere å karakterisere om NF-kB signale fremmer eller opphever senescence, bestemt vi NF-kB aktivitet hos NSCLC celler etter DDP behandling med eller uten DEX. Behandling med DDP aktivert potent NF-kB promoteraktivitet i A549, H292 og H1299-celler, og behandling med DEX redusert NF-kB-promoter-aktivitet bare i A549 og H292-celler (Figur 5A). Neste, vi har oppdaget utgitt NF-kB molekyler translocate til kjernen følgende DDP behandling. DDP alene gruppen viste kjernefysisk translokasjon av NF-kB p65 og DEX co-behandling reduserte nivået av kjernefysisk translokasjon (figur 5B). Den nukleære translokasjon av p65 ble ytterligere bekreftet ved Western-blot. DDP behandling betydelig fremmet den nukleære lokalisering av p65, mens den totale mengden av p65 i cytoplasma ble noe endret basert på forholdet av p65 /GAPDH.
