Abstract
Nuclear receptor co-repressor (N-CoR) spiller viktig rolle i transkripsjonen kontroll mediert av flere tumor suppressor proteiner. Nylig rapporterte vi en rolle misfoldede-konformasjon avhengige tap (MCDL) N-CoR i aktivering av onkogene overlevelse veien i akutt promyelocytic leukemi (APL). Siden N-Cor spiller viktig rolle i cellulær homeostase i forskjellige vev, og derfor hypotese vi at en APL som MCDL av N-Cor kan også være involvert i andre malignitet. Faktisk vår første screening av N-CoR status i ulike leukemi og solid tumorceller avdekket en APL som MCDL av N-CoR i grunnskolen og videregående tumor celler avledet fra ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Den NSCLC cellespesifikke N-CoR tap kan bli blokkert av Kaletra, en klinisk karakter proteasehemmer og av genistein, en hemmer av N-CoR misfolding tidligere preget av oss. Den misfolded N-Cor presentert i NSCLC-celler som var knyttet til forsterkning av ER stress og ble utsatt for nedbrytning ved NSCLC cellespesifikk avvik proteaseaktivitet. I NSCLC celler, ble misfolded N-CoR funnet å være assosiert med Hsc70, en molekylær anstand involvert i anstand mediert autofagi (CMA). Genetisk og kjemisk hemming av Lamp2A, en hastighetsbegrensende faktor på CMA, betydelig blokkert tap av N-CoR hos NSCLC-celler, noe som tyder på en avgjørende rolle CMA i N-CoR degradering. Disse funnene identifisere en viktig rolle for CMA-indusert nedbrytning av misfolded N-Cor i nøytraliseringen av ER stress og tyder på en mulig rolle av misfolded N-kjerneprotein i aktivering av onkogeniske overlevelsesreaksjonsveien i NSCLC-celler.
Citation: Ali AB, Nin DS, Tam J, Khan M (2011) rolle anstand Mediated Autophagy (CMA) i nedbrytning av misfoldede N-CoR Protein i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) Cells. PLoS ONE 6 (9): e25268. doi: 10,1371 /journal.pone.0025268
Redaktør: Michael Sherman, Boston University Medical School, USA
mottatt: Mai 25, 2011; Godkjent: 30 august 2011; Publisert: 23.09.2011
Copyright: © 2011 Ali et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd SSCC-04-06 og NMRC /1213/2009 til MK fra Singapore Stem Cell Consortium og National Medical Research Council of Singapore. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Transkripsjon faktorer og deres beslektede co-faktorer er de viktigste regulatorer av utvikling av epitelceller og er blant de hyppigste målene for onkogene fornærmelse i ulike menneskelige maligniteter inkludert Lungekreft [1] – [4]. Transkripsjonen kontroll formidles av nukleær reseptor ko-repressor (N-COR) spiller viktig rolle i veksten undertrykkende funksjon av flere tumor suppressor-proteiner [5], [6]. Deregulering av N-CoR mediert transkripsjonen kontroll på grunn av en misfolded konformasjon avhengig tap (MCDL) N-CoR har vært innblandet i patogenesen av akutt promyelocytic leukemi (APL) [7], [8]. Interessant nok, noen av transkripsjonsfaktorer og co-faktorer som opprinnelig ble identifisert som regulatorer av normal hematopoese ble også funnet å være involvert i regulering av normal vekst og utvikling av lunge epitelceller [2] – [4]. Disse funnene antydet at betydelig overlapping kan også finnes i mekanismen bak de hematologiske maligniteter og lungekreft. Lungekreft er den ledende årsak til kreft relatert dødelighet og sykelighet i menneskets verden over. Med en 5-års overlevelse på bare 15%, er det ansett som en av de mest dødelige kreftformer i menneske. Basert på kjente Histo-patologiske kriterier er lungekreft grovt kategoriseres i to viktige undergrupper: ikke-små-celle lungekreft [9], [10] og små-celle lungekreft (SCLC) [11]. NSCLC, som består av 80% av alle lungekrefttilfellene i menneske, er videre inndelt i adenokarsinomer, plateepitelkarsinom, adenosquamous karsinomer, og store-cellekreft [12]. Til tross for at den ledende årsaken til menneskets dødelighet og mobilitet, er svært lite kjent om mekanismen bak ondartet vekst og transformasjon av celler som danner hoveddelen av tumormasse i lungekreft. Dette er delvis på grunn av mangel på klar forståelse av onkogene overlevelse mekanisme som opprettholder veksten av ondartede celler i næringsfattig og stressende mikromiljøet allment presenteres innenfor den faste massen av Lungekreft vev.
Nuclear receptor co-repressor (N-COR) er en vital komponent i et multi-proteinkompleks repressor essensielt for funksjonen av mange transkripsjonsfaktorer og tumor suppressor-proteiner [13] – [16]. Siden transkripsjonen kontroll formidles av faktorer som N-Cor er antatt å være involvert i regulering av normal vekst og utvikling av celler i forskjellige vev subtyper derfor hypotesen om vi at en APL som MCDL av N-Cor kan også være knyttet til det onkogene veksten i andre menneskelige svulster. For å teste denne hypotese, analyserte vi N-Cor status på tumorceller avledet fra større human leukemi og faste tumorer og det observert en selektiv misfolded konformasjon avhengige tap av N-Cor i flere tumorcellelinjer og primære humane cancer vev avledet fra NSCLC. I NSCLC celler, ble misfolded N-CoR funnet å være assosiert med Hsc70, en molekylær anstand involvert i anstand mediert autofagi (CMA). Genetisk og kjemisk hemming av CMA førte til N-CoR stabilisering i NSCLC celler, noe som tyder på en avgjørende rolle CMA i N-CoR tap. Disse funnene illustrerer en mulig rolle autophagic nedbrytning av misfolded N-CoR i nøytralisering av ER stress samt i overlevelse og vekst av NSCLC celler.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
Alle de lungekreftcellelinjer brukt i denne studien ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og ble opprettholdt i medium anbefalt av ATCC. Genistein, Chloroquine og Nikotin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA) mens Kaletra var fra Abbott Laboratories (IL, USA). N-CoR (C-20), PDI og Hsc-70 antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mot Lamp-2A (Abcam Inc, MA, USA) og β-aktin (Sigma, St. Louis, MO, USA) ble kjøpt fra respektive kilder. Rekombinant flagg-merket N-Cor ble fremstilt fra 293T celler [17] transfektert med N-CoR uttrykk plasmid (knyttet til to tandem flagg sekvens) ved hjelp av Fugene 6 (Roche, Basel, Sveits). N-CoR og kontroll siRNA duplex beskrevet tidligere [18], [19] ble syntetisert med mindre endring i N-CoR sekvens (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland), og ble transfektert hjelp oligofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ).
primær humane lungetumorprøver og vev arrays
Ten histologisk bekreftet primære humane NSCLC prøver ble innhentet fra vevet oppbevaringssted for National University Hospital-National University of Singapore (NUH-NUS) med godkjenning av National University of Singapore-Institutional Review Board (NUS-IRB). Disse prøvene ble snap-frosset innen 40 minutter (i gjennomsnitt) kirurgisk fjerning og lagret ved -80 ° C. Menneskelig lungekreft vevet rekke BC04012 ble kjøpt fra Biomaks (US Biomaks Inc, Maryland, USA) og farget med N-CoR (C-20) antistoff ved hjelp av ABC farging system (Santa Cruz, CA, USA) i henhold til produsentens retningslinjer.
Semi-kvantitativ og real time PCR-analyse
Total RNA ble isolert med RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Fra hver prøve ble 2 ug av RNA omdannet til cDNA med oligo (dT)
18-primet revers transkripsjon ved hjelp av Superscript II RT First-Strand sett (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som beskrevet av fabrikanten. CDNA ble utsatt for semi-kvantitativ PCR-analyse ved hjelp Accuprime Taq polymerase system (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens anbefalinger. The Real Time PCR-analyse ble utført ved hjelp av Taqman® Gene Expression analysesystem (Applied Biosystems, CA, USA) og C
t-verdiene ble registrert ved hjelp av ABI Prism 7300 Real Time PCR system (Applied Biosystems, CA, USA) .
Analyse av sanntids-PCR-data
data ble analysert ved den komparative C
t metode hvor cellelinjen som SAEC ble anvendt som referanseprøve og den HPRT-genet ble anvendt som den endogene genet kontroll. Data ble representert i et stolpediagram som plottet på log skala med en base av 10. N-Cor ekspresjonsnivå i forskjellige cellelinjer ble beregnet i forhold til den N-Cor nivå i SAEC [20]-celler som ble satt til 0. data representert er gjennomsnittlig innhentet fra 3 uavhengige eksperimenter.
In-vitro N-CoR cleavage analysen
Crude cellulære ekstrakter som inneholder aktive proteaser ble oppnådd ved å inkubere, lungekreftceller eller cryo bevarte menneskelige primære lunge cancervev i RSB-buffer [10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl
2, 0,1% NP-40] ved 4 ° C i 10 minutter og kjerner ble deretter fjernet ved sentrifugering. Supernatantene ble høstet og proteininnholdet ble deretter bestemt. N-CoR underlaget var utarbeidet av transfeksjon av 293T celler med flagg-merket N-CoR plasmid. Optimalisert spaltning Assayet ble utført i 300 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0), ved 37 ° C i forskjellige tidsrom. Reaksjonen ble avsluttet ved oppvarming ved 50 ° C i SDS-prøvebuffer, og proteiner ble løst med SDS-PAGE og overført til PVDF-membran for western blotting.
Immunoutfelling
to fremgangsmåter ble utformet for å oppdage fysisk interaksjon mellom N-Cor og Hsc70. Ved en metode ble protease utarmet HLPC fraksjonerer av H2170-celler inkubert med flag-tagget N-Cor i IP-buffer [40 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,75 mM MgCl
2, 0,25% NP-40] i 5 minutter med rotasjon ved 4 ° C. Anti-flag M2 affinitets gel-perler (Sigma) ble tilsatt og ytterligere inkubert i 2 timer med rotasjon ved 4 ° C. I andre tilnærming, ble kjøretøy eller Kaletra-behandlede H2170-celler (ved 5 uM i 96 timer) sonikert i lyseringsbuffer [150 mM NaCl, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM NaF, 1 mM Na
2VO
4, 20 mM β-glycerolphosphate, 1,5 mg /ml IAA, protease-inhibitor cocktail] i 10 s. Lysatene ble fjernet ved sentrifugering og deretter inkubert med Hsc70 eller kontrollantistoffer i 2,5 timer med rotasjon ved 4 ° C. Protein G perler ble deretter tilsatt etterfulgt av 1,5 timer rotasjon ved 4 ° C. Immunutfelninger ble løst på SDS-PAGE gel og N-Cor og Hsc70 ble oppdaget av western blotting.
Immunoflorescence farging
Celler ble smurt på glassplater ved hjelp cytospin sentrifugering, festes med 4% paraformaldehyde og permeabilisert ved bruk av 0,2% Triton X-100 i PBS ved 4 ° C. De faste celler ble deretter farget med relevante primære antistoffer etterfulgt av FITC- eller rhodaminkonjugert sekundære antistoffer (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). DNA ble farget med DAPI (Invitrogen-Molecular Probes) og fluorescens-signaler ble tatt ved hjelp av konfokal mikroskopi.
oppløselighet Protein assay
N-Cor løselighet assay ble utført som beskrevet tidligere med en viss modifisering [8 ]. I korthet ble cellene sonikert kort i cellelyseringsbuffer [50 mM Tris (pH 8,0), 5 mM MgCl
2, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, og protease-inhibitor cocktail] og holdt på is i 30 minutter. De oppløselige og uoppløselige fraksjonene ble separert ved sentrifugering ved 15.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Den uoppløselige fraksjon ble behandlet med DNAse I i 30 minutter ved 37 ° C. De oppløselige og uoppløselige fraksjoner ble deretter løst på SDS-PAGE og farget med anti-N-Cor (C-20).
lysosomal opptaksanalyse
lysosomer ble isolert fra H2170 celler ved hjelp lysosomet Enrichment Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Den lysosomal opptaksanalyse ved hjelp av flagg-merket N-CoR som substrat, ble utført hovedsakelig som beskrevet andre steder [21].
Resultater
Post-transcriptional tap av N-CoR i tumorceller avledet fra NSCLC
Analyse av N-Cor status i forskjellige lungekreftceller viste en tilsynelatende tap av N-Cor på proteinnivå i flere tumorcellelinjer avledet fra NSCLC, men ikke i DMS-79; en cellelinje avledet fra SCLC (Fig. 1A, Støtte Informasjon S1). Et lignende mønster av N-Cor tap ble også observert i normale liten luftveis-epitelceller (SAEC) etter behandling med nikotin, kreftfremkallende middel allment knyttet til Lungekreft (Fig. 1B). Den N-Cor tap observert i NSCLC-celler som var mest sannsynlig en post-transkripsjonell hendelse ettersom nivået av N-Cor transkript, som bestemt ved sanntids-PCR, var ikke signifikant nedregulert i forhold til nivået i DMS-79 eller SAEC cellene (fig. 1C). Identisk mønster av N-CoR tap på proteinnivå ble også observert i ni av ti histologisk bekreftet humane primære NSCLC celler, noe som tyder på at N-CoR tap var ikke et eksklusivt arrangement begrenset til NSCLC cellelinjer (Fig. 1D, saksdokumenter S1) . N-CoR tap observert i H2170 celler kan bli blokkert av Kaletra, en klinisk grad HIV-proteasehemmer og en dokumentert hemmer av vekst av NSCLC-celler (fig. 1E) [22]. N-CoR tap ble også blokkert av genistein (Fig. 1 F), en hemmer av N-CoR misfolding tidligere preget av oss [23]. Disse funnene antydet at tapet av misfolded N-CoR kan årsaks knyttet til vekst og overlevelse av NSCLC celler
A B, Level og integritet av full lengde N-kjerneprotein i forskjellige lungekreftceller, ble bestemt ved Western blotting-analyse. Nivå av β-actin ble bestemt som eksperimentell kontroll. DMS-79 er avledet fra SCLC mens restene av cellene er avledet fra NSCLC. B, Level av full lengde N-kjerneprotein i SAEC behandlet med nikotin i 48 timer på en doseavhengig måte, ble bestemt. C, Level of N-Cor transkript i cellelinjer benyttet i figur 1 A B ble kvantifisert ved real time PCR. Identiteten av celler som brukes i figur 1A C er presentert i saksdokumenter S1. D, Level av full lengde N-CoR protein i ti histologisk bekreftet humane primære NSCLC-celler ble bestemt i western blotting analysen med N-CoR antistoff. Identiteten til humane prøver blir presentert i saksdokumenter S1. E og F, nivå av intakt N-CoR protein i H2170 celler behandlet med Kaletra (E) eller genistein (F) ble bestemt, ble hentet i western blotting-analyse.
Stabilisering av N-CoR av genistein antydet at NSCLC cellespesifikke N-CoR tap ble mest sannsynlig utløst av sin misfolding observert tidligere i APL. For å bekrefte dette, ble konformasjon av N-CoR protein stabilisert av Kaletra eller genistein bestemt. I native konformasjon, N-Cor begrenset til kjernen og forblir løselig i buffer inneholdende organisk detergent; mens i misfolded konformasjon, blir N-CoR uløselig og er translocated til endoplasmatiske retikulum [7], [8]. Vi brukte disse kriteriene for å avgjøre om N-CoR som ble utsatt for nedbrytning i NSCLC celler ble misfoldede. En vesentlig del av N-Cor stabilisert ved Kaletra ble funnet i den uløselige fraksjon av H2170-celler, noe som antyder at H2170 celler næret en misfolded N-kjerneprotein (fig. 2A). På den annen side, N-Cor stabilisert av genistein var stort sett vaskemiddel løselige, noe som antyder at genistein kan redde det native N-Cor konformasjon (figur 2B.). En hovedandel av N-Cor i normale liten luftveis-epitelceller (SAEC) ble funnet i løselig fraksjon, mens i SCLC-celler avledet DSM-79, N-Cor var stort sett uoppløselig (Fig. 2C). I samsvar med funn av løselighet analysen, vises N-CoR en overveiende cytosolic distribusjon i flere NSCLC avledet celler (Fig. 2D, rødt signal) og histologisk bekreftet menneskelige primære NSCLC vevssnitt (Fig. 2E, paneler 2-6). I motsetning til dette ble N-Cor hovedsakelig lokalisert i kjernen i humane normale lunge epitelceller (fig. 2E, panel 1) og i SAEC celler (fig. 2F, venstre panel). Atom N-CoR funnet i SAEC celler ble translocated til ER etter nikotin behandling, noe som tyder på at nikotin kan utløse N-CoR misfolding (Fig. 2F, høyre panel). Samlet gir de funn antydet at N-CoR som ble utsatt for nedbrytning i NSCLC celler var mest sannsynlig en misfolded protein
A, B C, Løselighet (S) /uløselighet (I) N-Cor eller β-aktin i Kaletra (A) eller genistein (B) behandlede H2170-celler, så vel som i DMS-79 eller SAEC-celler (C), ble bestemt ved hjelp proteinløselighet assay. D, subcellulære fordeling av N-CoR (rødt signal) i NSCLC (H2170, H1299, H358, H596, H650, H1869 og H1666) og SCLC (DMS-79) celler ble bestemt ved immunoflorescence analyse utført med N-CoR antistoff. DNA (blå signal) ble farget med DAPI. E, subcellulær fordeling av N-Cor i histologisk bekreftet humane primære NSCLC vevssnitt (panel 2-6) og avsnitt normalt humant lungevev (panel 1) ble bestemt ved immunhistokjemisk (IHC) assay utført med N-Cor antistoff. Den brunlig misfarging i cytosol fant frem ved svart pil representerer N-CoR signal (paneler 2-6). N-CoR flekker i lungevev delen normal er synlig som svarte prikker overlappende kjernen (panel 1). Det andre panel viser et tverrsnitt som inneholder både kreftvev (venstre halvdel) og normalt lungevev (høyre halvdel) ved siden av hverandre. F, subcellulære fordeling av N-Cor og PDI i SAEC celler behandlet med kjøretøy eller nikotin i 48 timer ble bestemt av konfokalmikroskopi.
NSCLC cellespesifikke N-CoR tap er knyttet til endoplasmatisk retikulum (ER ) stresset
i APL, N-CoR tap var et resultat av cytoprotective UPR som ble formidlet av APL celle spesifikk avvik protease aktivitet som til slutt beskyttet APL celler fra eR stress-indusert apoptose [7]. For å undersøke om N-CoR tap hos NSCLC-celler ble også tilrettelagt av lignende avvik protease aktivitet, ble en optimalisert N-CoR cleavage analyse utført. I denne analysen ble flag-tagget N-Cor ectopically uttrykt i 293T-celler inkubert med ekstrakt av H2170-celler, en NSCLC avledet cellelinje som oppviste N-Cor tap, eller DMS-79-celler, en SCLC avledet cellelinje som ikke gjorde oppvise en hvilken som helst N-Cor tap, og nivået av N-Cor spaltet i løpet av denne inkubasjonen ble bestemt ved western blotting-analyse. Flag-merket N-CoR inkuberes med ekstrakt av H2170 celler ble fordøyd i en tidsavhengig måte, og en spaltet N-CoR fragment på 100 kDa ble generert (Fig. 3A, baner 6-8), mens N-Cor-Flag inkuberes med ekstrakt av DMS-79-celler ble ikke spaltet (fig. 3A, kolonnene 2-4). Interessant, N-Cor spalte aktivitet presentert i H2170 cellene ble fullstendig deaktivert ved å koke, noe som tyder på at aktiviteten kan være en varmelabil protease (fig. 3A, spor 9). Som observert med NSCLC avledet H2170 celler, ekstrakter av to humane primære NSCLC celler, der ingen full lengde N-Cor ble oppdaget, inneholdt aktivitet som helt fordøyd flagget-merket N-CoR protein (Fig. 3B). Identisk varmelabilt N-CoR spalte aktivitet ble også funnet i tre andre representative NSCLC celler HLF-en, H23 og H1650 (Fig. 3C).
A, H2170 celler havn N-CoR spalte aktivitet. Behandling av Flag-merket N-CoR inkubert med ekstrakter av DMS-79 (baner 2-5) eller H2170 (baner 6-9) celler for varigheten som nevnt ble bestemt av western blotting-analyse utført med flagg antistoff. Ekstraktet lagt i baner som er merket som «kokt» ble oppvarmet ved 100 ° C i 10 minutter før inkuberingen. Like stort volum av buffer som mangler celleekstrakt ble anvendt i felt som er merket som «buffer». Pilen markerer posisjonen av det spaltede 100 kDa N-Cor fragment. B, Processing Flag-merket N-CoR inkubert med ekstrakter av tre første humane primære NSCLC celler (Supplementary tabell 2) ble bestemt ved western blotting med flagg antistoff. C, N-CoR cleavage analysen, ved hjelp av ekstrakter av NSCLC celler HLF-en, H23 eller H1650, ble utført i det vesentlige som beskrevet i legenden om figur 2A. D, nivå av ER stress i forskjellige lungekreftceller ble analysert ved å bestemme nivåene av GRP-78 og PDI (basal og HMW: høy molekylvekt). E, N-Cor lokalisert til ER ble visualisert ved farging H2170-celler med N-Cor (rød) og PDI (grønt) antistoffer. DNA ble farget med DAPI (blå). F, Nivå PDI i H2170 eller DMS-79 celler eksponert for sladde eller N-CoR siRNA ble bestemt ved western blotting (øvre panel). Den N-Cor knock-down effektivitet i hvert delsett av celler ble bekreftet ved RT-PCR-analyse (nedre paneler). G, Nivå PDI avskrift i SAEC celler behandlet med nikotin i 48 timer ble bestemt ved RT-PCR-analyse.
Neste for å teste om NSCLC cellespesifikke N-CoR tap var knyttet til ER stress som observeres i APL, ble nivået av eR stress på tvers av NSCLC-celler sammenlignet med den i DMS-79-celler ved å måle nivåene av grp78 og PDI proteiner, to bona fide markører eR stress [24], [25]. Nivåer av GRP78 og PDI, både normal og en høy molekylvekt (HMW) variant er spesielt funnet i celler som gjennomgår ER stress, var signifikant høyere i alle NSCLC-celler som utviste N-Cor tap, mens disse to proteinene var nesten umulig å oppdage i DMS-79 -celler (fig. 3D). En mulig rolle for misfolded N-Cor i amplifikasjonen av ER stress ble foreslått av ko-lokalisering av N-Cor og PDI på H2170-celler (fig. 3E), og ved reduksjon av PDI nivå etter N-Cor knockdown (Fig . 3F). Videre behandling av SAEC celler med nikotin på konsentrasjon som utløste N-CoR tap førte til oppregulering PDI nivå, noe som tyder på at nikotin-indusert N-CoR tap kan også være knyttet til ER stress (Fig. 3G). Disse funnene kollektivt antydet en sammenheng mellom N-CoR tap og forsterkning av ER stress i NSCLC celler. Det er også foreslått at nedbrytning av misfolded N-CoR kan ha bidratt til demping av ER stress og eventuell beskyttelse av NSCLC celler fra ER stress-indusert apoptose som tidligere funnet i APL.
misfoldede N-Kor er degradert gjennom anstand mediert autofagi
for å få ytterligere innsikt i mekanismen bak tap av N-Cor og å forstå den funksjonelle konsekvensen av N-CoR tap, bestemte vi oss for å identifisere proteiner som kan ha forbindelse med misfolded N-CoR protein før sin degradering. For å oppnå dette målet, er en spesialdesignet co-immunoprecipitation analyse utført ved hjelp av protease-utarmet cytosolic ekstrakt av H2170 celler og flagg-merket N-CoR ectopically uttrykt i 293T celler. Flag-merket N-Cor inkubert med protease-utarmet cytosolisk ekstrakt av H2170-celler ble immunoutfelt med antistoff flagg og identiteten av proteiner forbundet med N-Cor ble bestemt ved massespektroskopi (MS) etter deres separasjon i SDS-PAGE. Interessant nok ut av flere proteiner co-utfelt med flagg-merket N-Cor, ble en identifisert som Hsc70 (Fig 4A.), En molekylær anstand avgjørende for trans av spesifikke CMA underlag til lysosomene [26] – [28]. For å teste den direkte sammenhengen mellom N-Cor og Hsc70, en delmengde av protease-utarmet cytosolic ekstrakt av H2170 celler ble inkubert med ekstrakt av 293T celler transfektert med flagg-merket N-CoR plasmid, og nivået av Hsc70 utfelt med N-CoR ble bestemt i western blotting analyse. Betydelig mengde Hsc70 protein (Fig. 4B, øvre panel) var co-utfelt sammen med flagg-merket N-CoR (Fig. 4B, nedre panel) fremskyndet av Flag antistoff. Sammenhengen mellom N-Cor og Hsc70 proteiner ble ytterligere bekreftet i co-immunoprecipitation analysen utført med ekstrakter av kjøretøy eller Kaletra behandlet H2170-celler (fig. 4C). Videre, i indirekte immunoflorescence analysen ble betydelig samlokalisering mellom N-Cor og Hsc70 observert ytterligere tyder deres in-vivo foreningen i H2170-celler (fig. 4D).
A, renset Kolonne cytosolic ekstrakter av H2170 celler ble inkubert med flagg-merket N-CoR ectopically uttrykt i 293T celler. N-Cor ble immunopresipitert med anti-flagg antistoff og proteiner utfelles med N-Cor ble løst i SDS-PAGE, skåret og deres identitet ble bestemt ved MS. B, Sammenhengen mellom Flag-merket N-Cor og Hsc70 ble bekreftet i co-immunoprecipitation analyse utført hovedsakelig som beskrevet i legenden om figur 4A. Etter påvisning av ko-utfelt Hsc70 med Hsc70 antistoff (øvre panel), ble membranen probet på nytt med flag-antistoff for å kvantifisere mengden av utfelte N-kjerneprotein (nedre panel). I «inngangs» baner, ble en aliquot av hel celleekstrakt lastet. C, Hsc70 ble immunopresipitert fra ekstrakter av kjøretøy eller fem mikrometer Kaletra behandlet H2170 celler og nivå av co-utfelt N-Cor ble bestemt med N-CoR antistoff (øvre panel). Membranen ble probet på nytt med Hsc70 antistoff (lavere panel). I «inngangs» baner, ble en aliquot av hel celleekstrakt lastet. D, N-CoR (rød) og Hsc70 (grønn) fordeling i H2170-celler ble bestemt gjennom immunoflorescence analyse ved hjelp av konfokal mikroskopi. Intensiteten av gule signaler betegner graden av ko-lokalisering av to proteiner. DNA ble merket med DAPI (blå).
De fleste av de kjente substrater av CMA inneholder en lysosomal rettet mot motiv biokjemisk relatert til KFERQ [21], [29]. Dette motivet består av en Q flankert på begge sider av fire aminosyrer som består av en grunnleggende, en sur, en voluminøs hydrofob, og en gjentatt grunnleggende eller voluminøs hydrofob aminosyre. En analyse av N-Cor peptidsekvens viste nærvær av en nesten identisk lysosomal målretting motiv bestående av QEIFR pentapeptid, noe som tyder på at N-Cor kan være et substrat av CMA (Fig. 5A). I CMA, Hsc70 første forbinder med sin misfolded last i cytosole og deretter Hsc70-last kompleks transporteres til lysosome [29], [30]. Når levert til lysosomale membranen ved Hsc70, blir misfoldede cargoproteiner translokert til det lysosomale hulrommet ved hjelp av Lamp2A, et hastighetsbegrensende faktor av CMA [26] – [28]. For å bevise at N-Cor ble nedbrutt gjennom Lamp2A-mediert reaksjonsvei lysosomal, ble effekten av Lamp2A ablasjon på nivået av N-kjerneprotein bestemt. N-CoR tap ble betydelig reversert (Fig. 5B, øverste panelene) etter Lamp2A ablasjon med et effektivt anti-Lamp2A siRNA (Fig. 5B, lavere paneler), noe som tyder på en viktig rolle Lamp2A i tap av N-CoR protein. Videre behandling av H2170 celler med klorokin, en kjemisk hemmer av lysosomal funksjon [31], betydelig blokkert tap av N-CoR protein (Fig. 5C).
A, inneholder N-CoR en konsensus lysosomal målretting motiv. Den lysosomal målretting motiv i N-CoR peptidsekvens er uthevet i understreket fet. B, Lamp2A ablasjon blokkert N-CoR tap i H2170 celler. N-Cor nivået i H2170 celler eksponert for anti-Lamp2A eller tak siRNA i 72 timer ble bestemt med N-Cor antistoff (øvre panel) etter å ha bekreftet Lamp2A ablasjon av RT-PCR-analyse (nedre panel). C, Kjemisk hemming av lysosomal funksjon stabilisert N-Cor. Nivå av N-CoR i H2170 celler behandlet i 72 timer med bil eller 25 mikrometer klorokin, en selektiv hemmer av lysosomal funksjon, ble bestemt med N-CoR antistoff. D, Flag-merket N-Cor ble inkubert med renset lysosomale eller ikke-lysosomale fraksjoner av H2170 (venstre) eller DMS-79 (til høyre) celler og nivået av N-Cor nedbrytning ble bestemt med flag-antistoff. Nivå av Lamp2, en lysosomal protein, ble bestemt for å demonstrere renheten av hver fraksjon. E, N-CoR tatt opp av chymostatin behandlet lysosomer ble beskyttet mot proteinase K fordøyelsen. Flag-merket N-CoR eller Hsc70 inkuberes med lysosomer isolert form H2170 celler forbehandlet med chymostatin ble utsatt for proteinase K fordøyelsen og relative nivå av beskyttede N-CoR eller Hsc70 ble bestemt med flagg eller Hsc70 antistoff. Lamp2 nivå var bestemt på å kvantifisere mengden av lysosomer i hver prøve.
For ytterligere å bevise at lysosomes var kilden til N-CoR spalte aktivitet presentert i NSCLC celler, fordøyelse av Flag-merket N-CoR inkubert med ekstrakt av lysosomale eller ikke-lysosomale fraksjoner av H2170-celler ble bestemt. Flag-merket N-CoR inkuberes med ekstrakt av lysosomal brøkdel av H2170 celler ble fordøyd helt mens Flag-merket N-CoR inkubert med ikke-lysosomale fraksjoner var ikke (Fig. 5D, venstre panel), noe som tyder på at N-CoR spalte aktivitet ble mest sannsynlig lokalisert i lysosomene. Under identiske analysen tilstand, flagg-merket N-CoR inkubert med lysosomal brøkdel av DMS-79 celler ble ikke fordøyd (Fig. 5D, panel til høyre). For å bevise at N-Cor er faktisk et substrat av CMA, ble en lysosomal opptaksanalyse, hvor CMA substrater som er tatt opp av chymostatin-behandlede lysosomer vil være beskyttet mot proteinase K-fordøyelse, utførte [21]. Flag-merket N-CoR eller Hsc70, en kjent CMA substrat, ble inkubert med proteinase K og lysosomer isolaed fra chymostatin behandlet H1270 celler, og nivået av N-Cor eller Hsc70 proteiner beskyttet mot proteinase K fordøyelsen ble bestemt av western blotting. En betydelig mengde Flag-merket N-Cor samt Hsc70 ble beskyttet mot proteinase K-fordøyelse når inkubert med chymostatin behandlet lysosomer, noe som tyder på at N-Cor, som Hsc70, kan translokert til det lysosomale hulrom (fig. 5E).
Basert på data som er beskrevet så langt i denne rapporten, er den potensielle rolle CMA-indusert nedbrytning av misfolded N-CoR protein i overlevelse og vekst av NSCLC celler illustrert gjennom en skjematisk modell (fig. 6). Denne modellen belyser hvordan N-Cor tap kan muligens bidra til overlevelse og vekst av NSCLC-celler gjennom en dobbel mekanisme. Nedbrytning av misfolded N-kjerneprotein, på den ene side kunne indirekte bidra til overlevelse av NSCLC-celler ved å nøytralisere ER stress forårsaket av intracellulær akkumulering av misfoldede N-kjerneprotein. På samme tid, kan tap av N-Cor funksjon på grunn av uriktig folding føre til aktivering av onkogene overlevelsesreaksjonsveier som normalt undertrykt av et nativt foldet og funksjonell N-kjerneprotein. Videre misfolded N-Cor og dets forringede fragmenter kan også direkte aktivere forskjellige onkogene mekanisme koblet til vekst og overlevelse av NSCLC-celler. Dermed CMA-indusert nedbrytning av misfolded N-CoR kan bidra til vekst og transformasjon av NSCLC celler gjennom en kombinasjon av tap og gevinst på funksjonsmekanismer.
Denne modellen illustrerer hvordan CMA-indusert nedbrytning av misfolded N- CoR kan bidra til overlevelse og vekst av NSCLC cellene gjennom tap av normal funksjon og gevinst på avvikende funksjon mekanisme.
Diskusjoner
N-CoR ustabilitet eller misfolding observert i NSCLC
