Abstract
Tumor vekst etter strålebehandling er en allment anerkjent årsak til terapisvikt. På denne måten, undersøkte vi tumorcellevekst etter radioterapi ved å etablere en kreftcellevekst modell
in vitro
. Vi har oppnådd denne modellen ved såing ikke-bestrålt ildflue luciferase2 og grønt fluorescerende protein fusjonsgenet (Fluc) merket levende kreft reporter celler på en mater lag av bestrålte kreftceller. Den levende tumorcellevekst ble overvåket av bioluminesens imaging. De levende rapportør Cellene vokste fortere når sådd ut på letalt bestrålte feeder-celler enn når podet på ikke-bestrålte feeder-celler eller når utsådd i fravær av feeder-celler. Vi fant at ekspresjonsnivåene av shh og Gli1 proteiner, som begge er viktige proteiner i Sonic hedgehog (SHH) signalering, ble øket etter bestråling, og at dette uttrykket er positivt korrelert med rapportørcellevekst. Dessuten ble den døende cellestimulering av levende tumorcellevekst forbedret ved tilsetning av shh signalerings agonister og inhiberes ved SHH aliserte antagonister. SHH-agonister også forbedret rapportørcellevekst i fravær av bestrålte feeder-celler, noe som tyder på denne mekanismen spiller en rolle i cellevekst som mater stimulering. Gitt disse resultatene, konkluderer vi med at SHH signaliserer aktivering spiller en viktig rolle under svulst repopulation etter strålebehandling
Citation. Ma J, Tian L, Cheng J, Chen Z, Xu B, Wang L, et al. (2013) Sonic Hedgehog signalveien Støtter kreft celle vekst under Cancer Strålebehandling. PLoS ONE 8 (6): e65032. doi: 10,1371 /journal.pone.0065032
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 16 februar 2013, Godkjent: 20 april 2013; Publisert: 10 juni 2013
Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation (81120108017, 81172030) og National Basic Research Program of China (2010CB529902) (til Q Huang og L Tian) og delvis med tilskudd fra United States National Cancer Institute (CA131408, CA136748, CA155270 ) (til CY Li). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i mange typer kreft, tumor repopulation etter strålebehandling oppstår, og utgjør en stor utfordring for klinikere. I denne prosessen, vil de få tumor celler som overlever etter radioterapi gjenvekst og erstatte tapt tumorceller. Repopulation under fraksjonert strålebehandling er anerkjent som en viktig årsak til behandlingssvikt og bevis tyder på at frekvensen av repopulation kan oppstå i en akselererende tempo i noen tilfeller [1]. Repopulation avhenger av aktivering av signalveier som stimulerer proliferasjon av tumorceller, og mange molekylære-målrettede midler har blitt utviklet som hemmer disse reaksjonsveier, slik som gefitinib som retter seg mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signal [2]. For å skape en modell for å studere tumorcelle repopulation etter strålebehandling, har mange andre prøvd å bruke såkalte «feeder-celler» som har blitt behandlet med stråling for å fremme veksten av ubehandlede tumorceller sådd i ko-kultur-eksperimenter. Selv om denne modellen ikke direkte viser repopulation av behandlede kreftceller under strålebehandling, tror vi at vekstfremmende signaler løslatt fra lethally behandlede mater celler gjenskape forholdene i et homogent behandlet svulst. Derfor vil vi bruke begrepet repopulation og døende celle stimuleres levende tumorcellevekst synonymt hele vår studie.
Til tross for vår kunnskap om at døende mateceller kan øke veksten av levende kreftceller, den mekanismen som dette skjer fortsatt i stor grad ukjent. Den soniske pinnsvin (SHH) signalveien, først identifisert i Drosophila melanogaster, er innblandet i normal organutvikling og homeostase, stamcelle vedlikehold og spredning i virveldyr og kan derfor være en kandidat for mekanismen bak overlevende tumorcellevekst [3]. Dessuten er mange kreftformer forbundet med SHH signalering, så som basalcellekreft, spiserøret og magekreft, små-celle lungekreft [4] og pankreatisk adenokarsinom [5]. SHH pathway aktivering er initiert av binding av utskilt og lipid-modifisert ligand Shh å Patched1 (Ptch1) transmembrane reseptor. Som en konsekvens, Ptch1 inhibering av glattet (Smo), en 7-pass transmembran-dekkende protein, avlastes og den SHH signalkaskade er initiert, som på sin side aktiverer Gli transkripsjonsfaktorer [6]. Det er tre Gli proteiner som koder for både aktivator og repressor funksjon. Gli1 fungerer som en transkripsjonen aktivator, er Gli2 en sammensatt av positive og negative regulatoriske domener, og Gli3 virker hovedsakelig som en transkripsjonen repressor [7]. I nærvær av Shh, er Gli1 transkripsjonelt aktivert og den fosforylerte og proteolytical behandling av Gli2 og Gli3 til sine avkortede repressor former inhiberes, og dermed fører til aktivering av bestemte SHH signalveien målgener, slik som Gli1 og Ptch1 [8].
Siden mekanismene bak svulsten akselerert repopulation under strålebehandling ikke er godt forstått, tar vi sikte på å etterforske en rolle for den veletablerte SHH sti i svulsten celleproliferasjon etter strålebehandling prosess. Det er vel kjent at stråling forårsaker apoptose som kan spille en avgjørende rolle i tumorcelle repopulation [9]. I våre tidligere studier, har vi vist at døende tumorceller bruke apoptotiske prosess for å generere kaspase 3-medierte vekststimulerende signaler for å stimulere repopulation av tumorer som gjennomgår radioterapi [10]. Videre har vi også funnet «Phoenix Rising» -veien gjennom hvilke bøddelknektene kaspaser, som Caspase 3 og 7, i apoptotiske celler fremme sårheling og regenerering av vev i flercellede organismer [11]. I spiserørskreft, ble det SHH signalveien omfattende aktivert i xenotransplantater og rest svulster etter kjemoradioterapi og blokkering SHH signale forbedret strålings cytotoksisitet [12]. Derfor kan «Phoenix Rising» sti med caspase-mediert tumorvekst stimulering og SHH signalveien begge være involvert i tumorceller repopulation etter strålebehandling.
I denne studien undersøkte vi rollene til SHH signalveien i døende celle stimulert svulstcellevekst. Våre data viser klart bevis for en rolle for Shh utskilt av døende celler i å fremme hurtig repopulation av tumorer fra et lite antall levende tumorceller. Vi tror denne nyoppdagede sti Shh stimulert svulst repopulation spiller en nøkkelrolle i kreft strålebehandling. Videre rettet mot SHH veien kan ha kliniske implikasjoner for forbedring av kreft strålebehandling utfall.
Materialer og metoder
cellekultur betingelser
Menneskebukspyttkjertelkreft Panc1 celler og menneskelige colonic kreft HT29 celler, ble kjøpt fra den kinesiske Academy of Science (Shanghai, Kina) og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Thermo, Beijing, Kina) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sijiqing, Hangzhou, Kina), 100 U ml
-1 penicillin og 100 mikrogram ml
-1 streptomycin ved 37 ° C i fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2.
Tumor repopulation Modell
in vitro
, HT29 celler eller Panc1 celler dyrket i 10 cm petriskål ble X-ray bestråles og tjuefire timer senere ble de trypsinert og sådd inn i 24 brønners plater (Corning, NewYork, USA) ved en tetthet på 2,5 x 10
5 celler per brønn i triplikat i DMEM inneholdende 2% FBS. Tjuefire timer senere, Fluc merket, ble ubehandlet HT29 eller Panc1 celler sådd ut ved en celletetthet på 1000 celler per brønn. Mediet ble endret hver 2 dager i 14 dager.
Bestråling av kreftceller
X-ray bestråling av celler ble utført ved hjelp av en Oncor lineær akselerator (Siemens, Amberg, Tyskland), som ligger i avdeling for stråling ved Shanghai Jiao Tong University tilknyttet First Folkets sykehus. Den doserate for maskinen er ca 3,6 Gy /min.
Gene Transduksjon inn i cellene
Vi omsatte ulike eksogene gener i målceller ved bruk av lentivirus vektorer. Den mest brukte lentiviral vektor er Plex systemet (Thermo Scientific Inc, Beijing, Kina), som inneholdt en puromycin motstand genet. Gener som ble klonet inn i denne vektor omfatter følgende: ildflue luciferase2 og grønt fluorescerende protein fusjonsgenet (Fluc) drevet av CMV-promoteren, luciferasegenet drevet av 8 x villtype Gli1 bindingssete eller 8 x mutert Gli1 bindingssete (dvs vill- skriver 8 × GBS luciferase genet eller mutert 8 × GBS luciferase genet), samt shRNA mot Gli1. Alle lentiviral vektorer ble pakket i 293T celler etter produsentens anvisninger. De stabilt transdusert HT29 eller Panc1 celler ble oppnådd ved lentivirusinfeksjon og puromycin seleksjon i nærvær av 2 ug /ml puromycin i to uker.
Luciferase Assay
luciferase reporter Assay System E1500 (Promega , Wisconsin, USA) ble anvendt for å bestemme ildflue luciferase-aktivitet i henhold til produsentens instruksjoner. HT29 og Panc1 celler som uttrykker villtype-8 x GBS luciferase genet eller det muterte 8 x GBS luciferasegenet ble bestrålt med 6 Gy av ioniserende stråling. Luciferase aktiviteter for 6 Gy bestrålte celler og ikke-bestrålte celler ble testet. Målinger ble utført med en Berthold luminometer (Berthold Teknologier, Bad Wildbad, Tyskland), og ildflueluciferase verdier av celler som uttrykker villtype luciferase-genet ble normalisert ved ildflue luciferase verdier av celler som uttrykker mutant luciferase genet. Normalisering minimerer eksperimentell variabilitet. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer og deretter gjentatt tre ganger.
Bioluminesens Imaging
Å bilde luciferase signalene som sendes ut fra celler, brukte vi NC100 instrument fra Berthold Technologies (Bad Wildbad, Tyskland) plassert i skolen for medisinske basalfag, Fudan University. For Panc1 og HT29-celler, målte vi luciferase-signaler ved tilsetning av D-luciferin (Promega, Wisconsin, USA) i PBS til en sluttkonsentrasjon på 0,15 mg /ml. Fem minutter etter administrering av D-luciferin, ble bildene tatt og luciferase-signaler (fotoner /sek) ble deretter behandlet og analysert kvantitativt ved bruk av produsentens medfølgende programvare. Bilder ble alltid tatt på samme tidspunkt for å minimalisere variasjonen. Luciferase signalene ble målt i Panc1 og HT29 celler på 14 dagers tidspunkt for å maksimere den observerte forskjellen mellom ingen mater og ubehandlede kontroller fra det bestrålte mater eksperimentelle gruppen.
Antistoffer og Nøkkel kjemikalier brukt i denne studien
Kommersielt tilgjengelige antistoffer mot Shh, Gli1, β-aktin, GAPDH (Cell Signaling Technology, Boston, USA) og sekundære antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (Bio-Rad, California, USA) ble kjøpt. SHH signale antagonist cyclopamine og Gant61 ble begge erholdt fra Sigma-Aldrich (Missouri, USA). GDC-0449 ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Texas, USA). SHH signaliserer agonist SAG ble hentet fra Enzo og biovitenskap (NewYork, USA) og rekombinant mus Sonic pinnsvin N-terminal ble hentet fra R
0,05 ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført med SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
Reporter Cell Numbers var Lineært Associated med Luciferase Activity Når Imaging
For å bekrefte korrelasjonen av luciferase aktivitet i bilder med reporter celle tall, vi gjorde en serie av fortynning for Fluc merket tumorceller (kalt «reporter celler»). 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 og 10000 Panc1Fluc eller HT29Fluc tumorceller ble sådd på 96-brønners plater i seks replikater dagen før avbildning. Bildebehandling ble utført 5 minutter etter at D-luciferin bruke NC100 instrument. Fotoner fra hver brønn ble samlet, og deretter analysert ved to-halet ANOVA. Resultatene indikerte at fotoner /sekund ble lineært forbundet med celletall utsådd i brønner (fig. 1A, 1B, R «sup> 2 = 0,9967 i Panc1Fluc celler og R» sup> 2 = 0,9973 i HT29Fluc celler henholdsvis).
A. Korrelasjonsanalyse av fotoner målt ved bioluminesens bilde
vs
celle tall belagt. Fluc merkede Panc1-celler ble sådd ut i 96-brønners plater i 6 gjentas ved den oppgitte nummeret dagen før avbildning. Den gjennomsnittlige fotoner /sek fra 6 repetisjoner på hver celle tall ble analysert ved to-tailed ANOVA (R
2 = 0,9967). Resultatene viste at intensiteten av bildesignalet positivt korrelert med celletall belagt. Hvit skala bar representerer 1 cm i lengde. B. korrelasjonsanalyse av fotoner målt ved bioluminesens bilde
vs
celle tall i HT29 celler. Analysen prosedyre og resultatet var som samme som Panc1 celler som er nevnt ovenfor (R
2 = 0,9973). Scale bar representerer 1 cm. C. Analyse av signalintensiteten av Panc1Fluc celler dyrket på bestrålte Panc1 celler. 2,5 × 10
5 X-ray bestrålte Panc1 celler ble sådd ut i 24 brønners plater som mater. Dosene var 0 henholdsvis Gy, 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy og 20 Gy. 1000 Panc1Fluc celler ble sådd ut i hver brønn med eller uten feeder-celler som reporter. 14 dager senere plate ble fotografert for bioluminescens intensitet. Top: Luciferase aktivitet analyse; Bunn: representant bioluminescence image, skala bar representerer 1 cm. D. Analyse av signalintensiteten av HT29Fluc celler dyrket på bestrålte HT29-celler. Analysefremgangsmåten og resultatet var så like som Panc1 cellene nevnt ovenfor. Top: Luciferase aktivitet; Bunn:. Representant bioluminescence bilde, representerer skala bar 1 cm
Bestrålet Dying Tumor Cell stimulert Stue tumorcellevekst
Vi har gjennomført en rekke eksperimenter for å undersøke effekten av å dø, bestrålte tumorceller ved forskjellige doser på levende tumorceller. For å simulere
in vivo
scenarier der det store flertallet av kreftceller blir drept av stråling eller kjemoterapi, seeded vi et lite antall (10
3) av Fluc merket menneskelige kreft i bukspyttkjertelen Panc1 celler eller human kolon kreft HT29 -celler mot en seng av et mye større antall (2,5 x 10
5) av umerkede homologt kreftceller. Sistnevnte kreftceller kalt «feeder-celler» ble bestrålt ved henholdsvis 2 Gy, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy og 20 Gy, eller ubehandlet (0 Gy). Vekst av det lille antallet levende «reporter celler» ble overvåket ved epi-fluorescerende mikroskopi ved 3 dagers intervaller og ved bioluminescens avbildning på day14 (fig. 1C, 1D). Luciferasepreparater aktiviteter ble brukt som surrogater for antall «reporter celler» som ble bekreftet av vår lineær assosiasjon eksperiment (Fig. 1A, 1B). Våre resultater indikerer at reporter cellene vokste betydelig raskere når sådd ut på døende celler enn når seedet alene. I tillegg feeder-celler bestrålt med 6 Gy viste den høyeste veksten styrke evnen enn andre doser gjorde, med ikke-bestrålte feeder-celler som viser ingen støttende rolle. I kreftceller bestrålt med doser høyere enn 6 Gy, ble vekst stimulerende evne reduseres med økende stråledose for pasienten (Fig. 1C, 1D). Disse observasjonene var sant for både HT29 celler og Panc1 celler.
Aktivering av SHH signalveien positivt korrelert med Dying Cell stimulert Stue tumorcellevekst
For å undersøke om SHH signalveien aktivering var assosiert med stimulering av tumorcellevekst ved å dø celler, gjennomførte vi Western blot eksperimenter med to kreftcellelinjer, Panc1 (fig. 2A) og HT29 (fig. 2B). Aktivert SHH signale ble bekreftet av proteinnivåer Shh og Gli1 som ble kvantifisert ved å måle signalet for 19-kD og 160 kD-båndene, henholdsvis. Vi har funnet at nivåene av shh og Gli1 proteiner var høyere i 6 Gy bestrålt kreftceller enn på andre doser behandlede kreftceller (Fig. 2C, 2D). Videre i tumorceller bestrålt med doser høyere enn 6 Gy, Shh og Gli1 proteinnivåer ble redusert med tilveksten av stråledose for pasienten. Det er interessant at utviklingen i proteinekspresjon nivået av SHH signalveien viste den samme tendens med vekststimulering virkning etter bestråling, som begge var høyest for 6 Gy og avtok med økende strålingsdose.
A . Expression-profilendringer av Shh og Gli1 proteiner i Panc1 cellene bestrålt ved forskjellige doser og oppdaget av Western blot. B. Expression-profilendringer av Shh og Gli1 proteiner i HT29 celler bestrålt ved forskjellige doser og oppdaget av Western blot. C. Relativ intensitet Shh og Gli1 proteinbåndene på Western blot i Panc1 cellene bestrålt ved forskjellige doser. D. Relativ intensitet Shh og Gli1 proteinbåndene på Western blot i HT29 celler bestrålt ved forskjellige doser. E. Luciferase aktivitet av Gli1 reporter i bestrålte og ikke-bestrålte Panc1 celler. ** Representerer
P
0,01. F. Luciferase-aktivitet av Gli1 reporter i bestrålte og ikke-bestrålte HT29-celler. ** Representerer
P
. 0,01
For ytterligere å bekrefte aktiveringen av SHH signalveien i feeder-celler, ble Panc1 og HT29 kreftceller transduced med lentivirus bærer en vill skriver 8 × GBS luciferase reporter eller en mutert 8 × GBS luciferase reporter huse en punktmutasjon som opphever bindingen av Gli1. De celler infisert med lentivirus ble utvalgt med 2 ug /ml puromycin. De transduserte stabilt Panc1 og HT29-celler var ubehandlet eller bestrålt ved en dose på 6 Gy, og deretter luciferaseaktivitet ble målt. Resultatene antydet at den relative luciferaseaktiviteten i 6 Gy bestrålt kreftceller var signifikant høyere enn i ikke-bestrålte cancerceller (
P
0,01), noe som indikerer at Gli1 transkripsjonen faktor-aktivitet ble øket i 6 Gy bestrålt cancer celler. Resultatene som ble observert i begge Panc1 celler (fig. 2E) og HT29-celler (fig. 2F) var like og i overensstemmelse med resultatene fra bioluminence avbildning vist ovenfor.
SHH signale Antagonister Inhibit døende tumorcelle-stimulert levende Tumor cellevekst
Gitt den betydelig oppregulert SHH pathway aktivitet i bestrålte celler, undersøkte vi om manipulasjon av SHH veien ville hemme eller fremme døende kreftceller stimulert levende tumorcellevekst. Om 2,5 × 10
5 6 Gy bestrålt Panc1 celler ble sådd på 24 brønners plater i medium som inneholder Smo antagonist (GDC-0449) på 0,5 mikrometer, 1fiM, 2 mikrometer eller kjøretøy kontroll hhv. 1000 Fluc merket levende Panc1 celler ble sådd ut på bestrålt med eller uten medikament behandlete forsynings lag. Som vist på fig. 3A GDC-0449 redusert Panc1 celler vekst på en doseavhengig måte. Sammenlignet med kontroller som inneholdt bilen, ble signalet i brønner som inneholdt en mikrometer GDC-0449 eller 2 mikrometer GDC-0449 betydelig redusert (
P
0,05). Disse funnene tyder på at GDC-0449 kan hemme døende kreftceller stimulert levende tumorcellevekst.
A. GDC0449, en preklinisk SHH pathway inhibitor, inhiberer Panc1Fluc cellevekst indusert ved å dø Panc1 celle på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. * Representerer
P
0,05. B. Gant61 hemmer Panc1Fluc celler vekst indusert ved å dø Panc1-celler på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. ** Representerer
P
0,01. C. Cyclopamin hemmer HT29Fluc cellevekst indusert ved å dø HT29-celler på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. * Representerer
P
0,05, ** representerer
P
0,01. D. Gant61 hemmer HT29Fluc cellevekst indusert ved å dø HT29-celler på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. ** Representerer
P
0,01. E. GDC0449 inhiberer HT29 Fluc cellevekst indusert ved å dø HT29-celler på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm.
For ytterligere å bekrefte roller SHH signale på døende kreftceller stimulert levende tumorcellevekst, testet vi en annen Gli1 antagonist (Gant61). Tilstanden var identisk med den tidligere nevnte betingelse for GDC-0449, bortsett fra at Gant61 konsentrasjonen var enten 5 pM, 10 pM eller 20 pM. Vi observerte en lignende redusert vekst i Gant61 behandlet brønner sammenlignet med kjøretøy behandlet kontrollbrønner (
P
0,01, figur 3B.). Imidlertid gjorde Panc1 celler behandlet med en annen Smo antagonist (cyclopamine) ikke viser en reduksjon i cellevekst (data ikke vist).
Lignende eksperimenter ble utført på HT29-celler. Omtrent 2,5 x 10
5 6 Gy bestrålte HT29-celler ble sådd på 24 brønners plater i medium med eller uten cyclopamine ved 2 uM, 5 uM eller bærerkontroll henholdsvis, hvorpå 1000 Fluc merket levende HT29-celler ble sådd. Sammenlignet med bærerkontroll behandlede gruppe, cyclopamine redusert HT29-cellevekst på en doseavhengig måte (fig. 3C). De HT29 celler dyrket i kjøretøy kontroll viste en signifikant større luciferase aktivitet enn de cellene dyrket i to mikrometer cyclopamine (
P
0,05) og 5 mikrometer cyclopamine (
P
0,01).
Vi ytterligere testet Gli1 antagonist Gant61 (fig. 3D) og Smo antagonist GDC-0449 (fig. 3E). I begge tilfeller ble det observert lignende resultater. Den Gli1 antagonist Gant61 hemmet HT29 vekst på døende mater celler betydelig. Men forskjellen mellom bilen kontrollgruppen og GDC-0449 behandlede gruppene var ikke signifikant (
P
0,05).
Gli1 knockdown av shRNA Reduserer Dying Tumor Cell stimulert Stue Tumor Cell vekst
Vi har bekreftet ytterligere rolle SHH signalisering i døende kreftceller stimulert levende tumorcellevekst ved hjelp shRNA til knockdown Gli1 uttrykk i feeder-celler. HT29 og Panc1 celler infisert med lentivirus bærer Gli1 shRNA ble valgt i media med 2 mg /ml puromycin, og Western blot analyse for Gli1 uttrykk ble brukt til å bekrefte riktig valg. Protein nivåene av Gli1 i både Panc1 og HT29-celler (fig. 4A, 4B) ble merkbart redusert. Panc1 eller HT29 celler transduced av Gli1 shRNA eller rykke shRNA ble bestrålt med 6 Gy og brukes som mateceller, henholdsvis. Veksten av Fluc merket leve Panc1 eller HT29 celler seeded på Gli1 knockdown feeder-celler ble betydelig svekket som dokumentert av betydelig lavere luciferasepreparater aktiviteter i brønner med Gli1 knockdown Panc1 eller HT29 celler enn brønner med rykke shRNA omsatte Panc1 eller HT29 celler (
P
0,05) (figur 4A, 4B)
En… Den reduserte Gli1 protein uttrykk i Gli1 shRNA transduced Panc1 celler oppdaget av Western blot (øvre panel). Den reduserte Panc1Fluc cellevekst på døende Gli1 shRNA transduced Panc1 celler. * Representerer
P
0,05; skala bar representerer 1 cm. B. Den reduserte Gli1 protein uttrykk i Gli1 shRNA transduced HT29 celler oppdaget av Western blot (øvre panel). Den reduserte HT29Fluc cellevekst på døende Gli1 shRNA transduced HT29 celler. skala bar representerer 1 cm.
SHH Signa agonister Aktiver tumorcellevekst
neste spurte om SHH signalveien agonist, SAG, som virker ved direkte binding til nedstrøms glattet, ville fremme kreftcellevekst. Panc1 og HT29 celler ble bestrålt ved 6 Gy og sådd i 24 brønners plater som forer i medium med eller uten 3 nM, 5 nM, 10 nM eller 100 nM SAG hhv. SAG behandling resulterte i økt rapportørcellevekst på en doseavhengig måte (fig. 5A, 5B). For ytterligere å bekrefte resultatene oppnådd med SAG, tilsatte vi en aktiv form av Shh, dvs. rekombinante N-terminale fragmenter av Shh 600 ng /ml i mediet. Resultatene antydet at rekombinant N-terminale fragment av Shh betydelig forbedret svulstcellevekst på døende mateceller sammenlignet med kjøretøykontroll (
P
0,01). (Fig. 5C, 5D)
A. Aktivering av SHH signalering med SHH signale agonist SAG forbedrer Panc1Fluc cellevekst på bestrålte døende Panc1-celler på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. * Representerer
P
0,05, ** representerer
P
0,01. B. Aktivering av SHH signalering med SAG forbedrer HT29Fluc cellevekst på bestrålte døende HT29-celler på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. ** Representerer
P
0,01. C. Aktivering av SHH signalering med Shh signal agonister, N-terminale fragment av Shh, forbedrer Panc1Fluc cellevekst på bestrålt døende Panc1 celler. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. * Representerer
P
0,05. D. Aktivering av SHH signalering med N-terminale fragment av Shh forbedrer HT29Fluc cellevekst på bestrålt døende HT29 celler. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. * Representerer
P
. 0,05
Shh Melde agonister Forbedre Leve Reporter cellevekst i fravær av bestrålt Feeder Cells
Siden Shh og Gli1 uttrykk økt i bestrålt Panc1 og HT29 celler og Shh signal agonister forbedret døende kreftceller stimulert levende tumorcellevekst, antok vi at økt reporter cellevekst ble forårsaket av SHH signal løslatt fra døende celler, og dermed aktivere SHH signalveien i levende reporter cellene skal også forårsake celle vekst. For å bekrefte vår hypotese har vi lagt til SHH signale agonister SAG og rekombinant N-terminale fragment av Shh til brønner som inneholder Panc1 eller HT29 reporter alene. Både SAG og den aktive formen av Shh økte signifikant Panc1 eller HT29 rapportørcellevekst (fig. 6). Disse funnene antyder at den SHH signalet frigjøres fra døende celler resulterte i at rapportørcellevekst på grunn av aktivering av SHH reaksjonsveien i rapportør cellene.
A. SHH signale agonist SAG forbedrer Panc1Fluc cellevekst på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. ** Representerer
P
0,01. B. SHH aliserte agonist SAG forbedrer HT29Fluc cellevekst på en doseavhengig måte. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. * Representerer
P
0,05, ** representerer
P
0,01. C. Panc1Fluc celler behandlet med N-terminale fragment Shh demonstrere økt vekst. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. * Representerer
P
0,05. D. HT29Fluc celler behandlet med N-terminale fragment Shh demonstrere økt vekst. Top: signalintensitet analyse fra bioluminesens bildet; Bunn: representative Bioluminescens bilder; skala bar representerer 1 cm. ** Representerer
P
. 0,01
Diskusjoner
Tumor celle repopulation er en viktig prosess som forårsaker svulst tilbakefall i løpet av kreft kjemoterapi eller strålebehandling [13]. Repopulation av overlevende tumorceller kan oppstå mellom dose fraksjoner av enten stråling eller kjemoterapi, og kan føre til behandlingssvikt [14].
