Abstract
Bakgrunn
Forhøyet mikro endringer på utvalgte tetranukleotid repetisjoner (EMAST) er en genetisk signatur observert hos 60% av sporadiske kolorektal kreft (CRC). I motsetning til mikro ustabil CRC hvor hypermethylation av DNA mismatch reparasjon (MMR) genet
hMLH1 sin
promoter er årsakssammenheng, den nøyaktige årsaken til EMAST er ikke klart definert, men peker mot
hMSH3
mangel.
Sikt
for å undersøke om
hMSH3
mangel forårsaker EMAST, og å utforske mekanismer for sin mangel.
Metoder
Vi målte -4 bp framshifts på
D8S321 Hotell og
D20S82
loci innen EGFP holdig konstruksjoner for å bestemme EMAST formasjonen i MMR-dyktig,
hMLH1
– /-
,
hMSH6
– /-
, og
hMSH3
– /-
CRC celler. Vi observerte den subcellulære plasseringen av hMSH3 med oksidativt stress.
Resultater
D8S321
mutasjoner oppsto 31-og 40 ganger høyere og
D20S82
mutasjoner oppsto 82-og 49 ganger høyere i
hMLH1
– /- Hotell og
hMSH3
– /-
celler henholdsvis enn i
hMSH6
– /-
eller MMR-dyktige celler.
hMSH3
knockdown i MMR-dyktige celler forårsaket høyere
D8S321
mutasjon priser (18,14 og 11,14 × 10
-4 mutasjoner /celle /generasjon i to uavhengige kloner) enn egge kontroller (0 og 0,26 × 10
-4 mutasjoner /celle /generasjon;
p
0,01). DNA-sekvensering bekreftet de forventede rammeskifte mutasjoner med bevis for pågående mutasjoner av konstruksjonene. Fordi EMAST-positive tumorer er forbundet med betennelse, vi utsatt MMR-dyktig celler til oksidativt stress via H
2o
2 for å undersøke dens effekt på
hMSH3
. En reversibel kjernefysisk-til-cytosol forskyvning av hMSH3 ble observert ved H
2o
2 behandling.
Konklusjon
EMAST er avhengig av MMR bakgrunn, med
hMSH3
– /-
mer utsatt for rammeskifte mutasjoner enn
hMSH6
– /-
, overfor rammeskifte mutasjoner observert for mononukleotid gjentas.
hMSH3
– /-
ligner komplett MMR svikt (
hMLH1
– /-
) i indusere EMAST. Gitt den observerte heterogene uttrykk for hMSH3 i CRC med EMAST,
hMSH3
-deficiency ser ut til å være tilfelle at starter EMAST. Oksidativt stress, noe som fører til en forskyvning av hMSH3 er subcellulære sted, kan bidra til en hMSH3 tap-av-funksjon fenotype ved å binde det til cytosol
Citation. Tseng-Rogenski SS, Chung H, Wilk MB, Zhang S, Iwaizumi M, Carethers JM (2012) Oksidativt stress induserer Nuclear-til-cytosol Shift av hMSH3, en mulig mekanisme for EMAST i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 7 (11): e50616. doi: 10,1371 /journal.pone.0050616
Redaktør: Hoguen Kim, Yonsei University School of Medicine, Republikken Korea
mottatt: 12. august 2012; Godkjent: 25 oktober 2012; Publisert: 30.11.2012
Copyright: © 2012 Tseng-Rogenski et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av USA Public Health service (DK067287 og CA162147) og SDSU /UCSD Comprehensive Cancer Center Partnership (CA132379 og CA132384). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA mismatch reparasjon (MMR) dysfunksjon driver prosessen med mikro ustabilitet (MSI), observert i nesten alle Lynch syndrom kolorektal kreft (CRC) og i 15-20% av sporadiske CRC [1]. MSI er observert når begge alleler av et større DNA MMR genet er inaktivert av mutasjon i Lynch svulster eller ved hypermethylation i sporadiske svulster, forårsaker MMR proteinproduksjon eller funksjon for å mislykkes, og tillater frameshifts å skje ved DNA mikro sekvenser gjennom hele genomet [1] – [3]. Classic MSI bestemmes av forekomsten av frameshifts i mono /dinukleotidpolyfosfater markører, og har en definert panel for å sammenligne studier [4]. Dette panelet, eller varianter av disse mono /dinukleotidpolyfosfater markører, oppdager lett
hMLH1
– og
hMSH2
-deficiency (som dysfunksjon av disse to proteinene helt inaktiverer DNA MMR), og av og til
hMSH6
-deficiency [1], [4]. MSI panelet ikke er så spesifikk for å detektere
hMSH3
-deficiency på grunn av beskaffenheten av reparasjon at dette proteinet bidrar til MMR, basert på gjær studier [5], [6]. DNA MMR er et enzymsystem som hoved cellular funksjon er å reparere nucleotide mispairs og innsetting /sletting sløyfer (IDLs) under DNA replikasjon. Spesifisiteten av mismatch anerkjennelse er regissert av hMutSα og hMutSβ; hMutSα (hMSH2-hMSH6 heterodimer) binder seg til enkelt mispairs og små IDLs (≤2 nukleotider), mens hMutSβ (hMSH2-hMSH3 heterodimer) binder større IDLs [1], [5] – [7]. Vi og andre har observert DNA lesjon bindingsspesifisiteter med renset hMutSα og hMutSβ samt gjort konkrete observasjoner på binding ved hjelp av humane CRC celler av forskjellig DNA MMR-mangelfull bakgrunn skjuler konstruksjoner som inneholder spesifisert lengde IDLs eller nucleotide mispairs [8] – [12] .
Nylig har en ny form for MSI blitt beskrevet i opptil 60% av sporadisk kolon [13] – [15] og over 30% av endetarms kreft [16]. I motsetning til klassisk MSI, er forhøyede mikro forandringer på utvalgte tetranukleotid gjentagelser (EMAST) bestemt av et panel av tetranuleotide markører [13] – [17]. EMAST synes å være mer vanlig enn klassisk MSI og ser ut til å være en ervervet trekk assosiert med betennelse i CRC [14], [16]. CRC pasienter som har EMAST-positive svulster har en dårligere prognose enn de med ikke-EMAST eller MSI svulster [16], [18]. EMAST har blitt observert i forskjellige tumorer, inkludert ikke-småcellet lunge [17], blære [19], eggstokk [20], prostata [21], skin [22], og kolorektal [13] – [16], men disse studier gir ikke fullstendig bevis for årsaken til EMAST. I de innledende rapporter om EMAST i kolorektal kreft, forfatterne observert atom heterogenitet hMSH3 innen EMAST-positive tumorer [13], [14]. Våre data, kombinert med gjær [5], [6], og andre menneskelige studier [13] – [16], tyder på at
hMSH3
-deficiency kan være føreren av EMAST i CRC
for å teste om
hMSH3
-deficiency er en av hovedgrunnene EMAST, genererte vi tetranukleotid gjenta holdig konstruksjoner som ble smeltet out-of-ramme med EGFP, slik at når frameshifted ved -4 bp ( dvs. delesjon av en tetranukleotid enhet), ville EGFP bli uttrykt. Dette gjorde observasjonen av den generasjonen av EMAST i sanntid, og ga oss muligheten til å beregne mutasjon frekvenser og mutasjon priser i flere MMR-mangelfull bakgrunn. I denne rapporten våre data viser tydelig at
hMSH3
-deficiency er en årsak til EMAST i menneskelige CRC celler og vi gir en mulig mekanisme som kan bidra til det oppkjøpte
hMSH3
-deficiency ytterligere menneskelige CRC.
Resultater
Etablering av et målesystem for EMAST tetranukleotid Frameshifts
Fordi enkelte studier har indikert at EMAST er forbundet med heterogene uttrykk for hMSH3 i tykktarmssvulster [13 ] – [16], vår tilnærming var å generere et system for å måle EMAST på en kvantitativ måte som et middel for direkte å undersøke om
hMSH3
-deficiency er årsaken til EMAST. Menneskelig tetranukleotid
D8S321 Hotell og
D20S82
loci sekvenser (som inneholder 12 og /eller 16 ganger i AAAG, henholdsvis) har vist den høyeste frekvensen for en -4 bp rammeskifte i tykktarmssvulster [14], [16]. Disse to loci ble derfor valgt for studien ved hjelp av CRC celler med forskjellige MMR genetiske bakgrunn for å fastslå påfølgende mutasjon. Vi har tidligere etablert et lignende forsøkssystem hvor delesjon av en bp av (A)
n ville føre til ekspresjon av reportergenet EGFP da en konstruksjon ble plassert 1 bp ut-av-ramme [10] – [12 ].
For å generere de eksperimentelle konstruksjoner, satt vi
D8S321 plakater (D8) og
D20S82 plakater (D20) loci som 60-merer som inneholder tetranukleotid gjentakelser og omkringliggende nukleotider umiddelbart etter EGFP-startkodon [Tabell S1]. Eksperimentelle konstruerer [D8-OF (D8-out-of-frame) og D20-OF] ble gjort en bp out-of-ramme slik at sletting av en AAAG gjenta vil skifte EGFP leseramme (1 bp til -3 bp) i den korrekte ramme å forårsake EGFP uttrykk. Mutasjons resistente (MR) plasmider (MR-D8 og MR-D20), som tjener som negative kontroller, ble konstruert ved å erstatte de midte AA nukleotider i AAAG gjentar med C /G-nukleotider i hver tredje AAAG, avbryte serie tetranukleotid gjentar til forhindre rammeskifte mutasjoner. De MR-D8 og MR-D20 plasmider ble plassert ute av ramme (OF; D8 /D20-MR-OF) og /eller i-ramme (IF, D8 /D20-MR-IF) til å bli brukt som negative og positive kontroller for EGFP uttrykk (se også Materialer og metoder). Disse konstruksjonene ble transfektert inn i menneske CRC cellelinjer med ulike MMR genetiske bakgrunn og stabile cellelinjer ble etablert via hygromycin B utvalget. Enkelt celle kloner ble senere etablert. DNA-sekvensering ble ansatt for å riktig bekrefte de transfekterte EMAST konstruksjoner (Tabell S1). Som forventet, celler som bærer MR-IF (positiv kontroll) var EGFP positive, mens celler som inneholder MR-OF (negativ kontroll) var EGFP negative.
For å teste om
hMSH3
-deficiency kan forårsake EMAST, ikke-fluorescerende celler som bærer de forskjellige stabilt transfekterte EMAST konstruksjoner ble sortert ved hjelp av strømningscytometri og eksponensielt dyrket i fire til seks uker. Hver uke, celler ble analysert i duplikat av flowcytometri for EGFP uttrykk, antagelig som følge av sletting av en AAAG gjenta fra transfekterte
D8S321 Hotell og /eller
D20S82
loci. EGFP positive celler begynte nye så snart en uke etter EGFP negative celler ble sortert og belagt (data ikke vist). For å sikre at våre eksperimentelle system tillatt oss å vurdere forekomsten av EMAST riktig, de EGFP negative og positive celler fra
hMLH1
– /- Hotell og /eller
hMSH3
– /- celler som de eksperimentelle konstruksjoner (D8-aV og D20-aV) ble sortert for å isolere genomisk DNA for sekvensering. Som forventet, i hovedsak alle kloner (større enn 96%) fra EGFP negative celler beholdt villtype (WT) sekvenser for hver av
D8S321 Hotell og
D20S82
loci i både
hMLH1
– /- Hotell og
hMSH3
– /-
cellelinjer, mens kloner fra EGFP positive celler ervervet sletting av en AAAG repeat (figur 1A og Figur S1 A og S1B). Vi har også observert ekspansjonsrammeskifte mutasjoner i hvert locus av DNA-sekvensering (inkludert i «andre» i figur 1A). Den hyppigste en (som varierer fra 12,5% til så høyt som 30% av totalt antall EGFP-positive celler) var innsetting av to AAAG gjentar [(AAAG)
12 til (AAAG)
14] i
D8S321 Hotell som endret leseramme fra en bp til 9 bp (oppført som «andre» i figur 1A og Figur S1 A). I tillegg ble mer enn en AAAG gjenta sletting (f.eks 4 eller 10 AAAG gjenta sletting) sjelden observert ( 8% av totalen, er oppført i «andre» i figur 1A). Viktigere, sletting /innsetting mutasjoner alltid ble oppdaget i løpet av de mikrosekvenser mens ingen mutasjon skjedde i de flankerende sekvensene rundt AAAG repeat (figur S1). Disse observasjonene tyder på at vi har etablert et pålitelig eksperimentelt system for å overvåke forekomsten av EMAST i CRC celler.
(A) Genomisk DNA isolert fra EGFP-negative og -positive celler som bærer eksperimentelle konstruksjoner (D8-AV og /eller D20-OF) ble anvendt for å amplifisere DNA-fragmenter inneholdende EMAST loci for å undersøke om rammeskifte mutasjoner hadde skjedd. (B) Mutasjons frekvenser som ble beregnet ved å dividere prosenten av EGFP positiv befolkning i forsøksgruppen (OF) ved prosentandelen av EGFP positiv i sin negative kontroll (MR-OF) for å beregne økningen av EGFP-positive populasjon i folder. Det var signifikant flere EGFP-positive celler i
hMLH1
– og
hMSH3
-deficient celler sammenlignet med MMR-dyktig og /eller
hMSH6
-deficient celler. *: P. 0,05
rammeskifte Mutasjoner på tetranukleotid Gjentar av
D8S321 Hotell og
D20S82
Loci er avhengig av MMR Bakgrunn
Å undersøke effekten av MMR bakgrunnen på rammeskiftmutasjoner i tetranukleotid
D8S321
og
D20S82
loci, beregnet vi mutasjons frekvenser av markørene ved å sammenlikne hver forsøksgruppe (oF) til sin negative kontroll (MR -av) med følgende formel: «(EGFP positive celler /total levende celler fra OF) /(EGFP positive celler /totale levende celler fra MR-OF)».
hMLH1
– /-
celler (helt blottet for DNA MMR aktivitet) og
hMSH3
– /- celler viste 7-12 ganger høyere mutasjons frekvenser i forhold til kontrollene for begge loci (figur 1B). Spesielt mutasjonsfrekvenser observert i
hMSH3
– /- sammenlignes med resultatene i
hMLH1
– /- for begge loci (figur 1B). De -4 bp mutasjon priser for både loci i hvert MMR bakgrunnen ble også beregnet (tabell 1). Med full MMR-mangel (
hMLH1
– /-
), mutasjon priser for både loci var 27 og 56 × 10
-4 mutasjon /celle /generasjon. Tilsvarende
hMSH3
– /-
celler generert 33 og 34 × 10
-4 mutasjoner /celle /generasjon. Dermed mutasjon priser med
hMSH3
-deficiency er svært sammenlignbare med de som ble observert for fullstendig MMR-mangel. Dette er i skarp kontrast til
hMSH6
-deficiency ( 1 x 10
-4 mutasjon /celle /generasjon), i hovedsak identisk med MMR-dyktige celler. Disse funnene sterkt at
hMSH3
-deficiency er driveren for EMAST formasjon.
Direkte knockdown av hMSH3 Expression i MMR-dyktige Cells Årsaker EMAST
For å bekrefte en rolle hMSH3 i EMAST, vi slått ned
hMSH3
uttrykk i MMR-dyktige celler husing
D8S321
-EGFP konstruere ved trans plasmider bærer
hMSH3
-spesifikk shRNA og /eller kryptert kontroll, deretter målt
D8S321
tetranukleotid rammeskifte mutasjoner som ovenfor. Før shRNA transfeksjon, hMSH3 uttrykk nivåer i utvalgte MMR-dyktig kloner var sammenlignbare med hverandre (figur S2). Etter generasjon av shRNA stabile cellelinjer (encellede kloner), ble hMSH3 uttrykk betydelig redusert i
hMSH3
shRNA transfekterte celler (figur 2; varierende mellom 26-34% av proteinnivåer krafse kontroller).
hMSH3
shRNA transfeksjon vellykket og spesielt redusert hMSH3 uttrykk nivåer i CRC celle kloner. Merk at uttrykket nivåer av andre DNA mismatch-reparasjonsgener forblir uendret.
Bruke shRNA stabilt-transfekterte celler som inneholder
D8S321
locus, vi undersøkte cellelinjer for forekomst av EMAST ved strømningscytometri. En EGFP-positive befolkningen dukket opp i cellene der
hMSH3
uttrykk ble slått ned.
hMSH3
KD celler viste fem ganger (klon 1) og 6 ganger (klone 2) økning i mutasjonsfrekvenser (figur 3A) sammenlignet med egge shRNA kontrollceller. Reduksjon i hMSH3 uttrykk kraftig økt mutasjon priser på
D8S321
konstruere til 12,7 og 18,4 × 10
-4 mutasjon /celle /generasjon, sammenlignet med 1 × 10
-4 mutasjon /celle /generasjon i krafse kontroller (tabell 2). EGFP-negative og -positive celler ble skilt ut for DNA-sekvensering for å undersøke rammeskifte mutasjoner. I begge klonene, som er større enn 90% av EGFP-negative celler opprettholdt WT sekvens [(AAAG)
12], mens ca. 90% av EGFP-positive celler avslørte en delesjon av en gjentakelse av AAAG (figur 3B). Utvidelse av mikro gjentar ble også påvist (inkludert som «andre» i figur 3B). Samlet sett tyder våre observasjoner at direkte KD av
hMSH3
forårsaker
hMSH3
-deficiency alene er i stand til å generere EMAST i tidligere MMR-dyktig CRC celler.
( A) SW480 celler (MMR dyktigere) bærer EMAST konstruksjon (D8-OF eller D8-MR-OF) ble transfektert med
hMSH3
shRNA konstruere (
hMSH3
KD) eller rykke kontroll (scramble ) hver for seg. To uavhengige
hMSH3 Hotell og rykke KD kloner samt foreldrenes cellene ble inkludert i denne studien. EMAST mutasjonsfrekvenser ble beregnet som beskrevet i figur 1B for foreldre, scramble, og /eller
hMSH3
KD celler. Det var signifikant flere EGFP-positive celler i
hMSH3
KD celler i forhold til foreldre og /eller krafse kontrollceller. *: P 0,001; **: P 0,05. (B) EGFP-negative og -positive celler fra
hMSH3
KD celler som bærer D8-OF ble sortert for genomisk DNA for å undersøke rammeskifte mutasjoner ved sekvensering.
Oksidativt stress fører subcellulære compartment Shift av hMSH3 fra Nucleus til cytosol
EMAST har blitt observert å være tett forbundet med heterogene tap av hMSH3 uttrykk samt atomheterogent uttrykk (Haugen
et al
2008.; Lee
et al
., 210, Devaraj
et al
., 2010). Våre studier fremfor videre dokumentere at reduksjon av hMSH3 uttrykk alene kan indusere EMAST i humane CRC celler. Vi begynte å utforske hvordan hMSH3 kan bli mangelfull i EMAST-positive svulster med den observerte reduksjonen fra full til heterogene uttrykk. I CRC blir EMAST assosiert med inflammatoriske celler [13], [14], [16] som kan legge til rette for oksidativt stress, som har vist seg å svekke MMR funksjon [23]. Ved hjelp av H
2o
2 som et surrogat, undersøkte vi effekten (e) av oksidativt stress på hMSH3 uttrykk. MMR-dyktig celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av H
2o
2 (50 mikrometer -500 mikrometer) i opptil 24 timer. Vi gjorde ikke oppdage eventuelle reduksjoner i total hMSH3 proteinnivået i alle forhold vi prøvde (data ikke vist). Imidlertid ved behandling av celler med 50 pM av H
2o
2 i 4 timer, ble hMSH3 funnet homogent i både kjernen og cytosol i en betydelig prosentandel av celler (40 til 60%, for det annet panel kolonne i figur 4A). Påfallende, hMSH3 ble observert for fullstendig å forlate kjernen i enkelte celler [10-20% av totale celler (panel tredje kolonne i figur 4A], i skarp kontrast til de ubehandlede celler hvor hMSH3 hovedsakelig forble lokalisert i kjernen (venstre paneler i figur 4A ). skiftet av hMSH3 lokalisering kunne påvises så snart som to timer inn i behandling, og effekten toppet seg mellom 4 og 8 timer etter H
2o
2 behandling startes (data ikke vist). i motsetning hMSH3, hMLH1, hMSH2, og hMSH6 endret ikke sin cellulær lokalisering og forble i kjerner (figur 4B og Figur S3A, S3b, og S3C). Cell fraksjonering for å skille kjernefysiske og cytosoliske fraksjoner matchet våre immunocytochemistry observasjoner (Lanes 1-3 og 5-7 i figur 4B).
(A) MMR-dyktig SW480-celler ble serum-sultet i 24 timer og deretter behandlet med 50 uM H
2o
2 i 4 timer. etter fiksering ble cellene farget med anti-hMSH3-antistoff og deretter Alexa 488-konjugert anti-mus-antistoff for å observere den subcellulære beliggenheten av hMSH3. For å teste om effekt var reversibel, ble cellene dyrket i ytterligere 24 timer etter fjerning av H
2o
2. (B) SW480 celler ble serum-sultet i 24 timer og deretter behandlet med H
2o
2 til 4 timer (-FBS + H
2o
2). Parentale celler (paren) og celler som ble serum-sultet uten den påfølgende H
2o
2-behandling (-FBS) ble anvendt som kontroller. Cellulære proteiner ble delt inn i kjernefysiske og cytosoliske fraksjoner ved hjelp av en kjernefysisk fraksjone kit. Like stort volum av proteiner fra hver gruppe ble anvendt for SDS-PAGE og påfølgende Western blotting for å kontrollere nivået av hMSH3. Anti-histon H3 ble benyttet for kjernefysisk brøkdel lasting likestilling, og tubulin ble brukt for cytosoliske brøkdel lasting likestilling.
For å undersøke om effekten av H
2o
2 på hMSH3 var reversibel , erstattet vi H
2o
2-inneholdende medium med friskt media etter 4 timers behandling. hMSH3 ble funnet å være atom ved 24 timer etter fjerning av H
2o
2 (høyre panel i figur 4A og baner 4 og 8 i figur 4B). Dette resultatet kan tyde på at effekten av H
2o
2 på hMSH3 var reversibel, hvor hMSH3 er lov til å gå inn i kjernen når oksidativt stress avtatt. Alternativt kan hMSH3 som var i cytosol kan ha blitt skadet og degradert og dermed var ute av stand til å skrive inn i kjerner, og kan tyde på at den observerte atom hMSH3 ble nylig syntetisert. For å bestemme hvilken scenario kan være riktig, vi behandlede celler med 20 ug /ml cykloheksamid ved fjerning av H
2o
2 for å stoppe proteinsyntese i 24 timer. hMSH3 ble funnet å være i kjernen (data ikke vist), som viser at hMSH3 som ble flyttet til cytosol var faktisk i stand til å gå inn i kjernen.
Diskusjoner
DNA MMR studier fra bakterier og gjær indikerer at hMutSβ, en heterodimer av hMSH2 og hMSH3, binder og retning og reparasjon av innsettings-delesjon løkker ± 2 nukleotider [1], [5], [6]. Således
hMSH3
-deficiency ville forventes å tillate store innførings-delesjonssløyfe rammeskiftmutasjoner, som er sterkt foreslått i tidligere studier [13] – [16]. Bestemme konsekvensen av
hMSH3
-deficiency var ikke tidligere svært viktig, da det aldri har blitt beskrevet en germline mutasjon for
hMSH3
å forårsake Lynch syndrom, og det var ingen sammenheng med sporadisk CRC inntil beskrivelsen av EMAST i CRC [13] – [16]. Koblingen av EMAST med heterogene tap av hMSH3 uttrykk i sporadiske CRC antydet at dette DNA MMR protein kunne kjøre EMAST. I vår studie, vi setter ut for å teste dette ved å opprette en human cellemodell for å måle EMAST formasjonen i en kvantitativ måte. Vår studie viser at (a) EMAST dannelse er avhengig av MMR bakgrunn, med
hMSH3
-deficiency matchende komplett MMR-mangel i forårsaker EMAST, (b)
hMSH3
-deficiency mutasjon priser for EMAST dannelse er markert høyere sammenlignet med
hMSH6
-deficiency (egentlig null for EMAST dannelse), (c) knockdown av
hMSH3
alene initierer dannelsen av EMAST, og (d) oksidativt stress kan være en av faktorene som forårsaker mangel på hMSH3, da dette MMR protein skifter sitt subcellulære beliggenhet med H
2o
2. Helt, vår studie gir sterk støtte til konseptet at
hMSH3
-deficiency driver EMAST dannelse og gir en mulig mekanisme som kan bidra til hMSH3-mangel i menneskelige CRC.
tetranukleotid frameshifts som definerer EMAST i CRC svulster kan være ved innsetting eller sletting av tetranukleotid gjentas. I våre forsøk, har vi designet konstruerer å oppdage en -4 bp sletting; Men ved DNA-sekvense noen innsett (utvidelse) av mikro ble også påvist. Faktisk er mesteparten av rammeskiftmutasjoner detekteres i våre eksperimenter, var på grunn av delesjon av en AAAG enhet (figur 1 A og 3B). Vi valgte
D8S321 Hotell og
D20S82
loci for våre eksperimenter fordi sletting av en AAAG enheten hadde vist seg å være den mest rådende mutasjonen funnet blant loci benyttes for å påvise EMAST [14], [16 ]. Fordi systemet er designet for å bare oppdage en type mutasjon, våre priser beregnes sannsynligvis en undervurdering av den mutability av disse loci med
hMSH3
-deficiency. Individuell sekvens kontekst og flankerende sekvenser, kan også bidra til annet resultat av mutasjonen (f.eks innsetting vs. delesjon) [11], [12], [24]. På
D20S82
locus, bare om lag en tredjedel av EGFP-positive
hMSH3
– /-
celler viste en AAAG enhet sletting, og dette kan være på grunn av denne klonen inneholder flere kopier av konstruksjonen. Dette er i kontrast til mer enn 70% av EGFP positive celler som bærer samme konstruere i
hMLH1
– /-
viser sletting av en AAAG enhet, noe som indikerer at konstruksjonen oppførte seg som utformet. For
hMSH3
– /-
celler, mutasjon på en av kopiene ville føre til EGFP uttrykk, mens resten forble WT, confounding sekvensering analyse. Dette vil imidlertid ikke påvirke mutasjonsfrekvens og mutasjonsraten som beregningen var basert på antall EGFP-positive celler.
Det er ikke helt klart for EMAST-positive tumorer hvor
hMSH3
er nedregulert å initiere EMAST. Det er klare bevis for at EMAST-positive tumorer er sterkt forbundet med betennelsesceller, særlig innenfor de epiteliale komponenter av svulsten og i stroma rundt tumor (såkalte «svulst reir») [16]. Dermed er en hypotese at betennelse utløser en ervervet reduksjon av hMSH3, som senere driver EMAST. Interessant, H
2o
2 behandling (simulere oksidativt stress) fører til en forskyvning av hMSH3 inn i cytosol bort fra sin funksjonelle område i kjernen uten å redusere sine samlede uttrykket nivåer. Med kortsiktig H
2o
2 behandling, kunne vi ikke påvise detekterbare nivåer av EMAST dannelse i vår modell (data ikke vist). En lengre og konsistent nærvær av oksidativt stress kan være nødvendig for å påbegynne EMAST, tatt i betraktning EMAST ser ut til å være assosiert med kronisk betennelse og med avansert histologi av tumorer [14]. Alternativt kan andre komponenter av inflammasjon og /eller tumormiljøet jobber sammen med oksidativt stress for å forårsake EMAST. EMAST synes å være et dårlig prognostisk faktor for pasienter med CRC [16], [18]. Dette er i motsetning til klassiske MSI for hvilke pasienter med CRC har bedre overlevelse på samme trinnvise tumor av pasienter med tumorer MSS [1]. Det gjenstår å fastslå om dette er iboende i den type MMR defekt (
hMLH1
vs.
hMSH3
) eller noen andre faktorer, som for eksempel graden eller type betennelse i svulsten.
Oppsummert viser vi gjennom etableringen av en ny cellemodell som
hMSH3
-deficiency driver EMAST. Våre data sterkt utfyller observasjon av heterogene tap av hMSH3 uttrykk i EMAST-positive svulster, og antyder at ervervet
hMSH3
-deficiency, drevet av oksidativt stress, kan være den vanligste DNA MMR defekt blant menneske CRC.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
Den menneskelige tykktarmskreftcellelinjer, HCT116 (
hMLH1
– /- hMSH3
– /-
), DLD-en (
hMSH6
– /-
), HCT116 + CH3 (
hMLH1-
restaurert, men
hMSH3
– /-
), og SW480 (MMR-dyktig) celler ble dyrket som tidligere beskrevet [10]. HCT116, ble DLD-en, og SW480 kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). HCT116 + CH3 celler ble vennlig levert av Dr. Minoru Koi, Baylor University Medical Center, Dallas, TX [10]. Anti-hMLH1, hMSH2, hMSH3, og hMSH6 antistoffer ble kjøpt fra BD Pharmigen (San Diego, California). Anti-tubulin antistoff var fra Sigma (St. Louis, MO). HRP-konjugert anti-mus antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA). Alexa 488 konjugert anti-mus antistoff var fra Invitrogen (Grand Island, New York).
Kloning av pIREShyg2-
D8S321
-EGFP og pIREShyg2-
D20S82
-EGFP Plasmider
de to menneskelige loci,
D8S321 Hotell og
D20S82, etter har blitt rapportert å ha den høyeste mutasjonsfrekvensen i EMAST colonic svulster [13] – [16], og ble valgt å konstruere plasmider.
D8S321 Hotell og
D20S82
sekvenser inneholder 12 og /eller 16 ganger i AAAG hhv. Sense og anti-sense oligonukleotider som inneholder
D8S321
eller
D20S82
, rundt sekvenser, samt
PME
jeg og
Asc
jeg kloningssetene (tabell S1) ble syntetisert (Integrated DNA Technologies, Inc., San Diego, CA) og utsatt for T4-polynukleotidkinase reaksjoner til å fosforylere den 5 «ender (Invitrogen). Sanse og anti-sense oligonukleotider fikk lov til gløding og klonet inn pIREShyg2-EGFP plasmider via
PME
I-
Asc
-seter umiddelbart etter startkodonet av EGFP genet som beskrevet tidligere [ ,,,0],10] – [12], [24]. Eksperimentelle plasmider ble konstruert en bp ut av rammen, slik at en sletting av en tetranukleotid gjenta innenfor
D8S321
eller
D20S82 plakater (-4 bp rammeskifte mutasjon) ville skifte leserammen til riktig ramme for å tillate EGFP uttrykk. Mutasjons resistente plasmidene [MR-ut-av-ramme (OF)] ble konstruert ved hjelp av følelse og anti-sense oligonukleotider hvor to nukleotider innenfor hver tredje gjentakelse av AAAG ble endret for å hindre at rammeskiftmutasjoner. Mutasjonen motstandsdyktig i rammen (MR-D8-IF) plasmid, en positiv kontroll for EGFP uttrykk, ble konstruert ved å slette en bp fra
D8S321
sekvensen i MR-D8-OF plasmider ved hjelp QuikChange II stedsrettet mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA).
hMSH3
shRNA Construction
hMSH3
shRNA konstruere og dens paret tom vektor ble vennlig levert av Dr. Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Dallas, TX. GFP sekvens av denne konstruksjonen ble fjernet ved fordøyelse av konstruksjonen med
Apa
jeg og
Pac
jeg, fylle inn med Klenow fragment for å danne butte ender, og deretter utføre butt-ende ligering. For å gjøre en kodet kontroll ble GFP-sekvensen fra den tomme vektoren først fjernes som beskrevet ovenfor, og den krypterte sekvens, fjernes fra et kommersielt tilgjengelig konstruksjon (GeneCopoeia, Rockville, MD), ble satt inn i vektoren via
EcoR
jeg og
Xho
I områder. Eksistensen og nøyaktigheten av krafse og /eller
hMSH3
shRNA sekvenser på plasmider ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Transfeksjon og generasjon av stabile cellelinjer
Celler ble transfektert med forskjellig pIREShyg2-
D8S321
-EGFP og pIREShyg2-
D20S82
-EGFP plasmider (beskrevet i tabell S1) ved hjelp Nucleofector kits (Amaxa, Köln, Tyskland). Stabile cellelinjer ble etablert av hygromycin B (Invitrogen) utvalg. Hver cellelinje ble underkastet enkeltcellesortering ved hjelp av FACS Aria (Becton Dickinson, San Jose, CA) for å etablere individuelle kloner. Alle enkelt celle kloner ble undersøkt ved hjelp av DNA-sekvensering for å sikre eksistensen og nøyaktigheten av EMAST konstruere de gjennomføres.
For
hMSH3
knockdown (KD) celler, MMR-dyktig celler (SW480) bærer D8-aV og /eller D8-MR-OF konstruksjoner ble transfektert med plasmider husing rykke eller
hMSH3
-spesifikk shRNA hjelp Fugene 6 (Roche, Mannheim, Tyskland), etterfulgt av puromycin (Invitrogen) utvalg for å etablere stabile linjer. To uavhengige kloner fra hver gruppe ble anvendt for undersøkelsene.
Mutasjonsanalyse ved strømningscytometri
Fire hundre tusen ikke-fluorescerende stabil-transfekterte celler ble sortert på hver brønn på 6-brønners plater etter
