Abstract
Bakgrunn
Menneske polo-lignende kinase 1 (PLK1) uttrykket har vært forbundet med dårligere utfall i tykk- og endetarmskreft. Vårt mål var å analysere PLK1 i endetarmskreft, og sin tilknytning til clinicopathological variabler, total overlevelse samt tumor regresjon til neoadjuvant behandling.
Metoder
PLK1 uttrykk ble kvantifisert med immunhistokjemi i sentrum og periferi (invasiv front) av endetarms kreft, så vel som i de involverte regionale lymfeknuter fra 286 pasienter. Poeng er basert på fargeintensitet og andelen positive celler, multiplisert for å gi vektede skårer 1-12, dikotomiserte til lav (0-5) eller høy (6-12).
Resultater
PLK1 score i svulsten periferien var signifikant forskjellig fra tilstøtende normal slimhinne. Overlevelsesanalyse viste at lav PLK1 poengsum i svulsten periferien hadde en hasardratio for død på 0,59 i multivariat analyse. Andre prediktorer for overlevelse inkludert alder, tumor dybde, metastatisk status, vaskulær og perinevral invasjon og adjuvant kjemoterapi. Det var ingen statistisk signifikant sammenheng mellom PLK1 poengsum og histologiske tumor regresjon i neoadjuvant kohorten.
Konklusjon
Lav PLK1 minutter ble en uavhengig prediktor for overlegen total overlevelse, justert for flere clinicopathological variabler inkludert behandling .
Citation: Tut TG, Lim SHS, Dissanayake IU, Descallar J, Chua W, Ng W, et al. (2015) oppregulert Polo-Like kinase 1 Expression korrelerer med dårlig overlevelse Outcomes i endetarms kreft. PLoS ONE 10 (6): e0129313. doi: 10,1371 /journal.pone.0129313
Academic Redaktør: Kyung S. Lee, National Cancer Institute, NIH, UNITED STATES
mottatt: 30 november 2014; Godkjent: 08.05.2015; Publisert: 05.06.2015
Copyright: © 2015 Tut et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de viktigste årsakene til dødelighet i den utviklede verden. Rektalkreft utgjør en tredjedel av disse tilfellene, og bære en dårligere prognose enn coloncancere. I lokalavansert innstillingen, blir de behandlet forskjellig på tykktarm kreft, med trimodality behandling bestående av neoadjuvant chemoradiation, kirurgi og adjuvant kjemoterapi [1]. Rektosigmoid svulster blir behandlet meg til colonic svulster, som er metastatisk endetarmskreft. Det er behov for biomarkører for å informere prognose og valg av behandling, vurdere behandlingsrespons, og bistand i lagdeling av pasienten risiko for å tilpasse og tilpasse pasientbehandling.
Nylig Rodel og kolleger rapporterte polo-lignende kinase 1 (PLK1) for å være en ny logisk biomarkør for strålesensitivitet i endetarmskreft [2]. Vi hypoteser som over-uttrykk for PLK1 korrelerer med dårligere resultater i endetarmskreft. PLK1 er et mitotisk serin /treonin-kinase cellesyklusregulator som er nødvendig for celledeling, er involvert i reguleringen av mitotisk oppføring, spindel-dannelse og cytokinese [3-5]. Den funksjonelle betydningen av PLK1 i karsinogenese og ondartet progresjon er ikke klart forstått, men likevel dets overekspresjon er funnet i mange krefttyper [2,6], inkludert kolorektal cancer [7,8]. Dens evne tumorigen er vist i nakne mus injisert med PLK1-overuttrykkende NIH3T3 fibroblaster [9]. Utnyttelse av små interfererende RNA [10,11] og antisensoligonukleotider [12] i ondartede celler å utarme PLK1 nivåer også indusert apoptose og oppdemning av ondartet spredning i
i-vitro
og
in vivo
modeller. PLK1 aktivitet er nødvendig reparasjon av DNA skade som følge av kjemo- og stråleterapi [13]. Derfor PLK1 ser ut til å være en lovende prediktiv og prognostisk biomarkør, og her vi undersøke sin rolle i endetarmskreft. Vi har også som mål å vise at PLK1 er uavhengig av markør celleproliferasjon Ki67.
Materialer og metoder
Etikk godkjenning ble innhentet på 22
nd juni 2012 fra Sydney South-West-området Tjenesten helsekomitéen Etikk Review, referansenummer HREC /12 /Lpool /102. The Institutional Review Board fravikes behovet for skriftlig informert samtykke fra deltakerne som prosjektet ble ansett å være i lav eller ubetydelig risiko kategorien. Informasjon ble avidentifisert før analysen.
Prøver fra primær kirurgi for endetarms eller rektosigmoid kreft ble oppnådd fra Sør-Vestområdet patologi database, Australia 2000-2010. Kirurgi besto av totalt mesorectal eksisjon, med fremre eller abdominoperineal reseksjon. Variabler av interesse inkludert alder, kjønn, patologisk stadium av svulst, klasse, vaskulær invasjon, perinevral invasjon, tumor-infiltrerende lymfocytter og behandling. Staging var basert på amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) tumor-node-metastaser (TNM) system. Utfall av interesse var total overlevelse (OS) og histologiske tumor regresjon (TRG) i resected tarmen for saker som ble behandlet med neoadjuvant chemoradiation. OS ble definert som tiden fra diagnose til siste oppfølging eller død. TRG ble gradert basert på AJCC kriteriene, endres fra Ryan [14]: fullstendig respons med ingen levedyktige maligne celler (0), moderat respons med enkelt eller en liten gruppe av ondartede celler (1), minimal respons med resttumor vokst av fibrose ( 2) og dårlig respons med utstrakt resttumor (3). RG 0, 1 og 2 ble kategorisert som respondere og TRG tre som ikke-respondere. Oppfølging besto av regelmessige legebesøk, koloskopi, blodprøver og bildediagnostikk ved skjønn av behandlende spesialist.
For hver pasient, giver blokker av parafin innebygd vev ble hentet fra den anatomiske patologi avdeling. To kjerner, hver og en millimeter i diameter, ble oppnådd fra hvert prøvetakingssted som omfattet tumor sentrum (TC), tumor periferi (TP), normal slimhinne i nærheten av tumor (NCT) og normal slimhinne bort fra tumor (NAT). To vev kjerner fra lymfeknuter (LN) i node-positive saker ble også oppnådd. TC ble tatt fra sentrum av tumormasse, TP fra den infiltrerende /invasive svulster periferien, NCT fra normal slimhinne i umiddelbar nærhet av tumoren og NAT fra normal slimhinne i god avstand fra tumor, vanligvis ved ende kantene av reseksjon av tarmen. Disse ble overført til de forhånds boret brønner i vevet microarray (TMA) blokk ved hjelp av Beecher Manual vev arrayer-en (Sun Prairie, WI, USA). Den TMA Blokkene ble oppvarmet i 5 minutter i 60 ° C ovn for å tette hullene mellom vev kjerner og rundt parafin.
Side seksjoner tatt fra TMA ble deparaffinised med xylen, etterfulgt av absolutt alkohol, og deretter rehydreres i alkohol gradient. Antigen ble hentet i varmen på 98 ° C vannbad med Tris EDTA (pH 9,0) buffer. Endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert med H
2o
2, før inkubasjon med PLK1 primær monoklonalt antistoff fra mus (1:50 fortynning, sc17783, Santa Cruz Biotechnology). Antistoffet ble hentet og farget i henhold til tidligere utgitt metoden [15]. Linker takt med musen linker løsning, fulgt av sekundær antistoff inkubasjon (Envision polymer FLEX /HRP, Dako) forut for bruk av kromogen (Flex DAB, Dako) og kontra med haematoxylin. Ki67 var farget på Dako Autostainer hjelp av den medfølgende antistoff på 1: 100 fortynning, med varme indusert epitop gjenfinning ved pH 6,0 og 10 minutters primært antistoff inkubasjonstid
De immun Seksjonene ble undersøkt ved manuell telling av celler i. hver TMA prikk, med observatøren blindet for kliniske utfall. Andel av positive celler og fargeintensitet av PLK1 ble scoret (fig 1). Intensitet ble gradert som negative (0), svak (1+), moderat (2+) eller sterk (3+) og andelen positive celler gradert som 5% (0), 5-25% (1), 26 -50% (2), 51-75% (3) og 75% (4). Disse to tiltakene ble multiplisert for å gi vektede skårer 0-12, dikotomiserte til lav (0-5) eller høy (6-12), som beskrevet av Rodel [15]. De to score for hvert duplikat prøvetakingsstedet ble i gjennomsnitt, skaffe de endelige gjennomsnittlig vektet score (S1 Table). For Ki67, ble prosent flekker scoret, og de to score for hvert duplikat prøvetakingsstedet ble i gjennomsnitt (S1 tabell).
Høye kraft bildene viser scorene til (b) vektet score på 0, (c) vektet score på 3, fra 1 (prosent 5-25%) x 3 (sterk intensitet) og (d) vektet score på fire (prosent 75%) x 3 (sterk intensitet), merk kontrast med tilstøtende normale kjertler
Paret t-test ble brukt for å sammenligne PLK1 i TC og TP, Fishers eksakte test for assosiasjoner mellom PLK1 og clinicopathologic variabler, og Cox regresjon for OS. Kun saker med komplette data om alle de variable domener ble inkludert i de univariate og multivariate analyser. Signifikans ble satt til
p
0,05. Variabler med univariate
p
-verdi ≤0.2 ble inkludert i den innledende multivariat modell. Ikke-signifikante variabler ble fjernet iterativt og koeffisienter sjekket for å bestemme om fjerning av en variabel resulterte i en stor effekt endring for en hvilken som helst av de gjenværende variabler. Dette ble gjentatt inntil signifikante variabler holdes. Toveis interaksjoner mellom de gjenværende variablene ble sjekket for betydning og inkludert i modellen om de var betydelig. Den supremum test for proporsjonale farer antakelsen ble brukt til å bestemme om de fare funksjoner over tid var konstant. For variabler som ikke tilfredsstiller proporsjonal farer antagelse, et interaksjonsledd mellom tid og denne variabelen ble inkludert i modellen for å ta hensyn til ikke-proporsjonalitet. Undergruppeidentifiserere analyser ble utført ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte for pasienter i lymfeknute positive gruppe for å bestemme om PLK1 i den involverte noden korrelert med nodenummer (Fishers eksakte test) og med overlevelse (Cox regresjon). En annen undergruppe analyse (Fishers eksakte test) ble utført for pasienter som hadde gjennomgått neoadjuvant terapi for å finne ut om det var en sammenheng mellom PLK1 og TRG. Ki67 var korrelert med PLK1 score ved hjelp av logistisk regresjon. Dataanalyse ble generert ved hjelp av Veiledning SAS Enterprise-programvare, versjon 6.1 av SAS System for Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).
Resultater
Kjennetegn på studiepopulasjonen
To hundre og åtti-seks tilfeller ble identifisert, med en median alder på 73 år (S1 Table). Kohorten besto av 34% kvinner, 66% menn, 33% pt1 /2, 67% pT3 /4, 48% lymfeknutepositiv og 7% med metastatisk sykdom. Median oppfølgingstid var 3,1 år og 5 års OS 58%. Tjueto prosent fått neoadjuvant terapi og 30% adjuvant behandling. Adjuvant kjemoterapi besto av infusjon 5-FU, kapecitabin eller FOLFOX (5-FU og oxaliplatin). Ut av neoadjuvant terapi gruppen, 25% fikk kort-kurs (25 Gy i 5 fraksjoner, 5 Gy per fraksjon, over 5 dager) og 75% langkurs samtidig chemoradiation (45 til 50,4 Gy, 1,8 Gy per fraksjon, over fem 6 uker, med samtidig infusjon 5-fluorouracil 225 mg /m
2 /dag).
PLK1 score
Mean vektet PLK1 poengsum var 2,5 for svulst sentrum (TC) og 3,4 for tumor periferi (TP). Fordelingen av TC og TP vektede skårer er vist i tabell 1 og diskrete score vist i S1 tabell. De dikotomiserte score til positiv versus negativ vises også. TC og TP vektede skårer signifikant forskjellig (paret t-test
p
0,001). Farging i TP og TC hadde lignende andeler av 75% farging (dvs. 35%) men proporsjonene til 3+ fargingen var 14% i TC og 25% i TP. Mean PLK1 poengsum var 3,4 for NCT og 3.0 for NAT, og disse score var signifikant forskjellig (
p
= 0,025). NAT var signifikant forskjellig fra TP (
p
= 0,011), men ikke til TC (0,08), derav TP ble ansett for å være en mer nøyaktig gjengivelse av svulst flekker, og vil bli brukt her for analyser. Fordelingen av TP score er illustrert i figur 2.
Foreninger mellom PLK1 score og clinicopathological egenskaper
En assosiasjon ble funnet mellom TP score og metastatisk status, ved at pasienter med metastatisk sykdom hadde en lav TP PLK1 score i 95% av tilfellene, sammenlignet med 72% i ikke-metastatisk sykdom gruppe (tabell 2). Det var ingen andre signifikante assosiasjoner.
Survival analyserer
De 12 variabler av interesse inkludert TP PLK1 vektet score, alder, kjønn, TNM stadium, histologisk grad, vaskulær invasjon, perinevral invasjon , tilstedeværelse av tumor-infiltrerende lymfocytter, adjuvant kjemoterapi og neoadjuvant behandling. Det var 219 tilfeller med fullstendige data om alle disse domenene. Cox regresjon univariate analyser viste høyere TP PLK1 score, høyere alder, høyere svulst T stadium, metastatisk status, tilstedeværelse av vaskulær og perinevral invasjon og fravær av adjuvant kjemoterapi å være en signifikant prediktor for dårligere OS (tabell 3, figur 3). Den endelige multivariate modellen inkluderer TP PLK1 score, lymfeknutestatus, metastatisk status, et samspill mellom adjuvant kjemoterapi og vaskulær status, og en interaksjon mellom adjuvant kjemoterapi og tid (tabell 3). Høy TP PLK1 score, positiv lymfeknutestatus, og tilstedeværelse av metastaser ble funnet å være assosiert med dårligere overlevelse. Pasienter som ikke hadde fått adjuvant kjemoterapi hadde dårligere overlevelse enn pasienter som hadde fått adjuvant kjemoterapi og denne effekten ble observert å være verre for pasienter med kreft hadde vaskulær invasjon. Over tid, effekten av ikke å ha adjuvant kjemoterapi redusert, og var ikke signifikant etter 2 år for kreft uten vaskulær invasjon. Men fortsatt overlevelse betydelig verre for opp til 10 år i kreft med vaskulær invasjon (S1 figur).
Lymfeknute positive undergruppe
Mean LN PLK1 score i 105 node-positive tilfeller var 3,1. Det var ingen statistisk signifikant sammenheng mellom LN PLK1 score og antall noder som er involvert (
p
= 0,097). Men det viste seg å være en trend mellom høyere LN PLK1 score og større antall lymfeknuter med 68% av høye PLK1 score med N2 i forhold til N1 status. Det var border assosiasjoner mellom LN PLK1 score og vaskulær invasjon (
p
= 0,064), perinevral invasjon (
p
= 0,070) og histologisk grad (
p
= 0,057) .
I univariate analyser (n = 78), LN PLK1 ble ikke signifikant assosiert med overlevelse (
p
= 0,114). I multivariate analyser (n = 78), ble LN PLK1 ikke signifikant assosiert med overlevelse (
p
= 0,7083) etter justering for adjuvant kjemoterapi og vaskulær invasjon samhandling; samt adjuvant kjemoterapi og tids interaksjon.
Neoadjuvant undergruppe
Av de 57 pasientene som gjennomgikk neoadjuvant chemoradiation. Tjuetre prosent hadde TRG karakterer fra 1 til 2 (respondere) og 77% hadde TRG3 (non-respondere). Det var ingen signifikant sammenheng mellom TP PLK1 poengsum og TRG (
p
= 0,096).
Sammenhengen mellom PLK1 og Ki67
Ki67 bety score i TC, TP og LN var 9%, henholdsvis 8% og 4%. kjerner i NAT og NCT var mindre enn 1%. Logistisk regresjon viste ingen signifikant sammenheng mellom PLK1 og Ki67 i TC (
p
= 0,539), TP (
p
= 0,406) og LN (
p
= 0,413).
Diskusjoner
Mens det er en rekke publikasjoner om prognostiske effekten av PLK1 i ulike menneskelige maligniteter [6,16], er dette den første rapporten til vår kunnskap, undersøke PLK1 uttrykk i forskjellige prøvetaking områder fra samme tumor, og viste at det oppregulert PLK1 uttrykket i omkretsen av den primære tumor korrelerer med dårlig overlevelse i endetarmskreft, og er uavhengig av proliferativ Ki67.
Vi fant variabel ekspresjon av PLK1 i sentrum og periferien av den primære tumor, og i node innskudd. Sammenlignet med normal slimhinne bort fra svulsten, det perifere PLK1 stillingen var betydelig høyere. Det perifere invasive fronten ville bli rasjonalisert som mer reflektert av tumor atferd som det er mer biologisk aktive med hensyn til interaksjon med og ødeleggelse av de omkringliggende vev. Periferien av tumormasse er bedre oksygenrikt og forventes å være mer følsom for stråling i motsetning til senter som kan være iskemisk eller nekrotisk. Vi foreslår at svulsten periferien brukes som målepunktet for rektal svulst PLK1 scoring.
Vi viste at TP vektet PLK1 skår korrelert med total overlevelse, med en HR på 0,59. Den 5-årige OS var 60% i gruppen med lav PLK1 score sammenlignet med 50% i gruppen med høye PLK1 score. Betydelige variabler for å overleve inkludert alder, tumorstadium, metastatisk status og interaksjoner mellom adjuvant kjemoterapi med vaskulær invasjon, og med adjuvant kjemoterapi og tid. TP PLK1 minutter ble en uavhengig prognostisk faktor for å overleve, selv etter justering for disse variablene. Viktigere, har vi justert for adjuvant behandling. Vår median oppfølgingstid var 3,1 år, som ville være en refleksjon av lengre sikt overlevelse gitt at tre-års oppfølging er en passende endepunkt med en høy korrelasjon med totaloverlevelse ved kolorektalkreft [17].
PLK1 uttrykket er også blitt dokumentert i forløper /tidlig cancer i andre organer, slik som i ovarie cystadenoma [18] og i begynnelsen av papillær thyroideakarsinom [19] og tidligere PLK1 over-uttrykker kolorektal kreft har blitt rapportert å vise en mer radioresistant fenotype [2- ]. Vi kunne ikke bekrefte dette i våre funn, men vi erkjenner at neoadjuvant kohorten besto bare en liten del av vår studiepopulasjonen og dermed kan ikke har nok strøm til å demonstrere dette forholdet.
Vi har også undersøkt PLK1 i lymfeknuter i node-positive populasjon. Det syntes å være en trend mot en sammenheng mellom høyere LN PLK1 poengsum og høyere nodenummeret, som er i tråd med vår hypotese om at overuttrykk av PLK1 korrelerer med dårligere resultater. Men LN PLK1 korrelerte ikke signifikant med overlevelse, innenfor de begrensninger som liten undergruppe analyser.
Lav PLK1 Poengsummen ble signifikant assosiert med tilstedeværelse av metastatisk sykdom. Gitt at vår kohort besto av en liten prosentandel av metastatiske tilfeller (7%), vil den kliniske nytten av PLK1 må utforskes videre i denne pasientgruppen. Det kan bli antatt at mesteparten av metastatiske tilfeller ikke tillater oppsamling av reseksjon av vev, og derfor begrenser evnen til å detektere tilfeller med høy PLK1 farging. Større studier er nødvendig for å definere samspillet mellom PLK1 poengsum og metastatisk status med hensyn til utfall.
Vi utførte også bekreftende farging med Ki67, og viste ingen signifikant sammenheng mellom PLK1 og Ki67 farging. Derfor PLK1, men viktig i cellesyklusregulering, er ikke bare et surrogat for celledeling.
Våre funn er i samsvar med observasjonene fra cellelinje studier, hvor ny bede PLK1 aktivitet er viktig i utvinning fra G2 /M sjekkpunkt arrest etter DNA-skader. Sistnevnte hemmer PLK1 som normalt krever fosforylering i sin aktivering sløyfe treonin 210 av Bora i sortering med oppstrøms kinase. Treonin 210 fosforylering av PLK1 topper med den normale ansamling av Bora i G2-fasen. PLK1 deretter aktiverer nedstrøms mål og celler fremgang gjennom mitose [20]. Fortsatt PLK1 inaktive resulterer i forsinket adgang til mitose. I motsetning overekspresjon av konstitutivt fosforylert PLK1 overstyrer DNA-skader indusert G2 /M sjekkpunkt arrest [2,21,22]. Dette er viktig i endetarmskreft som stråling induserer doble DNA pauser. Kjemoterapi agenter som brukes i endetarmskreft, enten samtidig med stråling eller i adjuvant inkluderer 5-fluorpyrimidin som er en anti-metabolitt, og oksaliplatin som er et alkylerende middel som forårsaker kryssbindinger i DNA.
Current terapeutisk behandling av endetarmskreft kan forbedres ved tilgjengeligheten av bedre prediktive og prognostiske biomarkører. Carcinoembryonic antigen (CEA) er i dag den eneste biomarkør i National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer, som en del av baseline regi og i etterbehandling overvåking. I metastatisk setting,
K-ras
er en prediktiv markør for respons på EGFR-hemmere [23]. Våre resultater tyder på at PLK1 er et potensielt nyttig prognostisk biomarkør i endetarmskreftpasienter. PLK1 hemning er antatt å være lovende kreft terapeutisk middel. Den PLK1 inhibitor Volasertib (BI6727) har gjennomført klinisk fase II studie for å bestemme sin anti-maligne og sikkerhetsprofilene [24,25]. Andre PLK1 hemmere i utvikling inkluderer BI2536 (Axon), som hvis levert før eller etter stråling, henholdsvis kan resultere i enten økt celledød i løpet av mitotisk arrest eller økt celle restitusjon etter DNA-reparasjon i løpet av G2 sjekkpunkt arrest [13]. Videre prospektive studier som validerer den kliniske nytten av PLK1, som demonstrert her, i endetarmskreft styring er nødvendig for å forsterke våre funn og oversette dem til klinisk bruk.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. . Effekt av adjuvant kjemoterapi stratifisert etter vaskulær invasjon status over tid, HR = hazard ratio
doi: 10,1371 /journal.pone.0129313.s001 plakater (TIF)
S1 Table. Datasettet viser 286 pasienter, inkludert deres diskrete gjennomsnitts PLK1 score, Ki67 verdier, clinicopathological variabler og overlevelses utfall
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129313.s002 plakater (XLS)
