Abstract
vurderes evnen til paclitaxel, en av taxaner, for å indusere død i to prostatakreft linjer, LNCaP og PC3. Paclitaxel kjørte en apoptotisk reaksjonsvei i LNCaP, men ikke i PC3-celler, som svar på G2 /M arrest. En undersøkelse av nivåene av anti-apoptotiske proteiner avslørte at Bcl-xl var mye høyere i PC3-celler enn i LNCaP-celler og BCL2 kunne påvises bare i PC3-celler, ikke i LNCaP-celler. Knocking ned BCL-XL forbedret paclitaxel-indusert apoptose i LNCaP celler, mens vi var i stand til å slå ned BCL-XL effektivt i PC3 celler. Betydelig, en sammenligning av ABT-263, en spesifikk hemmer av BCL2 og BCL-XL, med ABT-199, en BCL2 selektiv inhibitor, avslørte at kun ABT-263, ikke ABT-199, kan indusere apoptose i LNCaP og PC3 celler. Resultatene indikerer at Bcl-xl har en beskyttende rolle mot paclitaxel-indusert apoptose i LNCaP og PC3-celler, og dets overekspresjon bevirker at paclitaxel motstand sett i PC3-celler. Det er interessant å kombineres med paclitaxel ABT-263 behandle LNCaP og PC3-celler viste synergistisk apoptose aktivering, noe som indikerer at ABT-263 kunne forbedre paclitaxel-indusert apoptose i LNCaP-celler og overvinne Bcl-xl overekspresjon å utløse paclitaxel-indusert apoptose i PC3-celler. Vi observerte også at aktivering av apoptose i LNCaP-celler var mer effektiv enn i PC3-celler i respons til paclitaxel pluss ABT-263 eller til ABT-263 alene, noe som antyder at det apoptose reaksjonsveien i PC3-celler kan ha ytterligere forskjeller fra den i LNCaP-celler selv etter BCL-XL overekspresjon er regnskaps
Citation. Wang C, Huang SB, Yang MC, Lin YT, Chu IH, Shen YN, et al. (2015) Kombinere Paclitaxel med ABT-263 har en synergistisk effekt på Paclitaxel resistent prostatakreft celler. PLoS ONE 10 (3): e0120913. doi: 10,1371 /journal.pone.0120913
Academic Redaktør: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 3 mai 2014; Godkjent: 09.02.2015; Publisert: 26 mars 2015
Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Grant EX99-9935EI (til CHC) fra National Health Research Institutes of Taiwan; Grant KMU-M103005 (til CW) fra Kaohsiung medisinsk University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
oppnådd resistens mot taksan-relaterte kjemoterapi, gjenstår et stort problem for ondartede svulster som viser en initiell terapeutisk fordel fra taxan behandling. Kreftceller med taxan motstand kan overuttrykke et multimedikamentresistens gen kodet for P-glykoprotein-pumpe for å øke utstrømningen av taxan, som fører til minimale intracellulære konsentrasjoner taxan [1]. I tillegg er endring av mikrotubul egenskaper, hovedsakelig ved å øke den dynamiske virkning av mikrotubuli etter taxan behandling, kan også endres respons til taxaner og redusere deres effekt [2,3]. Mutasjoner av tubulin gener i microtubule bindingssetet av taxaner kan endre taxan bindende affinitet, som resulterer i betydelige tap av effektivitet [4,5]. Gain-of-funksjon for å motvirke apoptotiske trasé kan også bidra til multiresistens i kreft [6,7].
Den spesifikke apoptose regulatoriske mønster i kreftceller kan være en avgjørende faktor bestemme følsomheten av kreftceller til flere ulike kjemoterapi agenter [8]. Egenverdi eller mitokondrielle apoptose skjer vanligvis i kreftceller reagerer på kjemoterapi-indusert cellesyklus arrest, inkludert legemiddelindusert mitotisk arrest [9,10]. Den BCL2 familien, som består av tre grupper av proteiner, inkludert anti-apoptotiske proteiner, pro-apoptotiske proteiner, og BH3-bare proteiner, er avgjørende for denne iboende apoptose [9]. BCL2, BCL-XL, Mcl-en og Bfl1 er anti-apoptotiske proteiner. Både Bax og Bak er pro-apoptotiske proteiner. BH3-bare proteiner er Bad, Bik, Bim, Bud, Noxa, HRK og BMF. Den anti-apoptotiske proteiner alle inneholder fire konserverte sekvensmotiver, den Bcl-2-homologi (BH) domener, som inkluderer BH1, BH2, BH3 og BH4 [10]. Deres rolle er å opprettholde integriteten til mitokondriene for understøttelse av celleoverlevelse. Den pro-apoptotiske proteiner dele bemerkelsesverdig likhet med anti-apoptotiske proteiner, spesielt i de strukturelle trekk på alle fire BH regioner, mens de forstyrrer mitokondrie integritet til å utløse apoptose. Til slutt, BH3-bare proteiner har bare en BH3 domene for å dele med hverandre og med de anti-apoptotiske og pro-apoptotiske proteiner [11]. Interessant, dette felles BH3 domenet av BH3-bare proteiner som utgjør omtrent 26-rester aminosyrer og danner en amfipatisk helix-α å samvirke med og inaktivere anti-apoptotiske proteiner [12]. Det binder muligens også forbigående Bax og Bak for deres aktivisering [13].
Nylig har flere forbindelser blitt utviklet som BH3 etterligninger å indusere apoptose gjennom hemming av anti-apoptotiske proteiner [12,14]. Så langt har de mest potente hemmere er de dårlige lignende BH3 etterlignere, ABT-737 og dens oralt aktiv analog, ABT-263 [15-17]. De binder seg til BCL-2, BCL-XL og BCL-w med meget høy affinitet, men med mye lavere affinitet til Mcl-en eller Bcl2A1 [14,18]. Prekliniske studier har vist at både ABT-737 og ABT-263 kan fortrenge de pro-apoptotiske proteiner fra den anti-apoptotiske proteiner, i samsvar med et BH3-mimetisk mekanisme for å drepe [19]. Den apoptose indusert av ABT-737 via BAX eller BAK er foreslått å være en on-target aktivitet [20]. Videre er følsomheten til celleresponsen til de BH3 peptidene av BH3-bare proteiner sterkt korrelert med følsomheten av cellene truet av ABT-737 apoptose [21]. Betydelig, har kliniske studier med ABT-263 er utført og noen nytte har blitt observert, spesielt i kronisk lymfatisk leukemi [22]. I tillegg kan både ABT-737 og ABT-263 kan brukes som verktøy for mekanistiske undersøkelser av apoptose [14,23]. Nylig ble en ny ABT, ABT-199, er utviklet med demonstrert selektivitet spesielt for BCL2 [24].
I denne studien, vi utforsket apoptotiske baner i prostatakreftceller i respons til paclitaxel, ABT- 199, ABT-263 og paclitaxel pluss ABT-263, ved hjelp av LNCaP og PC3 celler. LNCaP og PC3 representerer androgen-respons og androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinje, henholdsvis. Vi først funnet at paclitaxel forårsaket G2 /M arrest i både LNCaP og PC3 celler, men apoptose bare resultert i LNCaP celler. Videre observerte vi BCL2 og Bcl-xl overekspresjon i PC3-celler sammenlignet med LNCaP-celler, som har lave og ikke målbare nivåer av BCL-xl og BCL2 respektivt. SiRNA knockdown av anti-apoptotiske proteiner BCL-XL økt apoptose i LNCaP, men det kunne ikke bli knockdown i PC3 cellene effektivt. Vi sammenlignet evnen til ABT-199 og ABT-263 for å indusere apoptose og fant at bare ABT-263, ikke ABT-199, kan indusere apoptose. Vi viste også at paclitaxel i kombinasjon med ABT-263 hadde synergistiske effekter på apoptose i både LNCaP og PC3-celler. Dette tyder på at ABT-263 kan forbedre terapeutiske utfall for både paclitaxel-sensitive og paclitaxel-resistent prostatakreft. Aktivering av apoptose var mer effektiv i LNCaP-celler enn PC3-celler i respons til paclitaxel pluss ABT-263 eller ABT-263 alene, noe som antyder at det apoptose reaksjonsveien i PC3-celler kan avvike ytterligere fra den i LNCaP-celler selv etter Bcl-xl er utgjorde .
Materialer og metoder
Forbindelser
Paciltaxel (Sigma-Aldrich), ble ABT-199 (Selleck) og ABT-263 (Selleck) kjøpt fra kommersielle kilder som indikert . Forbindelsene ble oppløst i DMSO først og utvannet av kulturmedium i videre forsøk.
Cell kultur og synkronisering
PC3 og LNCaP celler ble kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC) i Taiwan . Cellene ble sådd ut ved 4 x 10
5-6 x 10
5 celler pr petriskål (10 cm) i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum og dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2. Cellene ble dyrket enten ikke-synkront eller synkront. For synkroniseringen, ble PC3-celler sådd ut i serumrikt RPMI 1640 medium med 2 mM tymidin og inkubert i 19 timer. Cellene ble frigjort ved vasking tre ganger med PBS og på nytt tilført friskt serumrikt medium i 8 timer. Deretter ble cellene på ny tilført friskt medium inneholdende 2 mM tymidin i 16 timer. Cellene ble vasket med PBS tre ganger før etterfølgende trinn. LNCaP-celler ble sultet i serumfritt RPMI 1640 medium i 48 timer etter å ha blitt sådd i serumrikt medium i 24 timer.
Strømningscytometrisk cellesyklusanalyse
PC3 og LNCaP-celler ble behandlet etter paclitaxel ved de angitte tidspunkter etter synkronisering i G1 /S-fasen. Cellene ble høstet ved trypsinering og /eller separeres i adherente og frittliggende fraksjoner. Cellene ble sentrifugert, vasket med PBS og samlet ved sentrifugering. Cellene ble fiksert med iskald 70% etanol i 30 min, vasket med PBS og sentrifugert for å fjerne supernatanten. Cellene ble resuspendert i PBS inneholdende 0,05% Triton X-100 og RNase A (40 ug /ml) og inkubert ved 37 ° C i 1 time, og propidiumjodid (PI) ble tilsatt til cellesuspensjonen til en endelig konsentrasjon av 50 mikrogram /ml i ytterligere 1 time inkubasjon. Cellene ble høstet ved sentrifugering, vasket med PBS og sentrifugert for å fjerne supernatanten. Til slutt ble cellene resuspendert ved PBS og analysert ved strømningscytometer (BD Biosciences) med programvare (BD Biosciences).
Immunofluorescensanalyse med en konfokalmikroskop
Om 5 × 10
4 PC3 og 1 x 10
5 LNCaP celler ble sådd ut på sterile 18 mm dekkglass. Celler ble synkronisert under de betingelser som er beskrevet ovenfor i cellen synkroniseringsseksjonen. Celler ble dyrket med forskjellige forbindelser ved de angitte tidsforløp, løst i metanol (-20 ° C, 10 min) og perforert med 0,1% Triton X100 (25 ° C, 2 min). Cellene ble blokkert i 3% bovint serumalbumin-TBS og deretter farget med primær α-Tubulin monoklonalt antistoff (Sigma-Aldrich), etterfulgt av sekundære antistoffer konjugert med fluorofor (Invitrogen). Glassene ble montert med antifade reagens med DAPI (Invitrogen) opp ned på objektglass. Konfokalmikroskopi bildene ble innhentet ved hjelp av et konfokal mikroskop system (Olympus) og forsterket hundre ganger.
apoptose analysen
Om en × 10
5 PC3 celler eller 2 × 10
5 LNCaP-celler ble utsådd på en 10 cm petriskål. Både PC3 og LNCaP-celler ble synkronisert og utsatt for de angitte sammensatte behandlingene i 48 timer. Cellene ble høstet ved trypsinering og separert i adherente og frittliggende fraksjoner. Cellene ble resuspendert og farget i 100 ul av Annexin V bindingsbuffer med 100 ug /ml propidiumjodid og 100 mikrogram /ml FITC-konjugert Annexin V-antistoff (Strong Biotech) i 15 min ved romtemperatur før FACS-analyse.
Immunoblotting
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer (250 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% NP-40, 1 mM EDTA, 10 mM β-glycerofosfat, 0,1 mM Na
3VO
4H, en tablett protease inhibitor cocktail, 1 mM NaF, 50 mM HEPES, pH 7,4, i 50 ml). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved en BCA Protein Assay Kit (Pierce). Omtrent 100 ug protein per brønn ble underkastet SDS-PAGE. Etter elektroforese ble proteinene overført til et nitrocellulosemembran. De overførte Membranene ble blokkert i 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk eller 5% (w /v) BSA i TBS (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) med 0,1% (v /v) Tween 20 og probet for det første antistoff, fulgt av inkubering med et sekundært antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (anti-kanin-anti-mus; Jackson Immunoresearch) og visualisering med et deteksjonssett (Pierce) ved fotografisk film utvikling. De første antistoffene som anvendes i denne studien var som følger: anti-actin-antistoff (Millipore), anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og -α-tubulin-antistoff (GeneTex), anti-Bcl-xl-antistoff (Abcam), anti-Bak, -Bax, -Bcl2, -Bim, -caspase 3, -caspase 3 (A), – kaspase 7 (A), – Mcl-1, -poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og PARP- (C) antistoff (Cell Signaling). Immunoblotanalyse bildene ble kvantifisert ved kvantitativ programvare (NIH).
Coimmunoprecipitation
Totalt cellelysater av paclitaxel-behandlede eller kontrollere LNCaP eller PC3 celler ble utarbeidet i Chaps buffer (5 mM MgCl
2, 137mm NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Chaps, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5)), og protease-inhibitorer. Omtrent 500 ug av proteiner ble immunopresipitert med Bcl-xl-antistoff (Abcam) ved 4 ° C i 2 timer. Immunopresipitater ble tatt av 50 ul av slurryen fra protein A-magnetiske kuler (Millipore) i Chaps-buffer ved 4 ° C over natten. Immunopresipitater ble deretter gjenvunnet ved magnetisk stativ og vasket tre ganger i 1% Chaps buffer. Immunutfelninger ble eluert ved SDS-PAGE prøvebuffer ble utsatt for SDS-PAGE og deretter immunblotting.
BCL-XL, Bim og Mcl-en slå ned av siRNA
PC3 eller LNCaP cellene sådd ut ved 4 x 10
5-6 x 10
5 celler pr petriskål (10 cm) i 24 timer i 7 ml RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum og dyrket ved 37 ° C under 5% CO
2. Bim (Qiagen), Bcl-xl og MCL-1 (Invitrogen) siRNA ble preinkubert i 1 ml kulturmedium uten serum før transfeksjon, og deretter 40 ul transfeksjon reagens (Qiagen) ble tilsatt til det samme kulturmedium, blandet ved vortex og inkubert i 5 ~ 10 min ved romtemperatur for å tillate dannelse av kompleksene transfeksjonsteknikker. Den endelige siRNA konsentrasjonen var ca 5 til 10 nM etter tilsetting kompleksene dråpevis til PC3 og LNCaP celler. Etter 24 timer ble PC3 og LNCaP celler behandlet med 50 nM av paclitaxel og høstet ved de angitte tidsforløp.
Statistisk analyse
En paret t-test ble brukt til å vise den statistiske betydningen av resultatene med Sigmaplot 10. ** P 0,01 ble betraktet som signifikant. Data fra to uavhengige eksperimenter ble analysert.
Resultater
paklitaxel til mitotisk arrest i G2 /M i både PC3 og LNCaP celler
Synkroniserte PC3 eller LNCaP cellene ved G1 /S ble behandlet med 50 nM paclitaxel i løpet av forskjellige tids kurs og høstet for cellesyklusanalyse med flowcytometri. Vi har funnet at cellesyklusen fortsatte i PC3-celler normalt gjennom S-fasen og ble arrestert på tidspunktet mellom 8 og 12 timer (fig. 1A). På grunn av den langsomme proliferasjonsrate, LNCaP celler tok lenger tid enn PC3 å svare på sammensatte behandling, viser cellesyklus arrest mellom 36 og 48 timer (Fig. 1a).
(A) flowcytometrisk analyse av synkronisert PC3 eller LNCaP celler behandlet av paclitaxel gjennom de angitte tids kurs. Analyser var i tre eksemplarer og representative histogrammer vises. X- og Y-akser representerer DNA-innhold og antall celler, respektivt. (B) Immunofluorescensanalyse mikrograf av mikrotubuli fra synkroniserte PC3 eller LNCaP celler behandlet med paclitaxel i løpet av de angitte tidsforløp. Analysene ble duplisert og representative immunfluorescens mikroskopi vises. a-Tubulin ble vist av grønn farge. DNA ble vist av rød farge.
Så overvåket vi oppførselen til både mikrotubuli og kromosomer ved immunfluorescens bildebehandling med en konfokalmikroskop over samme tid kurset. Vi observerte at paclitaxel påvirket mikrotubuli ved 4 timer og 8 timer i PC3 celler, viser unormalt tett microtubule fordeling rundt kjernen (Fig. 1B). Disse unormale mikrotubuler mistet evnen til å utføre normal spindelenheten, noe som resulterer i tette multipolar spindlene ved 12 timer (fig. 1B). Effekten av paclitaxel på LNCaP-celler lignet effekten på PC3-celler (Fig. 1B). Ikke desto mindre, på grunn av den lange tid duplisering av LNCaP, unormal spindel-dannelse i LNCaP-celler oppsto mye senere enn i PC3-celler (Fig. 1B).
Resultatene antydet at celler behandlet med paclitaxel kan fortsatt gå fremover igjennom G2 og sannsynligvis gå inn G2 /M for å danne det defekte spindel kromosom kompleks som deretter forårsaket cellesyklus-stans i denne fasen.
Paclitaxel kjørte en apoptotisk respons gjennom kaspase-avhengige apoptotiske baner i LNCaP, men ikke i PC3 celler i respons til G2 /M arrestere
Paclitaxel forårsaket cellesyklus-stans i G2 /M, omkring 8-12 timer i PC3-celler og 36-48 timer i LNCaP-celler. Deretter undersøkte vi de apoptotiske responser utløst av paclitaxel ved å vurdere aktivering av caspase 3 og degradering nivået av PARP. Våre resultater viser at paclitaxel forårsaket aktivering av caspase 3 og PARP nedbrytning i LNCaP celler for å komme først i 48 timer, rett etter G2 /M arrest, og nådde et betydelig nivå på 72 timer (fig. 2A). I motsetning til dette har vi oppdaget at hverken aktiveringen av caspase 3 eller nedbrytningen av PARP i PC3-celler av paclitaxel ved G2 /M arrest (fig. 2A). Således konkluderte vi med at paclitaxel aktiveres en apoptotisk respons høyt svarende til sin effekt på G2 /M arrest i LNCaP-celler, men ikke i PC3-celler.
(A) Immunoblot-analyse av cellelysater fra synkroniserte LNCaP og PC3-celler behandlet av paclitaxel i løpet av de angitte tids kurs for påvisning av caspase 3 og PARP med sin nedbrytningsprodukt. (B) Immunoblot-analyse av cellelysater fra adherert eller frittliggende fraksjoner av LNCaP eller PC3-celler etter behandling paclitaxel i løpet av tidsforløp for påvisning av spaltingen form av PARP. Forsøkene ble gjentatt tre ganger, og representative resultater er vist. PARP (c). Spalting form av PARP
Paclitaxel forårsaket dødsfallet til PC3 celler kun i frittliggende status
Vi fant at paclitaxel ikke aktivere en apoptotisk respons svarende til G2 /M arrest i PC3 celler. Hva er skjebnen til PC3 cellene fast i denne fasen? Etter behandling paclitaxel, ble det observert at noen LnCap eller PC3 cellene løsnet fra bunnen av kulturskålen. Dermed har vi høstet celler etter inkubasjon med forbindelsene over forskjellige tids kurs, og samlet inn og analysert levd og frittliggende celler separat. Vi så i nedbrytningen av PARP i levd og frittliggende fraksjoner av LNCaP og PC3 cellene ved ulike tids kurs. Spaltningen form av PARP dukket opp i adherert og frittliggende fraksjoner av LNCaP-celler (Fig. 2B). Denne formen bare dukket opp i frittliggende brøkdel av PC3 celler på 48 timer (Fig. 2B).
Vi utførte også Annexin-V-FITC /PI flekker å evaluere celledød i LNCaP eller PC3 celler. De fleste levd PC3 cellene forble i live, mens levd brøkdel av LNCaP celler viste en betydelig prosentandel falle i tidlig apoptose (S1 fig.). For frittliggende fraksjon, LNCaP og PC3 cellene dukket opp i slutten av apoptose og nekrose (S1 fig.).
Vi konkluderte med at tidspunktet for tidlig apoptose i levd brøkdel av LNCaP celler tilsvarer G2 /M arrest mens de PC3 cellene gjorde faktisk vise motstand fenotype til paclitaxel behandling. Dødsfallet i frittliggende fraksjoner av LNCaP og PC3 virket relatert til celle avløsning samt cellulære stress forårsaket av paclitaxel.
Uttrykk av Bim, Bak, Bax, BCL2, BCL-XL og Mcl-en i LNCaP og PC3 celler etter behandling med paclitaxel
for å spørre hvorfor caspase 3-avhengig apoptose skjer i LNCaP, men ikke i PC3 celler, som svar på G2 /M arrest, vi sjekket proteinnivået Bim, Bak, Bax, BCL2, BCL-XL og Mcl-en. Våre resultater viste at proteinnivået Bim redusert over tid etter paclitaxel-behandling i LNCaP og PC3-celler (fig. 3A). I motsetning til dette ble proteinnivået i Bak, Bax, Bcl-xl og Mcl-1 ikke endres vesentlig under de samme betingelser (fig. 3A og B). Vi kunne ikke finne noen BCL2 proteiner i LNCaP-celler (fig. 3B). Interessant, PC3-celler uttrykte en betydelig mengde BCL2 proteiner med eller uten paclitaxel behandling (Fig. 3B). Vi deretter sammenlignet proteinnivået Bim, BCL-XL og Mcl-en mellom LNCaP og PC3 celler. Resultatene avslørte at ekspresjonen av Bcl-xl og Mcl-1 i PC3-celler er mye høyere enn i LNCaP-celler (fig. 3C). Derfor kan overekspresjon av BCL2, Bcl-xl og Mcl-1 i PC3-celler bidrar til deres paclitaxel motstand.
(A) Ekspresjon av BH3-bare protein Bim og pro-apoptotiske proteiner inkludert både Bak og Bax, i LNCaP og PC3 celler. (B) Ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner, inkludert BCL2, Bcl-xl og Mcl-1 i LNCaP eller PC3-celler. Immunoblot-analyse av cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet med paclitaxel over tid som indikert. Forsøkene ble gjentatt tre ganger, og representative resultater er vist. (C) Sammenligning av Bim, BCL-XL og Mcl-en mellom LNCaP og PC3 celler med /uten paclitaxel behandling. Immunoblot-analyse av cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet i 48 timer. Forsøkene ble gjentatt tre ganger, og representative resultater er vist. Immunoblotanalyse bilder av Bim, BCL-XL, Mcl-1 og α-tubulin i LNCaP og PC3 med /uten paclitaxel behandling ble kvantifisert ved ImageJ. De lettleselig, definert som vilkårlige lykter, av Bim, BCL-XL og Mcl-en normalisert til avlesning av α-tubulin vises på høyre side. (**) Statistisk signifikans mellom to avlesninger.
Bim nivået av LNCaP eller PC3 celler sunket dramatisk etter paclitaxel behandling, og korrelert med celledød (Fig. 3A). Vi spurte hvorfor nivået av Bim ble betydelig redusert etter paclitaxel behandling. Igjen, vi samlet og analysert data for de levd og frittliggende celler separat. Redusert Bim bare dukket opp i frittliggende fraksjon, mens den holdt seg konstant i holdt fraksjon i både LNCaP og PC3 celler etter paclitaxel behandling (S2 fig.). Dermed kan den reduserte Bim nivået ikke være knyttet til sin rolle i den apoptotiske sti.
Deretter spurte vi om Bim innebærer i paclitaxel-indusert apoptose veien i prostatakreft ved RNAi knockdown og coimmunoprecipitation, siden Bim er en hoved~~POS=TRUNC BH3-bare protein nødvendig for paclitaxel-indusert apoptose i bryst kreft [25]. Forskjellig fra brystkreft, våre resultater viste at Bim knockdown ikke kan påvirke paclitaxel-indusert apoptose i LNCaP celler (S3 fig.). Dessuten ble det ikke observert signifikant interaksjon mellom Bim og BCL-XL i IP (S3 fig.). Disse resultatene antydet at Bim ikke kan være en viktig BH3-bare protein ansvarlig for paclitaxel-indusert apoptose i prostatakreft.
BCL-xl eller Mcl-en knockdown øker apoptose i LNCaP celler, men ikke PC3 celler
for å spørre om overekspresjon av BCL2, BCL-XL og Mcl-en i PC3 cellene kan bidra til deres paclitaxel motstand, må vi først utforsket hvem av dem som kan engasjere seg i apoptotiske sti. Resultatene viste at Bcl-xl knockdown etter siRNA betydelig økt aktivering av kaspase 3 og nedbrytningen av PARP i LNCaP-celler (fig. 4). Mcl-1 knockdown også økt aktivering av kaspase 3 og nedbrytningen av PARP i LNCaP-celler, men dens effekt var ikke så god som Bcl-xl knockdown (fig. 4). Disse resultatene antydet at Bcl-xl kan være en viktig faktor som påvirker den paclitaxel-indusert apoptotisk reaksjonsvei i LNCaP-celler.
Bcl-xl og Mcl-1 knockdown forårsaket økt apoptose som vurdert ved aktiveringen av caspase 3 og PARP degradering i LNCaP-celler, men ikke i PC3-celler. LNCaP eller PC3 celler ble transient transfektert med Bim, BCL-XL eller Mcl-en siRNA eller egge siRNA i 24 timer. Celler ble behandlet med /uten 50 nM paclitaxel i 48 timer, og deretter utsatt for immunoblot-analyse. Caspase 3 (a): den aktive formen av caspase 3. PARP (c): spaltingen form av PARP. BCL-XL (er): kort eksponering bildet av BCL-XL. BCL-XL (l): lang eksponering bildet av BCL-XL. Forsøkene ble gjentatt tre ganger, og representative resultater er vist. De respektive avlesninger fra immunoavtrykket bilder av Bcl-xl, Mcl-1 og kaspase 3 (a) normalisert til a-tubulin i LNCaP-celler er vist nederst. Bare knockdown med /uten paclitaxel behandling ble kvantifisert. (**) Statistisk signifikans mellom to avlesninger.
Vi utførte de samme analysene i PC3 cellene. Vi hadde problemer med å slå ned BCL-XL effektivt i PC3 celler, sannsynligvis på grunn av det høye nivået av dette proteinet (Fig. 4). I motsetning til dette ble proteinnivået av Mcl-en signifikant redusert ved sin siRNA men dette knockdown hadde ingen virkning på aktiveringen av caspase 3 og nedbrytningen av PARP i PC3-celler (fig. 4).
overekspresjon av BCL-XL bidro mest til paclitaxel resistent fenotype i PC3 cellene
Siden vi ikke kunne effektivt slå ned BCL-XL for å evaluere dens effekt på paclitaxel-indusert apoptose i PC3 celler, vår alternativ tilnærming var å bruke ABT -263 for kjemisk knockdown av BCL2 og BCL-XL samtidig. Videre brukte vi ABT-199, en spesifikk hemmer av BCL2, å skille mellom BCL2 og BCL-XL i PC3 celler. Ved hjelp av ABT-263 indusert nedbrytning av PARP og aktiveringen av caspase 3 i både LNCaP og PC3-celler (Fig. 5A). Effekten av ABT-263 på LNCaP-celler var omtrent tre ganger større enn for PC3 i form av kaspase 3 aktiveringen (Fig. 5A). Betydelig, gjorde ABT-199 ikke vise noen apoptotisk effekt på verken LNCaP og PC3 celler, utelukker en anti-apoptotiske rolle BCL2 i PC3.
(A) ABT-263, men ikke ABT-199, kunne effektivt utløse PARP degradering i LNCaP og PC3-celler på en doseavhengig måte, men det kan bare aktiveres kaspase 3 til et påvisbart nivå i LNCaP-celler. Immunoblot-analyse av cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet med ABT-199 eller ABT-263 alene i 48 timer ved forskjellige konsentrasjoner ble analysert som angitt. Caspase 3 (a): den aktiverte formen av caspase 3. kaspase 7 (a): aktivering form av caspase 7. Eksperimentet ble gjentatt tre ganger, og representative resultater er vist. De avlesninger av caspase 3 (a) normalisert til GAPDH mellom LNCaP og PC3 celler behandlet med 5 uM av ABT-263 er vist nederst. (**) Statistisk signifikans mellom to avlesninger. (B) Kombinasjonen av 50 nM av paclitaxel med forskjellige konsentrasjoner av ABT-263 hadde en synergistisk effekt på apoptose i både LNCaP og PC3-celler. Effekten av ABT-263 i kombinasjon med paclitaxel i LNCaP cellene var høyere enn i PC3 celler. Immunoblot-analyse av cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet med paclitaxel i kombinasjon med ABT-263 eller ABT-263 alene i 48 timer ved forskjellige konsentrasjoner ble analysert som angitt. Caspase 3 (a): den aktiverte formen av caspase 3. kaspase 7 (a): aktivering form av caspase 7. Eksperimentet ble gjentatt tre ganger, og representative resultater er vist. De respektive avlesninger av caspase 3 (a) normalisert til intern kontroll, α-tubulin eller GAPDH i LNCaP eller PC3 med LNCaP vises nederst. (**) Statistisk signifikans mellom to avlesninger.
Sammen tyder resultatene på at BCL-XL er den viktigste faktoren i apoptose og dens overekspresjon bidrar til motstanden fenotype til paclitaxel behandling i PC3 celler. Videre fant vi også at PC3 celler viser delvis motstand mot ABT-263 behandling hvis responsen LNCaP til samme behandling er ansett som en full respons.
Kombinasjonen av ABT-263 med paclitaxel vist synergistisk effekt på apoptose i både LNCaP og PC3 cellene
Vi har vist at ABT-263 alene kan kjøre paclitaxel-sensitive og paclitaxel-resistente celler mot apoptose, selv om paclitaxel-sensitive LNCaP cellelinje viser bedre effekter enn paclitaxel- motstandsdyktig PC3 cellelinje. Vi evaluerte ytterligere kombinasjonen effekten av ABT-263 med paclitaxel. Betydelig våre resultater viste at ABT-263 i kombinasjon med paklitaxel hadde en synergistisk effekt på apoptose i både LNCaP og PC3-celler (fig. 5B). Imidlertid er effekten av denne kombinasjonsbehandlingen var større i LNCaP-celler enn i PC3-celler (Fig. 5B).
Synergien mellom paclitaxel og ABT-263 for aktivering av apoptose tydelig vist at ABT-263 kan motvirke BCL-XL i paclitaxel-sensitive og paclitaxel-resistente prostata kreft celler. Målretting av anti-apoptotiske proteiner har potensiale til å forbedre kjemoterapi for prostatakreft. Men forskjellen i apoptose aktivering mellom LNCaP og PC3-celler for ABT-263 alene eller ABT-263 i kombinasjon med paklitaxel antydet at apoptose reaksjonsveien i PC3-celler kan avvike ytterligere fra den i LNCaP-celler selv etter Bcl-xl er redegjort for.
Diskusjoner
i vår studie paclitaxel utløst tidlig apoptose i tilhenger brøkdel av LNCaP celler i respons til G2 /M arrest. I motsetning til dette kunne tidlig apoptose ikke påvises i den samme fraksjon av PC3-celler over hele tidsforløpet, hvilket antyder at PC3-celler ikke svare på G2 /M rest for å starte denne død-programmet. Interessant, skjedde PC3 celledød i en enebolig status etter paclitaxel behandling hovedsakelig gjennom nekrose. Videre, Bim nivå bare redusert i den frittliggende del av begge celler etter paclitaxel-behandling. Hvorvidt nedgang på Bim nivåer er knyttet til celledød i frittliggende forholdene fortsatt gjenstår å løses. En annen studie viste at Bim knockdown i prostata og brystkreft celler forårsaket celle løsrivelse og til slutt apoptose [26]. Vi har imidlertid ikke observere fenomenet som beskrives i rapporten.
Enten celle avløsning kan skje
in vivo
i anti-mitotiske terapi er en interessant problemstilling som gjenstår å fastslå. Logisk, kan kreftceller omgitt av bindevev være svært vanskelig å løsne fra kreftvev etter anti-mitotisk kjemoterapi. Dermed blir celledød som følge av G2 /M arrest i en klebet status det kritiske punkt for å bedømme hvorvidt cellene er sensitiv eller resistent mot behandling med paclitaxel. I denne studien, viste vi at LNCaP celler utviser følsomhet for paclitaxel behandling, mens PC3 cellene vise motstand.
Vi viste også at overekspresjon av Bcl-xl kan bidra til apoptose-resistent fenotype av PC3 celler. Det virker som om apoptose signal indusert av paclitaxel behandling kan være ikke tilstrekkelig til å motvirke overekspresjon av anti-apoptotiske proteiner som BCL-XL i PC3 celler. Dette spekulasjon er videre støttet av en kombinasjon av paclitaxel med ABT-263 som hadde synergistiske effekter på aktiveringen av caspase 3 og nedbrytningen av PARP sammenlignet med paclitaxel eller ABT-263 alene.
faktisk en studie har pekt ut på at overekspresjon av Bcl-xl i høy grad prostatakarsinom er forbundet med en hormon ildfast fenotype [27].
