Abstract
Mål
MAP4K5 spiller en viktig rolle i å regulere en rekke cellulære responser, og er involvert i Wnt signal i hematopoetiske celler. Imidlertid har sine funksjoner i menneske malignitet ikke undersøkt. De viktigste målene for denne studien er å undersøke uttrykk, funksjoner og klinisk betydning av MAP4K5 i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC).
Materialer og metoder
uttrykk nivåer av MAP4K5, E-cadherin , vimentin, og karboksylesterase 2 (CES2) ble undersøkt ved immunhistokjemi i 105 PDAC og matchet ikke-neoplastiske bukspyttkjertel prøver fra vår institusjon. De RNA sekvense data for 112 PDAC pasienter ble lastet ned fra TCGA data portal. Immunoblotting og RNA sekvensering analyse ble brukt for å undersøke uttrykk for MAP4K5 og E-cadherin i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Effekten av knockdown MAP4K5 hjelp siRNA på uttrykk for CDH1 og vimentin ble undersøkt av Real-time RT-PCR i Panc-1 og ASPC-1 celler. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av IBM SPSS Statistics.
Resultater
MAP4K5 protein uttrykkes ved høye nivåer spesielt i bukspyttkjertelen duktale cellene i 100% ikke-neoplastiske bukspyttkjertel prøver, men er redusert eller tapt i 77,1% (81/105) av PDAC prøver. MAP4K5-lav korrelert med tap av E-cadherin (P = 0,001) og redusert CES2 uttrykk (P = 0,002) i våre pasientpopulasjoner. Uttrykket nivåer av MAP4K5 mRNA direkte korrelert med uttrykket nivåer av CDH1 mRNA (R = 0,2490, p = 0,008) i den andre kohort av 112 PDAC pasienter fra Kreft Genome Atlas (TCGA) RNA-seq datasett. ble observert lignende sammenhenger mellom uttrykket av MAP4K5 og E-cadherin både protein og mRNA nivåer i flere bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Knockdown MAP4K5 førte til redusert CDH1 mRNA uttrykk i Panc-1 og ASPC-1 celler. MAP4K5 lavt korrelerte signifikant med redusert total overlevelse og var et selvstendig prognosticator hos pasienter med stadium II PDAC.
Konklusjoner
MAP4K5 uttrykk er redusert eller tapt i flertallet av PDACs. De sterke assosiasjoner mellom lav MAP4K5 uttrykk og tap av E-cadherin, redusert CES2 uttrykk og redusert total overlevelse kan foreslå en viktig rolle MAP4K5 i epitelial til mesenchymale overgang, kjemoterapi motstand og tumorprogresjon i bukspyttkjertelkreft. Målrette svekket MAP4K5 signale kan representere en ny terapeutisk strategi for kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Wang OH, Azizian N, Guo M, Capello M, Deng D, Zang F et al. (2016) Prognostic og funksjonelle betydningen av MAP4K5 i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 11 (3): e0152300. doi: 10,1371 /journal.pone.0152300
Redaktør: Murray Korc, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 28 juli 2015; Godkjent: 12 mars 2016; Publisert: 29 mars 2016
Copyright: © 2016 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Pasienten kliniske og overlevelsesdata brukt i denne studien er beskyttet informasjon ved HIPAA (Health Insurance Mobilitet og Accountability Act of 1996) og mennesker forskning (45 CFR 46) fra US Department of Health Menneskelig service. Denne studien er styrt av strenge IRB-protokollen ved UT MD Anderson Cancer Center, som forbyr forfatterne fra å gjøre minimale datasettet offentlig tilgjengelig. Dataene er tilgjengelige fra University of Texas Data Access /etiske komité for forskere som oppfyller kriteriene for å få tilgang til konfidensielle data ([email protected])
Finansiering:. Forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige sykdommene blant alle menneskelige kreftformer med bare 6% av. pasienter i live 5 år etter diagnose [1]. Foreløpig er kreft i bukspyttkjertelen den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA [2]. På grunn av mangel på tidlig oppdagelse, effektiv behandling, og forebygging for kreft i bukspyttkjertelen, har det blitt spådd at kreft i bukspyttkjertelen vil bli den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA innen 2030 [3].
kreft i bukspyttkjertelen er godt kjent for sine sub-optimale respons på konvensjonell kjemoterapi og strålebehandling. Overvinne legemiddelresistens har vært en av de største hindringene for å forbedre kliniske resultater for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen [4, 5]. Det er blitt vist at epitelial-mesenkymale overgang (EMT) bidrar med, i det minste delvis, til den terapeutiske motstanden av kreft i bukspyttkjertelen [5, 6]. EMT spiller viktig rolle under embryogenese, sårheling og tumorprogresjon og er karakterisert ved tapet av epiteliale markør E-cadherin og oppnå ekspresjon av mesenchymale markører slik som N-cadherin, vimentin og fibronektin etc. undertrykkelse av epitelial fenotype og forsterkning av mesenchymale fenotype er regulert av mange molekyler, inkludert master transkripsjonsfaktorer regulatorer, sneglen, Slug, Twist, og Zeb-1 [7, 8]. De molekylære mekanismer for EMT regulering i bukspyttkjertelkreft fortsatt uklare.
mitogen-aktivert protein (MAP) kinase pathway spiller en viktig rolle i mutante Kras-drevet bukspyttkjertelen tumorigenesis og er involvert i regulering av EMT gjennom trans vekst faktor beta (TGFp) [9]. MAP4K5, også kalt germinal sentrum kinase-relaterte (GCKR) eller kinase homolog til STE20 (KHS1), tilhører pattedyr Ste20 lignende serin /treonin kinase familien. Innenfor denne kinase familie, er både HPK1 (også kalt MAP4K1) og MAP4K5 gruppert i germinal sentrum kinase familien og funksjon som MAP4Ks i at de aktiverer MAP3Ks, som signaliserer gjennom veletablerte MKK4 /MKK7, c-Jun N-terminal kinase (JNK), eller stress-aktivert proteinkinase (SAPK) kaskader [10, 11]. Nyere studier viser at HPK1 kan fungere som en roman tumor suppressor i bukspyttkjertelkreft. Den progressive tap av HPK1 protein mediert av 26S proteasomet er sterkt assosiert med progresjon fra tidlig bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi til invasiv bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC). Restaurering av HPK1 protein uttrykk i PDAC celler enten ved proteasominhibitor eller knockdown Fbxw8 forårsaker cellesyklus arrest og hemmer PDAC cellevekst, som er formidlet gjennom stabilisering av p21 og p27 [12, 13]. På den annen side er MAP4K4 overuttrykt i de fleste humane kreftceller, inkludert kreft i bukspyttkjertelen og fremmer tumorcelle-migrering og invasjon [14-16]. Overekspresjon av MAP4K4 er assosiert med dårlig prognose hos pasienter med stadium II PDAC etter pancreaticoduodenectomy [16]. Disse studiene tyder på den funksjonelle betydningen av MAP4K proteiner i bukspyttkjertelkreft. Imidlertid har uttrykket og funksjoner av MAP4K5 i kreft ikke blitt undersøkt. I denne studien undersøkte vi uttrykket av MAP4K5 ved immunhistokjemi i PDAC og matchet ikke-neoplastiske bukspyttkjertel prøver fra 105 pasienter som gjennomgikk pancreaticoduodenectomy ved vår institusjon. Vi korrelert resultatene av MAP4K5 uttrykk med clinicopathologic funksjoner, total overlevelse, EMT markører (E-cadherin, vimentin) og karboksylesterase 2 (CES2). Vi validert våre funn i en annen uavhengig kohort av 112 PDAC pasienter fra Kreft Genome Atlas (TCGA) database og i humane PDAC cellelinjer. I tillegg undersøkte vi effekten av MAP4K5 knockdown hjelp siRNA på uttrykk for EMT markører i PDAC cellelinjer. Våre resultater kan tyde på at tapet av MAP4K5 ekspresjon spiller en rolle i EMT, kjemoterapi motstand og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen. Dermed rettet mot svekket MAP4K5 signalveier kan bidra til å overvinne narkotika motstand for kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Pasient befolkningen
Vår studiepopulasjon besto av 105 pasienter (57 menn og 48 kvinner) med stadium II PDAC som gjennomgikk bukspyttkjertel reseksjon med kurativ hensikt ved vår institusjon. Pasientens alder varierte fra 24,9 til 84,8 år (median alder: 64,2 år). Pancreaticoduodenectomy, distal pancreatectomy, og total pancreatectomy ble utført i 86, 17 og 2 pasienter, henholdsvis. Det er ingen pasienter fikk pre-operative neoadjuvant kjemoterapi og /eller strålebehandling. Pasienter som gjennomgikk pancreatectomy for karsinomer i tolvfingertarmen, ble ampulla av Vater, felles gallegang eller andre typer bukspyttkjertelen svulster ekskludert. Tre pasienter med stadium IV sykdom ble også ekskludert fordi antall saker for stadium IV sykdom var for liten til å være representative. Skriftlig samtykke fra alle pasienter ble oppnådd. Denne studien og immunnohistochemistry ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Texas MD Anderson Cancer Center.
Tissue microarray konstruksjon
bukspyttkjertelkreft microarray ble bygget som tidligere beskrevet ved hjelp av en vev microarrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) [17]. Kort, representative områder av svulsten og matchet ikke-neoplastisk bukspyttkjertelen vev ble valgt basert på gjennomgang av hematoxylin og eosin (H E) farget lysbilder. De tilsvarende formalinfiksert parafin innebygd vevsblokker ble hentet. For hver pasient ble to 1,0 mm kjerner fra representative områder av svulsten og en 1,0 mm kjerne av de matchet ikke-neoplastiske bukspyttkjertelen brukes for tissue microarray konstruksjon.
Immunohistochemistry
Immunohistokjemiske flekker var utføres på 5,0 um ufargede seksjoner fra vev mikromatriseblokker som tidligere rapportert [18, 19] ved hjelp av følgende antistoffer: MAP4K5 (ab56848, Cambridge, MA, 1: 400 fortynning); E-cadherin (Life Technologies, klone HECD-en, Camarillo, CA, 1: 7000 fortynning); vimentin (DAKO klone V9, Carpeninteria, CA, 1: 900 fortynning) og anti-karboksylesterase 2 (CES2, Sigma Aldrich, HPA018897, St. Louis, MO, 1: 1000 fortynning). I korte trekk, ble antigen gjenfinning utføres ved behandling i en dampkoker i 25 minutter, etterfulgt av en standard indirekte immunoperoxidase prosedyre (ABC-Elite, Vector lab, Burlingame, CA). Immunhistokjemiske fargede objektglass ble evaluert uavhengig av to patologer (M. G. og H.W.). Basert på fargeintensitet, ble ekspresjonen av MAP4K5 kategorisert som MAP4K5-lav (negativ eller svak cytoplasmatisk farge i tumorceller) eller MAP4K5-høy (moderat eller sterk cytoplasmatisk farge i tumorceller) siden alle tumorene var enten diffust positiv eller negativ for MAP4K5. Den ekspresjon av E-cadherin ble kategorisert som E-cadherin-høy (≥50% tumorceller med membran farging) eller E-cadherin-lav ( 50% av tumorcellene med membranfarging) som tidligere beskrevet [6, 20] . Ekspresjon av vimentin ble kategorisert som positive hvis cytoplasmatisk farge for vimentin ble detektert i noen cancerceller eller negativ hvis tumoren viste fullstendig negativ farging for vimentin som tidligere rapportert [20]. Uttrykket av CES2 ble klassifisert som CES2-lav og CES2-high med de kriteriene som tidligere beskrevet [21].
The Cancer Genome Atlas (TCGA) RNA sekvensedataanalyse
Nivå 3 RNA sekvensering (RNA-seq) data generert ved hjelp av Illumina HiSeq 2000 RNA sekvense versjon 2 plattformen på 112 pancreatic ductal adenokarsinom pasienter ble lastet ned fra TCGA data portal (https://tcga-data.nci.nih.gov). De enkelte RNA-seq prøve uttrykk filer ble samlet i et datasett ved hjelp av R versjon 3.1.1 og R-studio v0.98.1062. Genekspresjon nivå ble bestemt ved bruk RSEM normaliserte lese teller.
Cell kultur og immunoblotting
Menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer MIA PACA-2, Panc-1, ASPC-en, CFPAC-en, Panc -3, L3.6PL, MPanc-96, BxPC-3, SW1990, SU.86.86, Hs 766T, Panc 03,27, HPAF-II og CAPAN-2 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) og ble dyrket enten i Dulbeccos modifiserte Eagles medium eller i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Den HPDE cellelinje, en udødeliggjort human pancreatic ductal cellelinje, var en generøs gave fra Dr. Ming-Sound Tsao [22]. Proteinene i helcellelysater ble separert ved 10% SDS-PAGE, elektroblottet på PVDF-membraner (Novex, San Diego, CA), blokkert i 5% skummet melk i 1x TBS, og probet med følgende primære antistoffer mot MAP4K5, E -cadherin, og aktin. De 293T celler transfektert med MAP4K5 cDNA konstruere lagret som en positiv kontroll for MAP4K5 immunoblotting. Proteiner ble påvist ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens (ECL) (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
RNA-sekvensanalyse
RNA-ekstraksjon ble utført ved anvendelse av RNeasy Maxi Kit (Qiagen) fra 11 menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (BxPC-3, SW1990, SU.86.86, Panc-1, Hs 766T, CFPAC-en, MIA PACA-2, ASPC-en, Panc 03,27, HPAF-II og CAPAN-2). RNA-Seq biblioteker ble fremstilt ved anvendelse av standard Illumina reagenser og protokoller. Parvise end sekvensering med lese lengde på 50 baser ble utført på Illumina HiSeq 2000 plattformen etter produsentens anvisninger. Casava 1.8.2 ble brukt til å Demultiplekse og for å generere FASTQ filer. De sekvense Dataene ble analysert ved hjelp av programvarepakker for Tophat (Trapnell C, et al. Bioinformatikk 2009) kartlegging mot hg19 og mansjettknapper (Trapnell C, et al. Nat Biotechnol 2010). Antallet leser var normalisert og uttrykt som fragmenter per kilobase av exon per million fragmenter kartlagt [23].
knockdown av MAP4K5 uttrykk ved hjelp av siRNA og Real-time RT-PCR-analyse
Panc- 1 eller ASPC-1-celler ble sådd ut på 100 mm skåler og transient transfektert med Dharmacon SMARTpool kontroll og MAP4K5 siRNA ved sluttkonsentrasjoner på 25 nmol /L ved hjelp av Hiperfect transfeksjon reagens (Qiagen) ifølge produsentens protokoll. Celler ble inkubert med siRNA-komplekset i 48 timer, deretter høstet for sanntids revers transkripsjon-PCR (RT-PCR), som beskrevet tidligere [6]. I korte trekk, ble RNA fremstilt ved anvendelse av TRIzol (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Kvaliteten av RNA ble evaluert ved hjelp av spektrofotometri. CDNA brukt for påfølgende PCR ble gjort ved hjelp av iScript (Bio-Rad Laboratories) og SensiMix real-time PCR kit ble brukt for real-time PCR (Bioline, Taunton, MA) for MAP4K5, CDH1 og vimentin. De 18S rRNA ble anvendt som en intern referanse-gen for å normalisere inngangs cDNA.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av IBM SPSS Statistics (versjon 22, IBM SPSS Inc., Chicago, IL ). Kategoriske data av MAP4K5 uttrykk og korrelasjoner med clinicopathologic funksjoner og uttrykk for E-cadherin, vimentin og CSE2 ble analysert ved hjelp av Chi-kvadrat og Fishers eksakte tester. Totalt overlevelseskurver ble konstruert ved hjelp av en Kaplan-Meier metoden. Den statistiske betydningen av forskjeller i overlevelse ble analysert ved hjelp av log-rank tester. Univariat og multivariat Cox-regresjonsanalyse via en baklengs trinnvis prosedyre ble utført. En P-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk for MAP4K5 er redusert i PDAC prøver
Immunhistokjemisk farging for MAP4K5 viste diffus cytoplasma farging spesielt i. pancreatic ductal celler av ikke-neoplastiske bukspyttkjertel prøver. Pancreatic akinærceller og øyen celler hadde ingen eller svært lav uttrykk for MAP4K5 (Fig 1A og 1B). I PDAC tilfeller som var MAP4K5 positive, ble diffuse cytoplasma farging observert bare carcinoma celler. Høyt nivå av MAP4K5 uttrykk ble oppdaget i normal pancreatic ductal cellene til alle matchet ikke-neoplastiske bukspyttkjertel prøver (100%). I kontrast, blant de 105 PDAC prøvene, bare 24 (22,9%) var MAP4K5 høy og 81 (77,1%) svulster hadde ingen eller svært lav uttrykk for MAP4K5 (MAP4K5-lav, Fig 1C og 1D). Ekspresjonen av MAP4K5 var høyere hos normale pankreas ductal celler enn PDAC (tabell 1, p = 0,0001). Disse data tyder på at tapet av MAP4K5 ekspresjon kan bli anvendt som en diagnostisk markør for PDAC.
Representative mikrofotografier viser ekspresjonen av MAP4K5 i normal pankreas vev (A) og kronisk pankreatitt (B). De godartede bukspyttkjertelen duktale celler i normal bukspyttkjertel og kronisk pankreatitt vise sterk cytoplasma farging for MAP4K5. Den tilstøtende bukspyttkjertelen akinærceller og bukspyttkjertel øyceller er enten negative eller har svært lav uttrykk for MAP4K5. C D, Representative mikrografer viser tap av MAP4K5 uttrykk i to forskjellige pancreatic ductal adenokarsinom prøver. Sterk cytoplasma farging for MAP4K5 i godartede pancreatic ductal celler i venstre øvre hjørne i D fungert som intern positiv kontroll. Originale forstørrelser. 200X
Uttrykket nivåer av MAP4K5 korrelerer med uttrykk av E-cadherin i humane PDAC prøver i to uavhengige kohorter av pasienter
Representative mikrografer som viser sammenhengen mellom MAP4K5 uttrykk og ekspresjon av E-cadherin i PDAC prøver er vist i figur 2A-2D. Vi har funnet at tap av MAP4K5 uttrykket (MAP4K5-lav) korrelert med tap av E-cadherin-ekspresjon i PDAC i vår pasientpopulasjon. Blant de 24 tilfeller som ble MAP4K5-høy, bare 1 (4,2%) hadde lav ekspresjon av E-cadherin. I motsetning til dette, 31 av 81 (38,3%) tumorer som var MAP4K5-lav hadde lav ekspresjon av E-cadherin (p = 0,001, tabell 2 og figur 2A-2D). Vi observerte også en økning i vimentin uttrykk i MAP4K5-lav svulster i vår pasientpopulasjon. Men forskjellen i vimentin ekspresjon mellom det MAP4K5-lav og høy MAP4K5-gruppen var ikke statistisk signifikant (P = 0,30)
A B, Representative mikrografer viser sterk cytoplasma farging for MAP4K5 og sterk membran farging for E-cadherin i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom. C D, Representative mikrografer viser tap av MAP4K5 ekspresjon og tap av E-cadherin-ekspresjon i en pankreatisk duktus adenokarsinom. Originale forstørrelser. 200X
For å validere sammenheng mellom uttrykk for MAP4K5 og E-cadherin identifisert i vår pasientpopulasjon, undersøkte vi sammenhengen mellom uttrykk nivåer av MAP4K5 mRNA og CDH1 mRNA i 112 PDAC pasienter ved hjelp av RNA sekvense data som lastes ned fra TCGA data portal. Vi fant at mRNA-nivåene av MAP4K5 direkte korrelert med uttrykket nivåer av mRNA CDH1 (R = 0,2490, p = 0,008, figur 3) i TCGA pasientpopulasjon. MRNA nivået av CDH1 ble omvendt korrelert med uttrykk for vimentin mRNA i denne pasientgruppen (R = -0,3496, p = 0,0002, data ikke vist).
Uttrykket nivåer av MAP4K5 korrelerer med uttrykk for E-cadherin i humane PDAC cellelinjer
i tråd med våre immunhistokjemiske fargingsresultater, høy MAP4K5 protein uttrykk ble påvist i HPDE celler, udødeliggjort normale pancreatic ductal celler, men bare i to av syv (28,6% ) menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved immunoblotting analyse (figur 4A). For ytterligere å bekrefte korrelasjonen mellom ekspresjonen av MAP4K5 og E-cadherin observert hos pasienter PDAC, målte vi uttrykket nivåer av MAP4K5 og E-cadherin i syv PDAC cellelinjer ved immunoblotting og fant en lignende sammenheng mellom tap av MAP4A5 og E- cadherin protein ekspresjon i disse PDAC cellelinjer. De HPDE, CFPAC1 og L3.6PL celler som uttrykte høye nivåer av MAP4K5 viste også høye nivåer av E-cadherin uttrykk. Sammenlignet med disse cellene, hadde alle andre bukspyttkjertelkreft cellelinjer som hadde lav MAP4K5 uttrykk redusert uttrykk av E-cadherin (fig 4A). I tillegg, utførte vi RNA-sekvensanalyse av elleve PDAC cellelinjer og funnet en signifikant direkte sammenheng mellom uttrykket nivåer av MAP4K5 mRNA og CDH1 mRNA (R = 0,7248, p = 0,012, figur 4B) som er lik resultatene fra TCGA pasientpopulasjonen. Ekspresjon av mRNA ble CDH1 indirekte korrelert med mRNA-nivåer av vimentin i disse cellelinjene (R = -0,6087, p = 0,047, data ikke vist).
A. Immunoblotting for MAP4K5 og E-cadherin uttrykk i HPDE celler, udødeliggjort menneskelige bukspyttkjertel ductal celler og bukspyttkjertelkreft cellelinjer. De 293T celler transfektert med MAP4K5 cDNA konstruere lagret som en positiv kontroll for immunoblotting. B. Pearsons korrelasjonsanalyse mellom MAP4K5 mRNA og CDH1 mRNA uttrykk av RNA-sekvensering analyse i 11 bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
Pusse MAP4K5 uttrykk fører til redusert E-cadherin i PDAC cellelinjer
for å evaluere effekten av MAP4K5 på CDH1 genekspresjon, vi transient transfektert Panc-1 og ASPC-1 celler med siControl eller siMAP4K5 og målte mRNA nivåer av CDH1 og vimentin av kvantitativ RT-PCR. Vi fant at stanse av MAP4K5 førte til en betydelig reduksjon i uttrykket nivåer av CDH1 mRNA i begge cellelinjer, men ikke i mRNA-nivåer av vimentin (figur 5A og 5B). Våre data antyder at MAP4K5 kan spille en rolle i regulering av ekspresjonen av genet CDH1 og EMT fenotype i PDAC.
knockdown MAP4K5 ekspresjon fører til redusert ekspresjon av E-cadherin mRNA, men ikke vesentlige endringer i ekspresjonen av vimentin mRNA i Panc-1 (A) og ASPC-1-celler (B). * P. 0,01
Tap av MAP4K5 uttrykk korrelerer med CES2 uttrykk i humane PDAC prøver
I lys av nylige rapport som CES2, den mest effektive karboksylesterase i aktivere prodrug irinotecan i den aktive metabolitten SN-38, spådde tumorrespons til irinotecan og neoadjuvant FOLFIRINOX behandling hos pasienter med PDAC [21] undersøkte vi sammenhengen mellom tap av MAP4K5 uttrykk og CES2 uttrykk i vår pasientpopulasjon. Vi fant at tap av MAP4K5 uttrykk korrelerte signifikant med lav uttrykk for CES2. Lav CES2 ekspresjon var til stede i 48,7% MAP4K5-lav tumorer sammenlignet med 13,0% i MAP4K5-høy tumorer (p = 0,002, tabell 2). Ingen signifikant sammenheng mellom uttrykk for MAP4K5 og CES2 mRNA ble observert i TCGA pasientpopulasjonen.
Lav MAP4K5 uttrykk er forbundet med kortere total overlevelse
Median oppfølgingstid etter diagnostisering av PDAC var 21,8 måneder i vår pasientpopulasjon (range: 4,2 til 236,3 måneder). Median overlevelse var 21,2 ± 2,6 måneder i MAP4K5-lav gruppen sammenlignet med 40,6 ± 6,2 måneder i pasienter med tumor var MAP4K5-høy (P = 0,02, log-rank test, figur 6). Tap av MAP4K5 uttrykk i PDAC korrelerte signifikant med redusert total overlevelse. Vi har imidlertid ikke observere signifikant korrelasjon mellom uttrykket av E-cadherin, vimentin, eller CES2 og overlevelse (P 0,05, ikke data vist). I multivariat analyse, tap av MAP4K5 uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for redusert total overlevelse med en hasardratio på 2,05 (95% konfidensintervall: 1,17 til 3,56, P = 0,012). I tillegg, lymfeknutemetastase og positiv reseksjonsrendene var også uavhengig prediktorene for redusert overlevelse, P = 0,013 og P = 0,012 henholdsvis i multivariat analyse (tabell 3). Ingen signifikant sammenheng mellom MAP4K5 uttrykk og andre clinicopathologic funksjoner, blant annet kjønn, alder, tumorstørrelse, differensiering, lymfeknute og reseksjon margin status, ble observert i vår pasientpopulasjon (P 0,05, tabell 2)
Pasienter som svulster hadde ingen eller lav MAP4K5 uttrykk (MAP4K5-lav) hadde kortere total overlevelse enn pasienter med tumorer var MAP4K5 høy.
Diskusjoner
MAP4K5 spiller en viktig rolle i regulering av en rekke cellulære responser av hematopoetiske celler til miljømessige stimuli, slik som TNFa gjennom stress-aktiverte protein-kinaser (SAPKs) og JNK-reaksjonsveiene [24-26]. MAP4K5 har også vist seg å være involvert i både kanonisk og ikke-kanonisk Wnt signalering i B-lymfocytter [27]. Imidlertid har sine funksjoner i menneske malignitet ikke undersøkt. I denne studien viste vi at MAP4K5 uttrykket ble redusert eller tapt i 77,1% av PDAC. I motsetning til dette ble MAP4K5 uttrykt ved høyt nivå i normal pankreas ductal celler i 100% av de samsvarende ikke-neoplastiske bukspyttkjertel prøver. Tilsvarende tap av MAP4K5 protein uttrykk ble observert i flertallet av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer i forhold til HPDE celler, udødeliggjort normale pancreatic ductal celler. Mer viktig, viste vi at tap av MAP4K5 protein uttrykk var assosiert med redusert total overlevelse og var et selvstendig prognosticator for total overlevelse hos pasienter som gjennomgikk reseksjon for PDAC av multivariat analyse. Våre data foreslått, for første gang, kan det hende at tap av MAP4K5 ekspresjon spiller en rolle i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Våre funn var i overensstemmelse med nyere studier som viste at HPK1, et annet medlem av GCK familien av pattedyr Ste20 lignende serin /treonin-kinase-familien, fungerer som en tumor suppressor både i bukspyttkjertelkreft og lungekreft [12, 13, 28] . På den annen side har MAP4K4 blitt vist å være overuttrykt i bukspyttkjertelkreft og andre typer kreftformer. Overekspresjon av MAP4K4 er et dårlig prognostisk faktor for både generell og sykdomsfri overlevelse hos pasienter med bukspyttkjertelkreft [16]. Disse dataene antyder en avvikende rolle MAP4K familie i kreft. Tidligere studier har vist at målrettet nedbrytning av HPK1 i bukspyttkjertelkreft ved CUL7 /Fbxw8 ubiquitin ligase innebærer HPK1 autofosforylerings. Aktivering og autofosforylering av HPK1 danner en negativ tilbakekoplingssløyfe for å begrense HPK1 aktivitet, som regulerer cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon i bukspyttkjertelkreft [12, 13]. Det er mulig at den 26S-proteasom-reaksjonsveien kan spille en rolle i tap av MAP4K5 ekspresjon i humane maligniteter. Men de molekylære mekanismene som fører til tap av MAP4K5 uttrykk i bukspyttkjertelkreft trenger videre etterforskning.
Wnt /β-catenin signalveien spiller en sentral rolle i å opprettholde epithelial celle fenotype og celle-celle veikryss. Dysregulering av denne veien vil føre til EMT, som har vist seg å være involvert i utvikling, progresjon, og kjemoterapi motstand av kreft i bukspyttkjertelen [5, 6]. I lys av tidligere funn om at MAP4K5 er involvert i reguleringen av både den kanoniske og ikke-kanoniske Wnt signal [27] undersøkte vi de funksjoner og sammenhenger mellom MAP4K5 og EMT i bukspyttkjertelkreft. Vi fant en statistisk signifikant sammenheng mellom tap av MAP4K5 uttrykk og tap av E-cadherin uttrykk, en signatur immunophenotypic markør for EMT, i to store uavhengige pasient kohorter, kohorten fra vår institusjon og TCGA kohort. I tillegg observerte vi den samme korrelasjon mellom tap av MAP4K5 ekspresjon og tap av E-cadherin uttrykk både på protein og mRNA-nivåer i flere bukspyttkjertelcancercellelinjer. Videre knockdown MAP4K5 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer førte til redusert CDH1 mRNA uttrykk. Derfor MAP4K5 kan spille en viktig rolle i regulering av ekspresjon av E-cadherin og EMT i bukspyttkjertelkreft. Våre data gir en kobling mellom tap av MAP4K5 og EMT i bukspyttkjertelkreft og kan tyde på at MAP4K5 signale representerer en potensiell terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen.
De regimer av FOLFIRINOX og gemcitabin /Nab-paclitaxel har vist seg å har bedret effekt i behandling av pasienter med metastatisk kreft i bukspyttkjertelen i forhold til gemcitabin alene [29, 30]. Ved hjelp av en omfattende proteomikk tilnærming, Capello
et al
. nylig identifisert CES2 som en potensiell prediktiv markør for kreft i bukspyttkjertelen pasienter som fikk neoadjuvant FOLFIRINOX [21]. De viste at høye nivåer av ekspresjon CES2 redusere halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) av irinotecan, og øke effektiviteten av FOLFIRINOX diett [21]. I denne studien fant vi at tap av MAP4K5 uttrykk er signifikant assosiert med lave nivåer av CES2 uttrykk i vår pasientpopulasjon. Selv om vi ikke finner en signifikant sammenheng mellom MAP4K5 mRNA og CSE2 mRNA i TCGA befolkningen (data ikke vist), våre funn tyder på at tap av MAP4K5 kan være involvert i kjemoterapi motstand av kreft i bukspyttkjertelen, spesielt til regimer som inneholder irinotecan i ryggraden.
i sammendraget, MAP4K5 proteinet som blir uttrykt ved høye nivåer spesifikt i de pankreatiske ductal celler i normal pankreas. Tap av MAP4K5 uttrykk er til stede i flertallet av pancreatic ductal adenokarsinomer og er en uavhengig dårlig prognostisk faktor for pasienter med stadium II PDAC. De sterke assosiasjoner mellom tap av MAP4K5 uttrykk og tap av E-cadherin eller redusert CES2 uttrykk kan foreslå en viktig rolle MAP4K5 i epitelial til mesenchymale overgang, kjemoterapi motstand og tumorprogresjon i bukspyttkjertelkreft. Dermed rettet mot svekket MAP4K5 signale kan representere en ny terapeutisk strategi for kreft i bukspyttkjertelen behandling.
Takk
Dette arbeidet ble støttet av Khalifa Bin Zayed Al Nahyan Foundation institutt for kreft i bukspyttkjertelen forskning ved Universitetet i Texas MD Anderson Cancer Center. Forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet.
