Abstract
Bakgrunn
Identifiseringen av sensitive biomarkører for påvisning av kreft i eggstokkene er av høy klinisk relevans for tidlig deteksjon og /eller overvåking av tilbakefall av sykdommen. Vi utviklet en systematisk flertrinns biomarkører og verifisering strategi for å identifisere kandidat DNA metylering markører for blod-basert gjenkjenning av eggstokkreft.
Metodikk /hovedfunnene
Vi brukte Illumina infinium plattform å analysere DNA metylering status for 27,578 CpG steder i 41 ovarietumorer. Vi benyttet en markør utvalg strategi som understreket følsomhet ved å kreve konsekvens av metylering tvers svulster, samtidig oppnå spesifisitet ved å utelukke markører med metylering i kontroll leukocytter eller serum DNA. Vår verifisering strategi involvert testing evne identifiserte markører for å overvåke sykdomsbyrden i serie innsamlede serumprøver fra eggstokkreft pasienter som hadde gjennomgått kirurgisk tumorreseksjon forhold til CA-125 nivåer.
Vi identifiserte en markør,
IFFO1
promoter metylering (IFFO1-M), er det ofte metylert i ovarietumorer og som er sjelden påvises i blodet til normale kontroller. Når testet i 127 serielt samlet sera fra ovarian kreftpasienter, IFFO1-M viste etter reseksjon kinetikk signifikant korrelert med serum CA-125 målinger i seks av 16 pasienter.
Konklusjon /Betydning
Vi har gjennomført en effektiv markør screening og bekreftelse strategi, som fører til identifisering av IFFO1-M som et blod-baserte kandidat markør for sensitiv påvisning av kreft i eggstokkene. Serumnivåer av IFFO1-M vises etter reseksjon kinetikk forenlig med en refleksjon av sykdomsbyrde. Vi forventer at IFFO1-M og andre kandidat markører dukker opp fra denne markøren utviklingen rørledningen kan gi sykdom gjenkjenning evner som utfyller eksisterende biomarkører
Citation. Campan M, Moffitt M, Houshdaran S, Shen H, Widschwendter M, Daxenbichler G, et al. (2011) Genome-Scale Screen for DNA Metylering-basert gjenkjenning Markører for eggstokkreft. PLoS ONE 6 (12): e28141. doi: 10,1371 /journal.pone.0028141
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: Mai 10, 2011; Godkjent: 02.11.2011; Publisert: 07.12.2011
Copyright: © 2011 Campan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ovarian Cancer Research Fund, gir PPD /USC.06, og National Institutes of Health og National Cancer Institute, gi R01-CA096958. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. PL er konsulent og Scientific Advisory Board medlem for Epigenomics AG. Han innehar patenter på MethyLight teknologi, som er lisensiert til Epigenomics AG. Dette arbeidet ble ikke støttet av Epigenomics AG. Epigenomics hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling eller analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. I tillegg er PL og MC navngitt som oppfinnere på en patentsøknad for Digital MethyLight teknologi. Patentene og forholdet til Epigenomics endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. De andre forfatterne avslørt ingen potensiell konkurrerende interesse.
Innledning
Eggstokkreft er den ledende årsak til gynekologisk kreft dødsfall og den femte største årsaken til alle kreftrelaterte dødsfall hos kvinner. Det har blitt anslått at en kvinne i 72 vil utvikle eggstokkreft i hennes levetid i USA, og at en kvinne i 96 vil dø av denne sykdommen [1]. De fem-års overlevelse er sterkt stadium avhengig [2], [3] med priser på 94% for stadium I sykdom og 28% for stadium IV sykdom [1].
Siden tidlig stadium sykdommen er ofte asymptomatisk, og det er ingen effektiv screening strategi, de fleste pasientene (62%) er tilstede med fremskreden fase (III og IV) sykdom, hvori kreften har spredd seg over hele bukhulen eller andre organer [1]. Mer enn 85% av pasientene med langt fremskreden sykdom tilbakefall etter avslutning av primærbehandling, til tross for en innledende god respons [4], [5]. Det er forventet at effektive metoder for deteksjon av asymptomatisk eggstokkreft før invasjon og metastase har oppstått i vesentlig grad vil redusere dødeligheten for denne sykdommen. Følsomme påvisningsmetoder kan også bli brukt til overvåkning av sykdommen etter tumor-reseksjon med eller uten adjuvant kjemoterapi.
For tiden finnes det ingen god biomarkør eller bilde tilnærming med tilstrekkelig sensitivitet og spesifisitet for påvisning av prekliniske eggstokk-kreft [6 ]. To proteinbaserte biomarkører, CA-125 og HE4, har blitt klinisk godkjent for å måle sykdomsbyrde og å vurdere eggstokkreft behandling [7], [8]. Men disse markørene ikke forhøyet i alle ovarietumorer og ikke har tilstrekkelig positiv prediktiv verdi for populasjonsbasert risikovurdering eller tidlig deteksjon. Gitt begrensninger av dagens tilnærminger, det er et presserende behov for å utvikle mer effektive strategier for påvisning av prekliniske eggstokkreft tidlig nok for behandling skal være vellykket. Siden eggstokkreft er heterogene, med ukjente celler sted dårlig forstått patogenesen [9] markør oppdagelsesprosesser bør stole på high-throughput teknologibaserte tilnærminger i stedet for på mekanistiske drevet markør funn strategier. Også markører for eggstokkreft bør være i stand til å oppdage svulster hundrevis av ganger mindre enn de klinisk serøs kreft som vanligvis brukes til å evaluere biomarkør ytelse [10].
epigenetiske biomarkører har nylig dukket opp som alternativer til protein biomarkører for tidlig deteksjon av kreft [11] – [13], inkludert eggstokk-kreft [14] – [17]. Avvikende DNA hypermethylation er hyppig observert i kreftceller [18]. Kreftpasienter har forhøyede nivåer av fritt DNA sirkulerer i blodet [19]. Kreft-assosiert avvikende DNA-metylering, har sin opprinnelse i det minste delvis i tumorceller, kan påvises i serum eller plasma-DNA fra kreftpasienter [11], [12]. Metylert DNA er kjemisk og biologisk stabil, lett påvisbar i mange typer av kroppsvæsker og derfor godt egnet for påvisning blod-cancer [11] – [17]. Imidlertid er begrenset antall av DNA-metylering markører for tiden tilgjengelig gjelder bare en liten brøkdel av eggstokk-kreft [14] og er ikke-spesifikk, mens deteksjonsteknologier mangler følsomhet, er i stor grad gel-basert, og er ikke-kvantitative [15] – [17]. Nylige fremskritt innen DNA-metylering analyseteknologi har potensial til å øke DNA-metylering markør oppdagelse gjennomløp gjennom den samtidige analyse av tusener av genomisk loci [20], [21], og for å muliggjøre svært følsom påvisning av meget små mengder av denaturert DNA i en kvantitativ måte [22], [23].
i denne studien har vi gjennomført en storstilt systematisk markør funn for DNA metylering markører for kreft i eggstokkene som ikke finnes i blodet hos kvinner uten kreft i eggstokkene. DNA metylering markører har blitt funnet å ha moderat klinisk sensitivitet i mange tidligere rapporter. I vurderingen av hvordan man kan forbedre følsomheten av DNA metylering markører, vi konsekvensen av at metylering status for normal eggstokk er irrelevant, så lenge normal eggstokk DNA normalt ikke lekke inn i blodet og markører er negative hos friske kontroller. Derfor modifiserte vi vår oppdagelse strategi for å fokusere på en direkte sammenligning av tumor sammenlignet med blod, i motsetning til tumor sammenlignet med normalt vev. I vår utvelgelsesprosess streket vi markør følsomhet ved å kreve konsekvens av svulst metylering, og marker spesifisitet ved å utelukke markører med metylering i kontroll leukocytter eller serum DNA. Vi identifiserte en lovende kandidat DNA metylering markør, IFFO1-M, som vi testet som en blod-basert biomarkør i et begrenset antall case og kontrollsera. For å gi bevis på at vår kandidat IFFO1-M markør tiltak sykdomsbyrden i blodet, vi analyserte tidsmessige mønstre av IFFO1-M nivåer i serieblodprøver trukket før og etter reseksjon av primærtumor, og sammenlignet disse med en validert markør for sykdommen byrde, CA-125. Denne innen-faget sammenligning gjør at hver pasient for å tjene som sin egen kontroll, uten variasjon i genetisk bakgrunn mellom serieblodprøver. I denne studien rapporterer vi på den kvantitative digital analyse av IFFO1-M i serielle prøver fra ni pasienter, for totalt 127 blodprøver.
Metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til Helsinki mennesker lære og ble godkjent av Institutional Review styrene i instituttene involvert i studien: Duke University Medical Center (Durham, USA), Keck School of Medicine ved University of Southern California ( Los Angeles, USA), og Innsbruck universitetssykehus (Innsbruck, Østerrike). Signert informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne for innsamling av prøvene og deres påfølgende analyse.
Pasienter og kontroller Prøvetaking og behandling
De 41 eggstokkreft tumorprøver som brukes i infinium baserte markør oppdagelsen fase av studien ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kirurgi ved to institusjoner, Duke University Medical Center (30 prøver) og University of Southern California Medical Center (11 prøver). Alle tumorprøver ble innhentet fra pasienter som gitt skriftlig informert samtykke, som ble godkjent av Institutional Review styrene i de respektive institusjonene. Blant de tumorprøver samlet inn, var det en blandet (klarcellet og endometrioid), tre klare celle, fire mucinous, fire endometrioid, og 32 serøs epitelceller ovarialcancer prøver (Tabell S1). Tumorvev ble flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil behandling. Perifert blod leukocytter (PBL) og plasmaprøver som brukes i oppdagelse og verifikasjonsfasen ble oppnådd fra 10 friske postmenopausale kvinner som Bloods ble kommersielt kjøpt (HemaCare Corporation). Plasma ble isolert fra blod oppsamlet i rør inneholdende EDTA. Rørene ble sentrifugert i 10 min ved 300
g
ved 4 ° C. Uten å fjerne plasma fra røret etter at den første sentrifugering, spunnet vi rør i ytterligere 10 minutter ved 1600
g
ved 4 ° C. Det separerte plasma ble overført til mikrosentrifugerør og sentrifugert på nytt ved 16.000
g
i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet og lagret ved -80 ° C inntil de er klare til bruk. Den tynne perifere blodleukocytter lag som sedimenterte over de røde blodceller ble oppsamlet og lagret -80 ° C inntil de er klare til bruk for DNA-ekstraksjon.
DNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp av standard protokoller. DNA ble ekstrahert fra PBL-prøver ved å bruke den QIAamp® DNA Blood kit (Qiagen), mens fritt DNA fra plasma og serum ble ekstrahert ved hjelp av QIAamp® UltraSens Virus Kit (Qiagen). I begge forsøkene ble DNA ekstrahert etter produsentens anvisninger.
Blodprøvene som brukes i de langsgående analyser ble samlet inn fra 16 pasienter behandlet for eggstokkreft mellom 1992-2000 ved Institutt for obstetrikk og gynekologi, Innsbruck universitetssykehus (Innsbruck, Østerrike) i samsvar med og godkjent av Innsbruck Universitets Institutional Review Board. De kliniske og patologiske egenskapene til disse pasienter er oppført i Tabell S3. De første blodprøver trukket, referert til som grunnlinjeprøver, ble erholdt før operasjonen for elleve av pasientene og flere dager etter operasjonen for fem pasienter (se fullstendig informasjon i tabell S4). Tilleggs blod ble samlet inn fra alle pasienter ved hvert oppfølgingsbesøk for perioder av ganger strekker seg fra 37 til 246 uker (tabell S4). For isolering serum, blod ble tillatt å koagulere i 1-4 timer ved romtemperatur (RT) og sentrifugert i 10 minutter ved 2000
g
ved RT. Serum ble isolert fra blodklumpen, alikvotert inn i mikrosentrifugerør og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Kontrollsera fra åtte friske kvinner ble kommersielt kjøpt (Innovative Research). Gratis sirkulerende DNA ble isolert fra pasienter og kontroller sera bruker QIAamp® UltraSens Virus Kit (Qiagen) etter produsentens anvisninger. Nivåer av CA-125 ble bestemt ved en mikropartikkel enzym-immunoassay (MEIA) ved hjelp av IMX analysator (Abbott Laboratories).
DNA metylering analyse
Alle DNA-prøver ble underkastet bisulfitt modifikasjon bruker EZ DNA Metylering Kit (Zymo Research) i henhold til produsentens instruksjoner. For infinium basert analyse, 1 mikrogram genomisk DNA fra hver prøve var bisulfite konverterte i 96 brønners plate format ved hjelp av EZ96 DNA metylering kit (Zymo Research). Kvaliteten og kvantiteten av bisulfitt-konvertert DNA, så vel som fullstendigheten av bisulfitt omvendt, og ble vurdert ved hjelp av et panel av kvalitetskontroll reaksjoner som tidligere beskrevet [24]. Etter omdanningen, ble det modifiserte DNA ble eluert i 18 ul elueringsbuffer som leveres med settet, og 5 pl av hver prøve ble anvendt i Illumina infinium DNA-metylering analyse som spesifisert av produsenten.
For MethyLight analyse 1 pg genomisk DNA fra hver tumor og PBL prøve ble behandlet med bisulfit ved hjelp av Zymo EZ DNA-metylering kit (Zymo Research). På lignende måte ble det Zymo EZ DNA-metylering Settet som brukes for å omdanne bisulfit DNA ekstrahert fra plasma eller seraprøver. Generelt 1 ml plasma eller sera ble behandlet i en kolonne av den Zymo kit. Etter rensing, ble alle bisulfitt-modifisert DNA-prøver ble eluert i 10 ul elueringsbuffer og ytterligere fortynnet som følger: PBL-DNA ble fortynnet til en endelig konsentrasjon på 0,5 ng /mL. Tumoren DNA ble fortynnet basert på syklusen terskelen (Ct) på en ALU-baserte MethyLight reaksjon. Kun DNA med en Ct mindre enn 21 for ALU-baserte reaksjon ble anvendt i noen av de etterfølgende analyser [24]. Plasmaet DNA ble fortynnet slik at hver 1 ul modifisert DNA representert 10 mL av det opprinnelige volumet av plasma eller sera anvendt. For hver MethyLight reaksjon 10 pl av den fortynnede tumor, PBL eller plasma bisulfitt omdannes DNA ble anvendt. For digital MethyLight analyse, er hele mengden av DNA ekstrahert fra 1 ml serum ble konvertert bisulfitt, og prøvene ble fortynnet slik at hver 1 mL av hver bisulfitt-konverterte DNA-prøve er representert 1 mL av det opprinnelige serumvolum som brukes. I hvert Digital MethyLight analyse, ble 100 mL av den fortynnede DNA brukes.
infinium Analysen ble utført i USC epigenome sentrum med HumanMethylation27 BeadArray (Illumina). Protokollene og sonden informasjon er tilgjengelig på www.illumina.com. Resultatene av infinium analysen ble utarbeidet for hver locus hjelp Illumina BeadStudio programvare (Illumina) og rapporteres som beta (P-) verdier som er DNA-metylering score varierer fra 0 til 1 som gjenspeiler brøk DNA metylering nivå av et enkelt CpG nettstedet [ ,,,0],20]. De infinium analyseresultatene er tilgjengelig for nedlasting på Gene Expression Omnibus (GEO) dataregister ved National Center for Biotechnology Information (NCBI) under aksesjonsnummer GSE26989 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE26989).
Det ble utført The MethyLight analyse og dataanalyse som beskrevet tidligere [22], [25]. De primere og prober for disse analysene er oppført i Tabell S2. Den digitale MethyLight analysen og dataanalyse ble utført som tidligere beskrevet [23] med den forskjell at PCR-reaksjoner ble utført i et volum på 10 ul i stedet for 30 pl.
Marker utvalg
infinium prober som feilet i noen av prøvene ble ekskludert fra analysen. Sonder forbundet med enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs), identifisert ved hjelp av NCBI dbSNP bygger 126 og 128, eller repeterende elementer identifisert av RepeatMasker ble også ekskludert. De to PBL Prøvene anvendt i analysen ble kjørt i duplikat på infinium DNA-metylering plattform og de gjennomsnittlige p-verdiene for hver prøve ble anvendt for markør filtrering. Vi elimineres eventuelle sonder med en β verdi høyere eller lik 0,2 i en hvilken som helst av de to gjennomsnitt PBL prøver. Vi identifiserte tumorprøve med lavest DNA-metylering verdi (T
L) og den PBL prøven med den høyeste DNA-metylering verdi (PBL
H) for hver sonde og vi beregnes differansen mellom de ß verdiene av disse to prøver (T
L- PBL
H). Sondene ble rangert basert på denne forskjellen, og sondene som var forskjellen mindre eller lik 0 ble eliminert.
Verifisering av de 15 topprangerte markører Bruke Cancer Genome Atlas (TCGA) data
SS verdiene av de 15 topprangerte markører ble hentet fra offentlig tilgjengelige DNA metylering datasett for serøs eggstokkreft lagt ut på TCGA portal~~POS=HEADCOMP (htpp: //tcga-data.nci.nih.gov/tcga) . Vi sammenlignet fordelingen av infinium-genererte p-verdiene for disse 15 markører i alle de 41 eggstokkreft prøver eller bare de 29 serøs eggstokkreft av denne undersøkelse til dem som ble oppnådd fra 284 serøse eggstokkreft prøver i TCGA studien og en total av 10 normal PBL prøver ved hjelp av dot-diagrammer fra GraphPad Prism programvare (GraphPad Software Inc.).
Statistisk analyse
evnen IFFO1-M for å skille mellom sak og kontrollprøver ble vurdert ved å plotte mottaker driftskarakteristikker kurve, som assosierer den sanne positive rate (følsomhet) til den falske positive (1-spesifisitet) og ved å beregne arealet under kurven (AUC). Den 95% konfidensintervall (KI) i AUC ble beregnet med 2000 bootstrap prøver ved hjelp av Proc R pakken [26]. Pearson produkt-moment korrelasjonskoeffisient (Pearsons r) ble beregnet for å måle graden av korrelasjon mellom de IFFO1-M-DNA-metylering nivåene og CA-125 nivåer i hver av de ni pasientene. Statistiske test mot nullhypotesen at r = 0 ble utført og en
p
verdi cutoff på 0,05 ble brukt til å erklære betydning. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av R 2,13 programvaren.
Resultater
DNA metylering baserte markør oppdagelse rørledning
Vi utviklet et omfattende og systematisk strategi for å identifisere og evaluere blod- basert DNA-metylering markører for eggstokkreft som bare er til stede i blod fra individer som lider av sykdommen. Figur 1 illustrerer trinnene vi foretok for å oppnå dette målet. Hvert av disse trinnene er beskrevet nærmere i de påfølgende avsnittene.
infinium plattformen ble brukt til å screene 27,578 sonder som representerer 14 489 individuelle genloci. Vi brukte en systematisk trinnvis metode for å fjerne sonder som mislyktes i noen av prøvene, prober som inneholdt SNP’er eller repeterte sekvenser, eller sonder med en beta-verdi høyere enn 0,2 i noen av prøvene PBL. De resterende prober ble rangert basert på forskjellen mellom tumorer og blod (se Materialer og Metoder), og probene med høyere DNA-metylering i PBL enn i noen av tumorprøver ble eliminert. Den øverste 15 fra de gjenværende 517 markører ble overført til MethyLight plattform for videre verifisering. Alle 15 markører passert en uavhengig verifikasjon test utført på offentlig tilgjengelig TCGA eggstokkreft datasett og ytterligere PBL prøver. Tre markører mislyktes på grunn av inkompatibilitet problemer knyttet til MethyLight plattformen, mens en annen ti mislykkede fordi de ble metylert i normal PBL DNA (3 markører) eller normal plasma (7 markører). Bare en markør,
IFFO1
, ble valgt for ytterligere verifisering på pasientprøver ved hjelp av Digital MethyLight. (Stjernen indikerer sonder som feilet i noen av prøvene, samt de som følger SNPs og gjenta sekvenser).
Screening for og valg av DNA metylering markører for eggstokkreft
Vi først gjennomførte en storstilt DNA metylering analyse av 41 eggstokkreft prøver (Tabell S1) og to PBL prøver fra sykdomsfrie postmenopausale kvinner. Vi brukte infinium DNA metylering BeadArray som samtidig leser av DNA metylering status for 27,578 sonder som strekker seg over 14 489 unike genetiske loci. Vi begynte da utvelgelsesprosessen ved å filtrere ut alle probene som feilet (påvisning p-verdi 0,2 i hvilket som helst av de PBL prøven) (Fig. 1). De resterende 13,628 sonder (8701 unike gener) ble rangert i en avtagende orden basert på en algoritme som beregner differansen mellom den minst metylerte ovarial tumor prøven og den mest metylerte blodprøven for hver sonde (fig. 1 og 2B) (Materialer og Metoder ). De 554 sonder (517 unike gener) med høyere DNA-metylering i en hvilken som helst av de ovarietumorer sammenlignet med de to normale blodprøver ble beholdt for senere vurdering (fig. 1 og 2C). Vi neste utført bekreftende analyser med de beste 15-rangert markører (Fig. 1 og 2D). Valget av testing kun denne begrensede antall markører ble motivert av kostnads- og pasientprøve tilgjengelighet begrensninger.
a, de 12,194 markører igjen etter eliminering av sondene som mislyktes i noen av prøvene, og av sondene inneholder SNPs eller gjentatte elementer. Markører rangeres i stigende rekkefølge basert på den gjennomsnittlige DNA metylering β verdien av de to PBL prøvene. B, 8,701 markørene igjen etter eliminering av prober med DNA-metylering β values≥0.2 i noen av de to PBL prøvene. Prober ble rangert i en avtagende orden basert på forskjellen i DNA-metylering mellom tumoren med lavest β verdi (T
L) og den PBL prøven med den høyeste verdi β (PBL
H). C, er 517 markører med høyere DNA-metylering verdier i en hvilken som helst av tumoren enn i noen av prøvene PBL. Markørene er rangert i synkende rekkefølge basert på forskjellen mellom svulster og PBL DNA metylering verdier. D, de topprangerte 15 markører som ble overført til MethyLight plattform for videre verifisering.
Uavhengig vurdering av reproduserbarhet av de beste 15-rangert stakere
Siden antallet eggstokkreft kreftprøver som brukes i screening trinn var relativt liten, vi tok fordel av de offentlig tilgjengelige TCGA DNA metylering data på serøs eggstokkreft [28] for å bekrefte resultatene av de 15 topprangerte markører i en uavhengig større datasett. Denne analysen ble forenklet ved det faktum at TCGA data ble samlet inn ved hjelp av den samme teknologi som i vårt studium. Fordelingen av DNA-metylering betaverdier for alle 15 markører i de to datasettene tumor (liggende studie (PS) og TCGA) i forhold til et sett av ti friske kontroll PBL prøver er vist i figur 3. Utvalget av DNA metylering verdier i vårt eksperimentelle sett av 41 serøs, mucinous, klar-celle, og endometrioid eggstokkreft var lik den til de 284 serøse eggstokkreft prøver fra TCGA, med både viser mye høyere DNA-metylering nivå enn i de ti friske kontroll PBL prøver. Resultatene var ikke forskjellig når analysen ble begrenset til 29 av de 41 eggstokkreft pasienter med serøs histologi (data ikke vist).
infinium-avledet beta verdier (Y-aksen) for topp 15- rangert markører ble sammenlignet i denne studien (PS) datasettet (41 eggstokk-kreft med blandet undertyper), den TCGA datasettet (284 serøse eggstokk-kreft) og ti normal PBL-prøver. De horisontale linjene representerer medianverdier for hver gruppe.
MethyLight analyser utvikling og verifisering i kontrollprøver for de 15 topprangerte markører
neste overført de 15 markørene til mer sensitive PCR-basert DNA metylering gjenkjenning plattformer, MethyLight og Digital MethyLight. I motsetning til Illumina infinium DNA metylering sonder, som analysen av DNA metylering status for en enkelt cytosin, MethyLight-baserte primere og probe avhøre konkordant DNA metylering av flere denaturert cytosines samtidig over en kort genomisk region. Følgelig kan MethyLight resultater for en bestemt genetisk locus er forskjellige fra de som er registrert av en Illumina infinium sonde på samme sted på grunn av tilstedeværelsen av tilgrensende cytosines og variasjoner i primerne /proben posisjonering. Vi var vellykket i å utvikle MethyLight reaksjoner for 12 av de 15 kandidat markører (Tabell S2). DNA-sekvensene ved siden av infinium målrettede cytosines for tre av de 15 markørene var ikke egnet for MethyLight utforming (fig. 4). En ekstra markør ble eliminert fra rørledningen fordi det ikke klarte å forsterke
in vitro
metylert (M.SssI-behandlet) kontroll DNA (fig. 4). Vi utsettes de resterende 11 markører til en strengere motskjermens mot overskudd av PBL DNA (50 ng) fra to sykdomsfrie postmenopausale kvinner, for å utelukke DNA metylering markører som skulle presentere bakgrunns problemer for sensitiv deteksjon av eggstokkene DNA metylering markører i blod . Dette MethyLight baserte skjermovergitt åtte markører med svært lave nivåer av DNA-metylering i PBL (MethyLight syklus terskler (Ct) høyere enn 35 i begge prøver).
Tekniske kontroller for MethyLight (ML) plattform førte til eliminering av fire markører (krysset grå bokser) på grunn av design inkompatibilitet, og unnlatelse av å forsterke
in vitro
metylert DNA positiv kontroll for MethyLight reaksjoner (M.SssI test). Elleve markører ble testet i normale PBL prøvene ved hjelp av et overskudd av PBL DNA (50 ng). Markører med en syklus terskel (Ct) høyere enn 35 (blå bokser) i de to normale PBL prøvene ble beholdt og markører med en Ct mindre enn 35 (gule boksene) ble eliminert. MethyLight analyser med Ct-verdiene 35 indikerer klart påvisbare mengder av denaturert DNA på disse loci. Ytterligere testing i normale kontrollplasmaprøver (100 ul) resulterte i eliminering av syv av de åtte gjenværende markører. En gjenværende markør,
IFFO1
, ble testet i 15 eggstokkreft i ulike histologiske subtyper. De MethyLight resultater for normal plasma kontroll og eggstokkreft prøvene er uttrykt som prosent av denaturert Referanse (PMR). Blå boksene representerer PMR-verdier mindre enn 10, gule boksene viser PMR verdier mellom 10 og 50, mens røde boksene betegne PMR-verdier over 50. De typer ovarietumorer brukt i analysen er som følger: klare cellekreft (CC), blandet klarcellet og endometrioid (CC /E), endometrioid (E), mucinous (M), og serøs (S).
Disse åtte markørene ble senere vurdert på konsentrerte gratis plasma DNA-prøver fra ti sunt postmenopausale kvinner, noe som ga bare en markør,
IFFO1
, med nesten umulig å oppdage DNA metylering i alle disse kontrollplasmaprøver (PMRS 5) (fig. 4). Vi testet neste
IFFO1
på 15 ovarietumorer av forskjellige histologiske subtyper, hvorav 14 har også vært brukt i den innledende screening trinn (tabell S1), og som finnes betydelige nivåer av DNA-metylering (PMR 20) i alle tumorene analysert (fig. 4). Dette er i samsvar med infinium DNA metylering analyse fra de samme tumorprøver (fig. 2). Denne markøren ble derfor valgt for påfølgende kliniske tester i et sett av serumprøver samlet inn i lengderetningen fra et eget sett med eggstokkreft pasienter.
IFFO1 genet promoter DNA metylering (IFFO1-M) markør ytelse i serumprøver
Vi har evaluert første resultatene av IFFO1-M merke i serumprøver innhentet fra åtte friske eldre kvinner kontroller og 16 kreftpasienter på eggstokkene med avansert (stadium III og IV) sykdom ved bruk av svært sensitive og kvantitativ Digital MethyLight analyse [23]. De clinicopathological kjennetegn for ovarian kreftpasienter som er inkludert i denne analysen er oppsummert i Tabell S3. Utgangen for Digital MethyLight måles ved å telle individuelt metylert DNA-molekyler. Vi oppdaget den IFFO1-M merke i alle pasientprøver. I motsetning til dette ble IFFO1-M detekteres ved meget lave nivåer i bare to av de åtte kontrollprøver (fig. 5A). Ti av de pasientsera hadde mer IFFO1-M-DNA-metylering enn noen av de positive kontrollprøver. Mottakeren Driftsegenskaper (ROC) analyse med en beregnet arealet under kurven av 0,95 [95% CI, 0,8359 til 1] indikerte en god diskriminerende potensial for IFFO1-M markør (Fig. 5B). Siden disse resultatene kan ha blitt påvirket av forskjeller i måten kontroll- og case-prøver ble samlet inn og behandlet vi fortsatte testingen av IFFO1-M i serie innsamlede serumprøver fra ovarian kreftpasienter.
A, IFFO1-M nivåer (uttrykt som antall IFFO1-M metylert molekyler som detekteres i 1 ml serum) i referanseprøver fra 16 pasienter og åtte normale kontroller ble bestemt ved digital MethyLight. Antallet molekyler i pasient 1 er en tilnærmelse fordi tellinger høyere enn 15 hits /96-brønners plate /100 ul testede kunne reflektere nærværet av mer enn ett molekyl /brønn. Den histologiske subtype av tumorene er angitt i parenteser som følger: serøs (S), mucinous (M), og endometrioid (E). Stjernene indikerer pasient fra hvem prøvene ble anvendt i den etterfølgende langsgående analyse. B, mottaker opererer karakteristikk for IFFO1-M. AUC = areal under kurven.
Verifisering av IFFO1-M markør for tilbakevendende eggstokkreft
Vi testet om IFFO1-M markør kunne måle sykdomsbyrden i serie i en langsgående skjerm samlet serumprøver av eggstokkreft pasienter og sammenlignet ytelsen til at av CA-125. Dette innenfor-emne sammenligning eliminerer behovet for kontrollprøver ettersom hver enkelt pasient tjener som sin egen kontroll. Serumprøver ble samlet rundt tidspunktet for kirurgi (baseline prøver) og under påfølgende oppfølgingsundersøkelse for 16 kreftpasienter på eggstokkene. Grunnlags prøver fra hver av disse 16 pasientene som ble brukt i forrige analyse (tabell S3). Elleve av de baseline prøvene ble samlet inn før operasjonen (gjennomsnitt = 11 +/- 5 dager), mens fem av dem ble samlet etter operasjonen (gjennomsnitt = 13 +/- 10 dager) (tabell S4). I gjennomsnitt ble 15 serumprøver (varierer fra 8 til 23) hentes på oppfølgingsbesøk fra hver av pasientene, med en gjennomsnittlig oppfølgingstid på 92 uker (som strekker seg fra 37 til 246 uker).
