Abstract
Fremveksten av protein kinase D (PKD) som en potensiell terapeutisk mål for flere sykdommer, inkludert kreft har utløst letingen etter potente, selektive, og celle-gjennomtrengelig små molekyl hemmere. I denne studien, beskriver vi identifikasjon,
in vitro
karakterisering, struktur-aktivitetsanalyse, og biologisk evaluering av en ny PKD hemmende stillaset eksemplifisert ved 1-naftyl PP1 (1-NA-PP1). 1-NA-PP1 og IKK-16 ble identifisert som pan-PKD-hemmere i en liten skala målrettede kinase inhibitor bibliotek analysen. Begge screening treff hemmet PKD isoformene på ca 100 nM og var ATP-konkurrerende hemmere. Analyse av flere beslektede kinaser indikerte at 1-NA-PP1 var sterkt selektiv for PKD sammenlignet med IKK-16. SAR-analyse viste at 1-NA-PP1 var betydelig mer potent og viste forskjellige substituent-effekter ved pyrazolopyrimidinforbindelse kjernen. 1-NA-PP1 var celle-aktiv, og potent blokkert prostatakreft cellevekst ved å fremkalle G2 /M arrest. Det er også en potent blokkert migrasjon og invasjon av prostata kreft celler, noe som viser lovende kreft aktiviteter på flere fronter. Overekspresjon av PKD1 eller PKD3 nesten fullstendig reversert vekststans og inhibering av tumorcelle invasjon forårsaket av en-NA-PP1, noe som indikerer at dets anti-proliferative og anti-invasive aktiviteter ble mediert ved inhibering av PKD. Interessant, kan en 12-ganger økning i følsomhet for en-NA-PP1 oppnås ved å konstruere en gatekeeper mutasjon i det aktive området av PKD1, noe som tyder på at en-NA-PP1 kan kobles sammen med den analoge følsomme PKD1
M659G for å dissekere PKD-spesifikke funksjoner og signalveier i ulike biologiske systemer
Citation. Tandon M, Johnson J, Li Z, Xu S, Wipf P, Wang QJ (2013) nytt pyrazolopyrimidinforbindelse hemmere av proteinkinase D som potente cytostatika for prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (9): e75601. doi: 10,1371 /journal.pone.0075601
Redaktør: Makoto Kanzaki, Tohoku University, Japan
mottatt: 30 januar 2013; Akseptert: 18. august 2013, Publisert: 23.09.2013
Copyright: © 2013 Tandon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (R01CA129127-01, R01CA142580-01, og P50-GM067082). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Den medforfatter Qiming Jane Wang er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Etter oppdagelsen av Glivec, det ble mye vist at svært potent og spesifikk lite molekyl hemmere av kinaser vise bemerkelsesverdig klinisk effekt og redusert toksisitet [1]. Protein kinaser er viktige regulatorer av signaltransduksjonsveier og derfor attraktive terapeutiske mål for mange sykdommer. Serin /treonin proteinkinase D (PKD) familie danner en distinkt gruppe av kalsium /kalmodulin-avhengige proteinkinaser (CAMK) [2], [3]. De tre kjente isoformer av PKD (PKD1, PKD2 og PKD3) spiller viktige roller i flere grunnleggende cellulære prosesser, herunder celleproliferasjon, overlevelse, migrasjon, genregulering, protein trafficking, og immunrespons [4], [5]. Spesielt har PKD1 vært implisert i mange aspekter av tumorutvikling, så som tumorvekst, metastase, og angiogenese [4]. Avvikende PKD aktivitet og ekspresjon har blitt rapportert i forskjellige tumorcellelinjer og tumorvev fra bukspyttkjertelen [5], skin [6], [7] og prostata [8], [9]. PKD formidler viktige signalveier som er avgjørende for kreftutvikling, inkludert VEGF og MEK /ERK signalveier [4], og støtter en aktiv rolle PKD i tumorassosierte biologiske prosesser i ulike krefttyper [5], [7], [ ,,,0],9] -. [12]
PKD er en nøkkelsignalkomponent i diacylglycerol (DAG) signaleringsnettverket. Det er et primært mål for DAG og en nedstrøms effektor av protein kinase C (PKC). Det er flere konserverte strukturelle motiver i PKD, for eksempel en C1-domene som binder DAG og modulerer PKD lokalisering, og en pH-domene som utøver en autoinhibitory funksjon på kinase domene. I intakte celler, er direkte PKD fosforylert av DAG-responsive PKCS på de to konserverte serinrester i aktiveringen løkke av det katalytiske domene, noe som fører til dets aktivering. PKD viser ofte vedvarende aktivitet ved aktivering som hovedsakelig er opprettholdt gjennom autofosforylerings [5].
I de siste årene har betydelige fremskritt er gjort i utviklingen av kraftige og spesifikke lite molekyl PKD-hemmere. CID755673 og analoger [13], [14], 2,6-naftyridin og bipyridyl-inhibitorer og deres analoger [15] – [17], 3,5-diarylazoles [18], CRT0066101 [19], og CRT5 [20] demonstrert målrettet hemming av PKD
in vitro Hotell og i intakte celler. Spesielt CRT0066101 ble funnet å sterkt blokkerer veksten av pankreas tumorxenografter
in vivo
i mus [19]. Til tross for disse betydelige fremskritt, er ingen PKD-subtype spesifikk hemmer tilgjengelig, og PKD-hemmere har ennå til å gå videre til klinikken. I del, kan fravær av kliniske kandidater tilskrives begrenset selektivitet,
in vivo
stabilitet og generelle toksisitetsproblemer med gjeldende sett med kjente hemmere. Derfor er det viktig å fortsette jakten på nye PKD hemmende chemotypes som demonstrerer attraktivt mål selektivitet, forbedrede farmakokinetiske profiler, og større
in vivo
effekt.
Vi har tidligere identifisert både ATP-konkurranse og -noncompetitive PKD-inhibitorer som er forskjellig i struktur med andre rapporterte inhibitorer [13], [14], [21] – [23]. Disse treff ble identifisert i en HTS kampanje med store, objektive små molekyl biblioteker. Deretter ble medisinske kjemi strategier benyttes for å optimalisere aktivitet, selektivitet, og fysikalsk-kjemiske egenskaper av en bly struktur, CID755673, noe som resulterer i en serie av analoger som viste økt inhibisjon target
in vitro
og i celler, og forbedret metabolsk profiler [13], [14], [21] – [24]. Heri beskriver vi identifisering og evaluering av en roman PKD hemmende chemotype basert på 1-naftyl PP1 (1-NA-PP1), en pyrazolopyrimidinforbindelse som opprinnelig ble utviklet for den analoge sensitive mutant kinase av src [25]. Dette hemmer ble identifisert i en liten, målrettet bibliotek av ulike kinase hemmere. 1-NA-PP1 oppviste utmerket selektivitet mot PKD med liten eller ingen inhiberende aktivitet for to relaterte kinaser, CAMK eller PKC. Det potent hemmet spredning, migrasjon og invasjon av prostatakreftceller. En etterfølgende SAR Analysen avdekket viktige strukturelle determinanter for bly sammensatte og posisjonerer en-NA-PP1 som en ny og tydelig PKD inhibitor chemotype med potensial til å gi utbyggingskandidater for
in vitro Hotell og
in vivo
applikasjoner.
Resultater
Identifisering av nye PKD hemmende stillasene fra en målrettet kinase inhibitor bibliotek
Åtti kjemisk ulike kinase hemmere ble valgt ut fra en Tocris Biosciences lite molekyl samling.
in vitro
PKD1 inhiberende aktivitet av disse forbindelser ble evaluert på grunnlag av deres evne til å inhibere det rekombinante PKD1 protein ved en uM konsentrasjon i et radiometrisk PKD-kinase assay. Den prosentvise PKD1 inhibering ble beregnet som den prosentvise inhibering av den totale PKD1 kinase-aktivitet i fravær av inhibitorer (DMSO). Seksten forbindelser ble identifisert som primære treff (≥50% hemming av total PKD1 kinaseaktivitet) i den radiometriske PKD1 analysen (tabell 1). Blant disse hits, 1-NA-PP1, en mutant src kinase inhibitor, og IKK-16, en IkB kinaseinhibitor, undertrykt 77% og 67% av PKD1 aktivitet ved 1 pM, henholdsvis, og ble valgt for ytterligere karakterisering basert på deres potens og tydelige strukturelle trekk.
1-NA-PP1 og IKK-16, er nye pan-PKD-hemmere
in vitro
IC
50 1-NA-PP1 og IKK-16 ble bestemt i en 10-punkts konsentrasjonskurven ved hjelp av en radiometrisk PKD kinase analyse [13]. Rekombinant humant PKD1, 2, eller 3-proteiner ble inkubert i en blanding inneholdende et peptidsubstrat avledet fra en PKD substrat, HDAC-5, og 10 forskjellige konsentrasjoner av de to forbindelsene. Som vist på fig. 1A, 1-NA-PP1 og IKK 16 hemmet alle tre isoformer av PKD med nesten lik styrken. 1-NA-PP1 inhibert PKD1, 2 og 3 med en IC
50 av 154,6 ± 21,8 nM (n = 3), 133,4 +/- 3,6 nM (n = 3), 109,4 +/- 6,8 nM (n = 3), henholdsvis, mens IKK-16 på lignende måte inhiberte PKD-isoformer med et IC
50 av 153,9 +/- 7,7 nM (n = 2) for PKD1, 115,0 +/- 7,1 nM (n = 2) for PKD2 og 99,7 +/- 3,0 nM (n = 2) for PKD3. Disse resultater indikerer at både 1-NA-PP1 og IKK 16 er potente pan-PKD-inhibitorer.
Inhibering av rekombinant human PKD1, 2 og 3 ble undersøkt i nærvær av 10 forskjellige konsentrasjoner av 1-NA-PP1 (A) og IKK-16 (B) ved en
in vitro
radiometriske PKD kinase analysen. IC
50-verdier ble beregnet som middelverdi ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter med målinger in triplo ved hver konsentrasjon av medikament i hvert eksperiment. Dataene ble plottet som en funksjon av medikamentkonsentrasjon og en representativ kurve som er vist.
1-NA-PP1 er en ATP-konkurrerende inhibitor med høy selektivitet for PKD spissen nær beslektede kinaser
for å få en bedre forståelse av virknings for en-NA-PP1 og IKK-16, undersøkte vi effekten av økende konsentrasjoner av ATP på PKD1 hemming. Lineweaver-Burk plottene ble samlet ved å plotte den inverse verdien av reaksjonshastigheter (1 /v) mot den resiproke verdi av ATP-konsentrasjoner (1 /[ATP]) ved forskjellige forbindelseskonsentrasjoner. Poengene ble montert ved lineær regresjon. Som vist Fig. 2A-B er alle linjer konvergerte på Y-aksen, noe som indikerer at både 1-NA-PP1 og IKK-16 var ATP-konkurrerende inhibitorer.
PKD1 kinase-aktivitet ble målt som en funksjon av økende konsentrasjoner av ATP i nærvær av varierende konsentrasjoner av 1-NA-PP1 (A) og IKK-16 (B). Lineweaver-Burke plott av dataene er vist. Data presentert var representative for tre uavhengige eksperimenter.
Deretter vi bestemt spesifisiteten av 1-NA-PP1 og IKK-16 for PKD ved å undersøke deres aktivitet i flere funksjonelt eller strukturelt beslektede kinaser, inkludert PKCα , PKCδ og CAMKIIα. Ingen signifikant inhiberende aktiviteter for PKC-isoformer ble påvist ved 0,1, 1 og 10 mM konsentrasjoner av 1-NA-PP1, i motsetning til IKK-16 som viste en konsentrasjonsavhengig inhibering av begge PKCα og PKCδ og 50% inhibering ved 10 uM konsentrasjon (fig. 3A-B). Den potente PKC-inhibitoren GF109203X ble testet som en positiv kontroll, og det potent og konsentrasjonsavhengig inhibert PKCα og PKCδ. PKD tilhører en undergruppe av CAMK familie og kinaser i både familier dele høy sekvens homologi. Dette fikk oss til å evaluere hemming av CAMKIIα av disse forbindelsene. Som illustrert i fig. 3C, 1-NA-PP1 viste liten aktivitet på CAMKIIα opp til 10 uM, mens IKK-16 forårsaket konsentrasjonsavhengig inhibering av enzymet og nesten fullstendig opphevet sin aktivitet ved 10 uM. Tatt sammen indikerer disse data at 1-NA-PP1 er en meget spesifikk inhibitor for PKD i forhold til andre nært beslektede kinaser inkludert PKCS og CAMKs, mens IKK-16 er sannsynligvis en promiskuøse kinase inhibitor.
Inhibering av PKCα (A) eller PKCδ (B) ble bestemt ved 10 nM, 100 nM, 1 pM og 10 pM. Som kontroller PKC-hemmer GF109203X potent hemmet PKCα og PKCδ aktivitet. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av to uavhengige eksperimenter. C. Inhibering av CAMKIIα ble målt ved hjelp av radiometriske CAMK kinase assay. Forsøket ble gjentatt to ganger, og en representativ kurve som er vist. Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av uparede t-test. ns, ikke statistisk signifikant; *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001
Videre innsikt i spesifisiteten av 1-NA-PP1 kan oppnås ved å evaluere kinome skannedata på en-naftylmetyl PP1 (. 1-NM-PP1), hvor 1-NM-PP1, sammen med 178 kjente kinase inhibitorer, ble profilert mot et panel av 300 rekombinante humane proteinkinaser ved en enkel konsentrasjon [26]. Som 1-NA-PP1, er 1-NM-PP1 også en C3-derivatisert PP1 analog som er forskjellig fra 1-NA-PP1 av bare en metylgruppe bindings pyrazol og naftylgrupper ringer. Våre data viste at en-NM-PP1 hemmet PKD1 med en IC
50 av 138,7 ± 33,2 nM (n = 3) (Fig. 3D), som var tilsvarende som for en-NA-PP1 (154,6 nM). Deres inhiberende aktiviteter for flertallet av villtype og muterte Src-familie-kinaser er også sammenlign [27], noe som indikerer at de to inhibitorene er ikke bare like i struktur, men også i biologisk aktivitet. Spesifisitet data for en-NM-PP1 ble hentet ved en cut-off av 50% rest kinase aktivitet bruker Kinase Inhibitor Resource (KIR) nettbasert verktøy (https://kir.fccc.edu/) som beskrevet (Tabell S1) [26]. Dataene bekreftet ved inhibering av PKD-isoformen av denne forbindelsen. Selv om flere mål for en-NM-PP1 ble identifisert, dette hemmer viste en relativ høy Gini score på 0,67 (en selektivitet poengsum for kinaser og kinase hemmere), som indikerer høyere selektivitet. I mellomtiden, ingen PKC-isoformer ble signifikant hemmet av denne inhibitor (mer enn 90% rest kinase aktivitet for alle PKC-isoformer). Basert på dette, og resultatene ovenfor, velger vi å fokusere utelukkende på en-NA-PP1 i våre senere studier.
Syntese og SAR analyse av 1-NA-PP1 analoger
Målet vår syntetiske studiene var å modifisere substituentene på den 1-NA-PP1 pyrazolo [3,4-
d
] pyrimidin kjernestruktur og bestemme den biologiske respons på disse endringene, så vel som for å identifisere potensielt mer PKD subtype selektive analoger. Vi vurderte 4 typer variasjoner, slik som vist i fig. 4, og forberedt totalt 18 derivater, inkludert resyntetisert forelder, en-NA-PP1.
A. 4-sone modell for en-NA-PP1 analog syntese. B. Syntese av en
H
pyrazolo [3,4
d
] pyrimidiner 1.
Bare to varianter ble utforsket i sone 1,
t
-butyl og metyl- (tabell 2). Ved en uM konsentrasjon, 1-NA-PP1 inhibert PKD1 aktiviteten med 80%, mens dens R
1 = metyl analog 1f bare førte til en 32% reduksjon av aktivitet. Alle andre analoger med metyl substituent i sone 1 og ulike erstatninger i sone 2-4 gikk enda verre og demonstrert 10% hemmende aktiviteter på 1 mikrometer konsentrasjoner. Kravet om voluminøse grupper på R «sub> en av den pyrazolopyrimidinforbindelse har tidligere vært anerkjent, og synes å være et generelt trekk for kinase-hemning med dette stillas [11]. Imidlertid, selv når opprettholde
t
-butylgruppe i sone 1, variasjoner som for eksempel innføring av en metylgruppe i sone 3 (1a), og utskifting av den naftyl substituent sammen med andre arylringer (1b-e ) ablated den PKD1 aktivitet. I henhold til vår begrenset SAR markert 1-NA-PP1 som den mest potente kongener med svært begrenset toleranse for strukturelle modifikasjoner av substituentene ved pyrazolopyrimidinforbindelse kjernen. Selv elektro derivater med en klor gruppe i sone 4 og potensialet for irreversible enzym alkylering (1j, 1k, 1m, 1p, 1r) ikke viser en økning i styrke. En tilsvarende bratt reduksjon i v-Src tyrosinkinase-hemmende aktivitet av pyrazolopyrimidinforbindelse derivater har vært nevnt tidligere, og er sannsynligvis relatert til en spesifikk hydrogenbindingsmønster i sonene 2 og 3 i det ATP-bindende lomme som ikke skal bli forstyrret [25]. Følgelig fortsatte vi vår gransking av inhibitor profil pyrazolopyrimidines på PKD med den mest potente agent, en-NA-PP1.
1-NA-PP1 er celle-aktiv og forårsaker mål hemming i prostata kreftceller
i denne studien undersøkte vi hvorvidt en-NA-PP1 var cellegjennomtrengelige og i stand til mål-hemming i intakte celler. Effekten av 1-NA-PP1 på 12-myristat 13-acetat (PMA) -indusert endogene PKD1 aktivering i LNCaP prostatakreftceller ble undersøkt som tidligere beskrevet [9], [23], [28]. PMA aktiverer PKD gjennom PKC-avhengig trans-fosforylering av Ser744 /748 (S
744/748) i aktiverings sløyfen, etterfulgt av autofosforylering av PKD1 på Ser916 (S
916) i den C-terminale ende [29], [30]. PKD1 aktivitet korrelerer godt med graden av fosfo-S
916 (p- S
916) [30]. Vi har derfor brukt p-S
916 for å overvåke PKD aktivitet og p-S
744/748 av PKD1 for å avgjøre om forbindelsen blandet med PKC-indusert trans-fosforylering av muligens hemme PKC. Som vist på fig. 5, behandling av LNCaP celler med 10 nM av PMA i 20 min indusert både p-S
916-PKD1 og p-S
744/748-PKD1 signaler. Forbehandling med økende konsentrasjon av 1-NA-PP1 konsentrasjonsavhengig inhibert autofosforylering ved p-Ser
916-PKD1 med en IC
50 22,5 ± 1,5 pM (n = 2). I motsetning til dette, PKC-avhengig trans-fosforylering ved Ser
744/748 var upåvirket av 1-NA-PP1. Dermed en-NA-PP1 spesifikt opphevet PKD1 aktivitet uten å blokkere PKC-mediert trans-fosforylering.
A. LNCaP-celler ble forbehandlet med forskjellige doser av inhibitorer for 45 min, etterfulgt av PMA stimulering ved 10 nM for 20 min. Cellelysater ble utsatt for immunblot for p-S
916-PKD1 og p-S
744/748-PKD1. Tubulin ble strøket som lasting kontroll. Forsøket ble gjentatt tre ganger, og de representative blottene er vist. B. Bestemmelse av IC
50. Western blot ble kvantifisert ved hjelp densitometry analyse. Dataene ble plottet og IC
50-verdier ble avledet av konsentrasjon-respons kurver ved bruk av GraphPad. En av de tre konsentrasjon-responskurver ble vist.
1-NA-PP1 potent blokker prostatakreft cellevekst ved å fremkalle G2 /M arrest
PKD har dukket opp som et lovende terapeutisk målrette for kreft. Her ble virkningen av målrettet inhibering av PKD ved 1-NA-PP1 på prostatacancer celleproliferasjon, overlevelse, og cellesyklusprogresjon undersøkt. Celleformering ble bestemt ved å behandle cellene ved 30 uM konsentrasjon av midlet, og deretter celleantallet ble tellet i seks påfølgende dager i nærvær og fravær av inhibitor. Veksten og cytotoksiske effekter av 1-NA-PP1 ble evaluert ved celletall tellinger og MTT-analyse. Som vist på fig. 6A, 1-NA-PP1 ved 30 uM forårsaket drastisk vekststans av PC3 prostata kreftceller som starter på dag 2 og vedvarte til slutten av forsøket (dag 6). 1-NA-PP1 også konsentrasjonsavhengig måte induserte celledød med en IC
50 23,3 ± 5,7 pM (n = 3) (fig. 6B). For å gi innsikt i effekten av 1-NA-PP1 på celleproliferasjon, undersøkte vi konsekvensen av 1-NA-PP1 behandling på cellesyklusfordeling ved hjelp av flow cytometri. Cellesyklusanalyse ble gjennomført etter behandling PC3-celler med 30 pM av 1-NA-PP1 i 72 timer. Som vist på fig. 6C, 1-NA-PP1 betydelig økt andel av celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen, noe som tilsvarer en overgang fra 5,8% celler i G2 /M i styre til 28,6% i 1-NA-PP1-behandlede -celler, og dermed til at den veksthemming forårsaket av 1-NA-PP1 er på grunn av sin evne til å indusere G2 /M rest.
A.1-NA-PP1 blokkert PC3 celleproliferasjon. PC3-celler ble sådd i tre paralleller i 24-brønners plater. Cellene ble latt bli tilkoblet over natt. En blodceller på dag 1 ble gjort, og deretter enten et kjøretøy (DMSO) eller 1-NA-PP1 10 mikrometer ble lagt. Celler ble talt daglig i totalt 5 dager. Ferske media og inhibitor ble tilsatt hver 2 dager. Midlene for tre bestemmelser ble plottet over tid. Forsøket ble gjentatt to ganger, og resultatene fra en representant eksperimentet er vist. B. 1-NA-PP1 indusert celledød i PC3-celler. PC3-celler ble sådd på 96-brønners plater (3000 celler /brønn) og ble deretter inkubert i medium inneholdende 0.3-100 pM inhibitorer i 72 timer. MTT-løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Optisk tetthet ble avlest ved 570 nm for å bestemme cellenes levedyktighet. IC
50 ble bestemt som gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter for hver forbindelse. C. 1-NA-PP1 forårsaket G2 /M fase cellesyklus arrest. PC3-celler ble behandlet med enten bærer (DMSO) eller 10 pM 1-NA-PP1 i 48 timer. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri etter propidiumjodid merking av fikserte celler. Statistisk signifikans ble bestemt ved uparet t-test og er indikert. **,
p
0,01; ***,
p
. 0,001
1-NA-PP1-indued vekst arrest er formidlet gjennom målrettet hemming av PKD
For å sikre suksess av en målrettet terapi, er det viktig å påvise mål-spesifisiteten på det biologiske plan. Våre tidligere data viste at de biologiske effekter indusert av PKD-inhibitorer phenocopied de som er forårsaket av knockdown PKD isoformer, noe som indikerer at effektene av inhibitorene ble mediert gjennom målrettet inhibering av PKD [9], [23]. I denne studien tok vi en mer direkte tilnærming for å avgjøre om en målrettet hemming av PKD står for den biologiske effekten av en-NA-PP1. Spesielt fokus på anti-proliferativ effekt av en-NA-PP1, søkte vi å finne ut om overekspresjon av PKD1 og PKD3 bruker adenovirus kan redde anti-proliferative effekter av en-NA-PP1. Som vist på fig. 7A-B, PC3 celler ble infisert med null adenovirus (Adv-null) og adenovirus bærer PKD1 og PKD3 gener (Adv-PKD1 og Adv-PKD3) på 50 og 100 MOI. De infiserte celler ble underkastet 1-NA-PP1 behandling ved 10 og 30 uM. Infeksjon med Adv-PKD1 og Adv-PKD3 reversert de anti-proliferative effekter av en-NA-PP1. De høyere nivåer av uttrykk for PKD1 eller PKD3, jo større rednings effekter, og på 100 MOI en nesten fullstendig reversering av ble observert en-NA-PP1-indusert hemming av celleproliferasjon for Adv-PKD1. Disse data indikerer at den anti-proliferative effekter av 1-NA-PP1 ble mediert ved inhibering av PKD. Det foreslår også at funksjonene PKD isoformer er sannsynligvis overflødig ettersom både PKD1 og PKD3 kan redde virkningene av en-NA-PP1.
Overuttrykte PKD1 og PKD3 i prostata kreft celler reddet anti-proliferative effekter av 1-NA-PP1. PC3 (0,5 million) celler ble sådd i en 60 mm skål og infisert den neste dag med 50 og 100 MOI adenoviruser som bærer PKD1 (Adv-PKD1) (A) og (Adv-PKD3) PKD3 (B). Målt adenovirus (Adv-null) ble anvendt som kontroll. Etter 24 timer 3000 celler /brønn ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med og uten 10 og 30 uM 1-NA-PP1 i 72 timer. MTT-løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. Optisk tetthet ble avlest ved 570 nm for å bestemme cellenes levedyktighet. Overekspresjon av PKD1 og PKD3 ble bekreftet ved Western blotting-analyse (bildene nedenfor grafene). Statistisk signifikans mellom DMSO og inhibitor behandling for hver adenovirus, så vel som mellom kontroll- og PKD adenoviruser ved hver inhibitor-konsentrasjon ble bestemt ved uparet t-test i GraphPad Prism V. ns, ikke statistisk signifikant; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001
1-NA-PP1 potent hemmer prostata svulst celle migrasjon og invasjon
PKD har vist seg å spille en viktig rolle i reguleringen av cellemotilitet , adhesjon og invasjon [4]. I denne studien ble effekten av 1-NA-PP1 på tumorcellemigrering og invasjon vurdert av to uavhengige analyser, et sårhelende assay (cellemigrering) og en Matrigel invasjon assay (celle invasjon). Som illustrert i fig. 8A, en-NA-PP1 30 mikrometer potent blokkert PC3 cellemigrasjon. Tjueto timer etter at såret, 88,6% av det sårede område i en-NA-PP1 behandlet enkeltlag å være åpen mens den i kontrollgruppen hadde helt lukket. Likeledes, 1-NA-PP1 også betydelig blokkert tumorcelle-invasjon. Behandling av celler med 30 pM 1-NA-PP1 i 20 timer resulterte i 60% inhibering av celle invasjon sammenlignet med kontrollen (Fig 8B.). Til sammen er 1-NA-PP1 en potent hemmer av prostata kreft celle migrasjon og invasjon.
A.1-na- PP1 blokkert prostatakreft cellemigrasjon. PC3-celler ble dyrket til konfluens i 6-brønns plater. Monolaget ble såret og avbildes umiddelbart (0 h). Cellene ble deretter behandlet i vekstmedium inneholdende en bærer (DMSO) eller 30 pM 1-NA-PP1 i 22 timer og sårheling ble målt. Prosentvis sårheling ble beregnet som prosent av helbredet sår område sammenlignet med det opprinnelige sår. B. 1-NA-PP1 hemmet prostatakreft celle invasjon. DU145-celler ble inkubert med 30 mM 1-NA-PP1 i Matrigel innsatser. Etter 20 timer ble invasiv celler fjernet og invasive cellene fiksert i 100% metanol, farget i 0,4% hematoxylin løsning, og fotografert. Antallet celler som invaderte Matrigel matrisen ble bestemt ved celletall på 6 felt i forhold til det antall celler som overføres gjennom reguleringsinnsatsen. Prosentvis invasjon ble beregnet som prosent av cellene invaderte gjennom Matrigel setter vs. totale celler migrert gjennom kontroll innsatsene. C. uttrykt PKD1 og PKD3 reverseres de inhiberende virkninger av 1-NA-PP1 på tumorcelle invasjon. DU145 cellene ble infisert med null, PKD1, og PKD3 adenovirus (Adv-null, Adv-PKD1, og Adv-PKD3) på 100 MOI. Etter 24 timer ble cellene utsådd i kontroll og Matrigel setter inn, og en Matrigel invasjon assay ble utført som beskrevet ovenfor. Overekspresjon av PKD1 og PKD3 ble bekreftet ved Western blotting-analyse (bildene nedenfor grafene). Alle de ovennevnte forsøk ble gjentatt minst tre ganger og data fra et representativt eksperiment vises.
For å finne ut om PKD medierer effekten av en-NA-PP1 om migrasjon og invasjon, ble redningsforsøk utført å undersøke om overexpressed PKD1 og PKD3 kunne dempe den hemmende effekten av en-NA-PP1. PC3 celler ble infisert med null adenovirus (Adv-null) og adenovirus bærer PKD1 og PKD3 gener (Adv-PKD1 og Adv-PKD3). Den invasiv egenskap av de infiserte celler ble målt ved hjelp av Matrigel invasjon assay. Som vist på fig. 8C, overekspresjon av PKD1 eller PKD3 helt snudd inhiberingen av 1-NA-PP1 på celle invasjon, til tross for sin mangel på hemmende effekter på celler invasjon når de uttrykkes alene. Disse dataene antyder at målrettet hemming av PKD formidler anti-invasive effektene av en-NA-PP1. I motsetning til dette, siden overekspresjon av PKD1 og PKD3 blokkerte migrering av PC3-celler, var vi ikke i stand til å måle store endringer i cellemigrering i nærvær eller fravær av 1-NA-PP1 ved hjelp av sårheling analyse (data ikke vist). Alternativt, undersøkte vi migrering av DU145 celler ved hjelp av migrerings kamre. Våre data viste at overekspresjon av PKD1 eller PKD3 hemmet cellemigrasjon og ikke påvirke den hemmende effekten av en-NA-PP1 på celle migrasjon (fig. S1).
En gatekeeper mutant av PKD1 er 12 ganger mer følsomme for hemming av 1-NA-PP1 i intakte celler
1-NA-PP1 er en av de C3-modifiserte analoger av Src-familie kinase inhibitor PP1. Det ble utviklet og anvendt som en svært selektiv kinaseinhibitor med ensifret nanomolare IC
50s for analog-sensitive (as) kinaser som er konstruert for å bære en enkelt aminosyresubstitusjon i gatekeeperen resten i kinase aktive området [25] , [27]. Men dette betyr mikromolar 1-NA-PP1 hemmer eller bare svakt blokkerer villtype-kinaser, som tillater inhibitoren /as-kinase paret som skal anvendes i dissekere de spesifikke funksjoner, og signaleringsmekanismer kinaser. Denne kjemiske genetiske tilnærming har blitt anvendt på en rekke proteinkinaser [27], [31] – [36]. Således spekulert vi at styrken og selektiviteten til 1-NA-PP1 for PKD kan bli ytterligere forbedret ved å introdusere gatekeeper aminosyre-mutasjoner. Innretting av det aktive sete sekvensen av PKD isoformer førte til identifisering av gatekeeper aminosyre, metionin 659 (M659), i PKD1 (Fig. 9A). Vi deretter generert to plass skape analoge sensitive PKD1 mutanter av et flagg-merket PKD1 (Flag-PKD1), nemlig Flag-PKD1
M659G og Flagg-PKD1
M659A. Etter overekspresjon i intakte celler (fig. 9B), ble den hemmende aktiviteten av 1-NA-PP1 vurdert ved forbehandling med inhibitoren etterfulgt av PMA stimulering, og påfølgende immunoblotting for pS
916-PKD1 som før (fig. 5). PKD1 og tubulin ble strøket som kontroller. Som vist på fig. 9C, Flagg-PKD1
M659G viste signifikant øket følsomhet til 1-NA-PP1 sammenlignet med villtype kontroll. Basert på densitometry analyse, IC
50 for villtype Flag-PKD1 var 26,50 ± 2,23 mikrometer, mens IC
50 for den analoge følsomme Flag-PKD1
M659G var 2,13 ± 0,61 mikrometer, reflekterer en 12 ganger økning i følsomhet for en-NA-PP1. I motsetning til dette var det ingen signifikant forskjell i inhiberingen av Flag-PKD1
M659A av 1-NA-PP1 sammenlignet med villtype-Flag-PKD1 (data ikke vist), noe som indikerer at M659A mutasjonen var ute av stand til å sensibilisere PKD1 til hemming av 1-NA-PP1. Tatt sammen, våre data indikerer at den inhiberende aktivitet av 1-NA-PP1 for PKD1 kan bli ytterligere forbedret ved å innføre gatekeeper mutasjon, noe som tyder på at 1-NA-PP1 kan være forbundet med det analoge følsomme PKD1
M659G for å bestemme PKD-spesifikke funksjoner og signalveier i intakte celler.
A.Alignment av de viktigste sekvensene inneholder gatekeeper aminosyre i PKD. Pil viser konsensus gatekeeper aminosyren «metionin» (M) i en skygge rektangel. B. Uttrykk for villtype og mutant PKDs. HEK293 celler ble transfektert med villtype og to gatekeeper mutanter av Flag-PKD1 (Flag-PKD1
M659G og Flagg-PKD1
M659A). To dager etter transfeksjon ble cellene lysert og utsatt for Western blotting for PKD1 og tubulin (lasting kontroll). C. 1-NA-PP1 konsentrasjonsavhengig hemmet PMA-indusert aktivering av Flag-PKD1 og Flag-PKD1
M659G. HEK293 celler transfektert med flagg-PKD1 og Flag-PKD1
M659G ble serum-sultet i 24 timer og forbehandlet med 1-NA-PP1 ved økende konsentrasjoner i serumfritt medium i 45 min, etterfulgt av stimulering med PMA i 10 nM for 20 min. Cellene ble høstet og underkastet immunblotting for p-S
916-PKD1, PKD1, og tubulin. Forsøket ble gjentatt tre ganger og representative bilder fra en eksperiment vises.
Diskusjoner
PKDs spiller viktige roller i mange grunnleggende biologiske prosesser og representerer en ny terapeutisk mål for mange patologiske tilstander og sykdommer. Men den nøyaktige biologiske funksjon av PKD er ikke blitt godt definert. Svært selektive og celle-gjennomtrengelig PKD lite molekyl hemmere er ikke bare potensielle legemiddelkandidater, men også kraftige verktøy for en systemisk evaluering av PKD-spesifikke funksjoner og signalveier i komplekse biologiske systemer.
