Abstract
I denne studien har vi utviklet, preget og validert
in vitro
en funksjonell superparagmagnetic jern-oksid basert magnetisk resonans kontrastmiddel ved konjugering en kommersielt tilgjengelig jernoksid nanopartikler, Molday ION Rhodamine -B Carboxyl (MIRB), med en deimmunized mus monoklonalt antistoff (muJ591) rettet mot prostata-spesifikt membran antigen (PSMA). Dette funksjonelle kontrastmiddel er beregnet for spesifikk og ikke-invasiv påvisning av prostatakreftceller som er PSMA positiv, en markør implisert i prostatatumorprogresjon og metastase. De to-trinns karbodiimid reaksjon anvendes for å konjugere antistoffet til nanopartikkel var effektiv, og vi oppnådd et elementært jerninnhold på 1958 ± 611 per antistoff. Immunfluorescens-mikroskopi og strømningscytometri viste at det konjugerte muJ591: MIRB kompleks bindes spesifikt til PSMA-positive (LNCAP) -celler. Den muJ591: MIRB kompleks redusert celle adhesjon og celleproliferasjon på LNCaP celler og forårsaket apoptose som testet av Annexin V-analysen, noe som tyder på anti-tumorigene egenskaper. Målinger av T2-relaksasjonstid for muJ591: MIRB komplekset ved hjelp av et 400 MHz Innova NMR og en multi-ekko spinn-ekko-sekvens på en 3T MR (Achieva, Philips) viste en signifikant T2-relaksasjonstid reduksjon for muJ591: MIRB kompleks, med en redusert T2-relaksasjonstid som en funksjon av jernkonsentrasjonen. PSMA-positive celler behandlet med muJ591: MIRB viste en vesentlig kortere T2-relaksasjonstid som oppnådd ved anvendelse av en 3T MR-skanner. Reduksjonen i T2 avslapping tid for muJ591: MIRB, kombinert med sin spesifisitet mot PSMA + LNCaP celler, foreslår sitt potensial som en biologisk bestemt MR-kontrastmiddel
Citation. Bates D, Abraham S, Campbell M, Zehbe jeg, Curiel L (2014) Utvikling og karakterisering av et antistoff-Merket Super-Paramagnetic jernoksid kontrastmiddel Targeting prostata kreft celler for Magnetic Resonance Imaging. PLoS ONE 9 (5): e97220. doi: 10,1371 /journal.pone.0097220
Redaktør: Roberto Furlan, San Raffaele Scientific Institute, Italia
mottatt: 13 desember 2013; Godkjent: 16 april 2014; Publisert: 12 mai 2014
Copyright: © 2014 Bates et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Ontario Institute for Cancer Research gjennom et forskningsstipend (10NOV-446) og National Sciences og Engineering Research Council of Canada. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de siste 10 årene har forekomsten av prostatakreft har stadig økt, gjenstår den nest vanligste kreftformen diagnostisert hos menn over hele verden. I Canada alene, det står for om lag 27% av nydiagnostiserte kreft i 2012 [1]. Prostata tumorvekst og spredning er ofte svært treg og forbli uoppdaget på tidlige stadier av kreft. Nåværende deteksjon og behandling planlegging tungt avhengig av bruk av prostataspesifikt antigen (PSA) -expressing celler. Imidlertid har lav spesifisitet av denne testen resulterte i overbehandling av tidlig og mindre aggressiv cancer og under-behandling av lat men aggressiv cancer, som fører til høy sykelighet [2]. I tillegg nåværende behandlinger har høy sykelighet og mulige etterbehandling tilbakefall, som kompromiss pasientens livskvalitet og overlevelse [3], [4].
Studier har antydet at ved spesielt rettet mot prostata spesifikt membranantigen (PSMA) uttrykkende celler, både lokalt og aggressive betingelser kan behandles [3], [5] – [17]. PSMA er en meget karakterisert prostatakreft biomarkør lokalisert til prostatakreft cellemembranen, noe som tyder på dens nytte for
in vivo
prostatakreft spesifikke målrettingsstrategiene [8], [9], [13] – [17]. Den PSMA-genet har blitt klonet, sekvensert, og kartlagt til kromosom 11q14, og det uttrykkes i en høy andel av ondartet prostata epitelceller, men ikke i den normale vaskulære endotel [6]. Faktisk er PSMA den mest veletablert svært begrenset prostata epitelial cellemembranantigenet, mens PSA og prostatisk sur fosfatase er sekretoriske proteiner [9], [17]. Immun og deteksjons tilnærminger som bruker anti-PSMA antistoffer har blitt foreslått som gode verktøy for både deteksjon og behandling av prostatakreft [8], [9], [13].
PSMA reseptorer lokalisert hovedsakelig til den apikale plasma membran av prostata epitel og spiller en viktig rolle i utviklingen av prostata maligniteter, sannsynligvis ved å fremme anti-apoptotisk signalering, som sikrer celle elastisitet og fremme celleproliferasjon [6], [18]. Målretting av denne reseptoren med anti-PSMA J591 antistoff har vist seg å være en effektiv deteksjon og terapeutisk verktøy for prostatakreft [10] – [12]. For å være klinisk anvendelig, det musemonoklonalt (mAb) anti-PSMA-reseptor er de-immunisert ved erstatning av murine immunoglobulin-sekvenser med humane immunoglobulinsekvenser, noe som resulterer i et ikke-immunogent, humanisert antistoff, huJ591 [9], [13] – [15]. Den huJ591 mAb har vært mye brukt i fase I kliniske studier, hvor det har vist seg å være godt tolerert uten uønskede vertens immunrespons [9], [14], [15].
Endorectal magnetic resonance imaging (MRI) er blitt vanlig del av det lokale arbeidet opp for prostatakreft. Dynamiske studier ved bruk av gadolinium-DTPA-kontrastmidler har vist nyttig forbedring av tumorbilder [19] – [27]. Non-invasiv påvisning av PSMA-uttrykke celler kunne ideelt sett utføres av funksjonelle kontrastforsterket MR-teknikker. Kontrastmidler øke kontrasten av vev ved å endre avslapping tider av vev for å bedre synligheten av strukturer via MR. Slike påvisningsmetodene krever utvikling av funksjonelle MRI-kontrastmidler, for eksempel bindings anti-PSMA-antistoff til MRI-kontrastmidler. Molday ION Rhodamine-B Karboksyl (MIRB) er en kommersielt tilgjengelig jern-oksid baserte nanopartikkel som reduserer T2-relaksasjonstiden for absorberende vev og således bli detektert som et tap i signal på MR-bilder [28], [29]. Jernoksyd kjerne MIRB nanopartikler kan aktiveres kjemisk å reagere med den aminoterminale av proteiner eller antistoffer for å danne en peptidbinding, noe som ga et antistoff /protein: MIRB konjugerte komplekse. En fersk studie viste at MIRB kan brukes til å merke stamceller, kreftceller og immunceller bevare høye celle viabilities og påvises ved MR [28]. MIRB er enkel konjugering med protein eller antistoff, sin høye laste konsentrasjon av jern for MR og god celle toleranse gjør det til en god kandidat for et funksjonelt antistoff-merket MR-kontrastmiddel.
I denne studien har vi utviklet en funksjonell superparamagnetiske jernoksid (SPIO) -baserte MR-kontrastmiddel som spesifikt festes til PSMA reseptorer for MR av prostata kreft celler. Vi presenterer en metode for å utvikle dette funksjonelle MR-kontrastmiddel ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig SPIO, Molday ION Rhodamine-B Carboxyl (MIRB), konjugert til anti-PSMA reseptor antistoff J591. Vi preget og validert dette antistoffet: SPIO-nanopartikkel kompleks for spesifikk påvisning av PSMA positiv prostata kreft kreftceller ved hjelp av immunfluorescens, flowcytometri og 3T klinisk MR. Vår nye kontrastmiddel kan anvendes for det spesifikke og ikke-invasiv påvisning av prostatakreftceller med PSMA, en markør implisert i prostatatumorprogresjon og metastase [10] -. [17], [30], [31]
Materialer og metoder
Antistoffer, MR kontrastmidler og reagenser
Murine J591 mAb, i en konsentrasjon på 5 mg /ml og med kjent spesifisitet for PSMA, ble anskaffet fra Dr. Neil H Bander laboratorium (Laboratory of Urologisk Oncology, Weill-Cornell Medical College, New York, NY, USA) gjennom en institusjonell materialet overføringsavtalen. Den isotypekontrollantistoff for syntese og cellekultur eksperimenter var en murin lgG1 (monoklonalt muse IgG1 Klon # 11711; Cat #: MAB002, R en buffer bare (negativ kontroll) ble likeledes spaltet. Alle prøvene ble kjørt på Varian Vista Pro CCD samtidig ICP-OES instrument (Varian Inc, Palo Alto, CA, USA).
Scanning elektronmikroskopi (SEM) og energi dispersive X-ray (EDX) spektroskopi
De komplekse muJ591: MIRB ble immobilisert på en Nucleopore membran (Cat #: 800280, Whatman, Florham Park, NJ, USA) og oppvarmet ved 57 ° C i en varmluftsovn i 25 min for å fjerne fuktighet. Den immoblized komplekset ble deretter montert og frese-belagt med karbon. SEM bildene ble kjøpt til 5000 og 10000 × forstørrelse ved hjelp av en Hitachi Su-70 Schotty Feltet Emission SEM (Hitachi Høy Technologies America Inc, Dallas, TX, USA) med en oppløsning på 1,5 nm på 1 kV. Det samme systemet ble brukt til å utføre Energy Dispersive X-ray (EDX) spektroskopi ved 5000 x forstørrelse for å bekrefte tilstedeværelsen av organisk materiale og SPIO nanopartikler.
Partikkel-størrelsesanalyse
Partikkelstørrelse av muJ591: MIRB konjugat ble bestemt ved dynamisk lysspredning. Den muJ591: MIRB konjugat ble dispergert i 0,9% saltløsning ved en proteinkonsentrasjon på 0,01% vekt /volum. Målinger ble utført under anvendelse av et Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, Worchestershire, UK). Partikkelstørrelsen resultatene ble rapportert som den harmoniske intensitet i gjennomsnitt partikkel diameter (eller Z-gjennomsnitt), og de er uttrykt i nanometer.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analyse
For å avgjøre om muJ591 : MIRB konjugat generert fra merke reaksjoner beholdt super-paramagnetisk egenskapene som kreves av en MR-kontrastmiddel, vi målte T2 avslapping tid i NMR. Prøver med lik total proteinkonsentrasjon (0,04 ug /ul) av muIgG: MIRB og muJ591: MIRB kompleksene ble fremstilt hver for seg i 600 mL av deuteriumoksyd og overført til Wilmad NMR-rør (Cat #: Z272019, Sigma Aldrich, St. Louis, MO , USA). T2 avslapping ganger ble oppnådd etter optimalisere magnetfelt Innova Unity 500 NMR-maskin og prøvene ble kjørt i henhold til produsentens anbefaling.
fluorimetrisk analyse
For å teste om konjugering reaksjon forårsaket fluorescens ekstrautstyr eller slukke av Rhodamine-B fluorophore på MIRB konjugater vi utført en fluorimetrisk analyse. MIRB nanopartikler og muJ591: MIRB komplekser prøver med en lik jernkonsentrasjon ble analysert for fluorescens intensitet og bølgelengde med maksimal intensitet (λ
max) ved hjelp av en Synergy4 fluorimetrisk plateleser (BioTek, Winooski, VT, USA). Toppen λ
max og λ
max skift ble bestemt ved å plotte de fluorescens intensitetsverdier på ulike eksitasjon og emisjonsbølgelengder.
Cell kultur
PSMA-positive LNCaP celler (CRL -1740) og PSMA-negative DU145 celler (HTB-81) ble anskaffet fra American Type Cell Culture, Manassas, VA, USA. Alle celler ble dyrket i en 37 ° C, 5% CO
2 inkubator ved bruk av RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika /antimykotika. Cellene ble dyrket til 80% samløpet i 75 cm
2 ventilert cap, skråstilt nakken falk kolber (Cat #: 353136, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) med media etterfylles hver tredje dag
antistoff: MIRB kompleks spesifisitet for PSMA
celler ble sådd ut ved en initial konsentrasjon på 1000 (for DU145) og 2000-celler (for LNCaP) per brønn i 96-brønners plater og dyrket i 3 dager før utfører forsøkene. Immunfluorescens Studier ble deretter utført på både LNCaP og DU145 etter behandling med 0,1 ug /ul muJ591: MIRB i 1 time med eller uten tilsetning av sekundært antistoff konjugert til AlexaFluor-488 fluoroforen. Deretter ble cellene inkubert med varm 0,5% BSA i RPMI-medium for å stimulere celler til å internalisere antistoffet. Cellene ble deretter visualisert ved forskjellige tidspunkter (15 min, 30 min, 1 H, 1,5 timer, 2 timer, 4 timer, 6 timer og 12 timer) under en standard invertert fluorescens mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss. Gottingen, Tyskland ) festet til en lukket krets kamera (12-bit, Q-Imaging, Surrey, Canada).
A flowcytometrisk analyse ble utført basert på en modifikasjon av metoden beskrevet av Peldschus K et al (2010) [ ,,,0],32]. Cellene ble løsnet ved hjelp av trypsin-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA) som ble inaktivert ved vasking med 10% FBS RPMI-1650. Cellene ble deretter vasket to ganger ved anvendelse av serum-fritt RPMI-1640, før tilsetningen av 250 ul muIgG, muIgG: MIRB, muJ591, muJ591: MIRB (proteinkonsentrasjon på 0,05 ug /ul), etterfulgt av en times inkubasjon på is. De ubehandlede kontrollene ble inkubert i et tilsvarende volum av serum-frie medier. Cellebundet antistoff-konjugater ble merket for deteksjon ved hjelp Phycoerthyrin-konjugert geit-anti-mus IgG (Cat # 550589, BD Pharmingen). Strømningscytometri ble deretter utført ved anvendelse av et FACSCalibur anordning (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, USA). Fluorescens måling ble gitt som geometrisk gjennomsnitt og median på 10.000 hendelser og plottet som diagrammer. Forsøkene ble gjort i tre paralleller og vi sammenlignet signalintensitet skift mellom ubehandlede celler og celler behandlet med muIgG, muIgG: MIRB, muJ591, eller muJ591. MIRB
Cell vedheft
Cell heft etter behandling av plater med muJ591 og muJ591: MIRB ble evaluert. Den muJ591: MIRB kompleks og muJ591 mAb ble fremstilt i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) ved en konsentrasjon på 0,01 ug /ml. Vi deretter forhåndsbelagt 96-brønners plater med 100 ul av muJ591: MIRB kompleks og muJ591 mAb i quadruplicates, og inkubert over natten ved 4 ° C for immobilisering av komplekset på plateoverflaten. Etter inkubering over natten, vi suges ut oppløsningen, og blokkerte brønner med 1% BSA i 1 x PBS i minst 10 minutter, og suges ut igjen. Ubehandlet brønner ble brukt som kontroll. Ca 100000 LnCap eller DU145-celler ble deretter sådd ut på forbelagte og kontrollbrønnene og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 til 40 minutter. Cellene ble til slutt vasket med serumfritt RPMI-1640 til celler i de ubelagte brønnene stoppet løsne. Alle celler ble deretter fiksert ved hjelp av is-kald metanol og farget med 0,1% krystallfiolett. Filtrert 2% SDS ble tilsatt, og platene ble inkubert under omrøring ved romtemperatur i 30 minutter, etter hvilken tid, absorbansavlesninger ved 550 nm ble tatt ved bruk av POWERWAVE XS plateleser (BioTek, Winooski, VT, USA). Vi sammenlignet absorbansavlesninger fra muJ591- og muJ591:. MIRB-belagte plater i forhold til de ubehandlede kontrollbrønnene for å analysere adhesjon
celleproliferasjon og apoptose
For celleproliferasjon vurdering, en resazurin -baserte fluorimetrisk analyse (Cat # AR002, R A, B og T2 er de passende parametere [34]. En parametrisk avbildning av T2 avslapping tid ble innhentet for alle bilder av antistoffprøver og antistoff-behandlede celler. Den gjennomsnittlige T2 avslapping tid for hvert antistoff og levende celleprøve ble hentet fra T2 verdiene for hver piksel i disse para bildene.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Graphpad Prism programvare ( GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA). Alle data ble testet for normalitet og homogeniteten av varianser ved hjelp av en Shapiro-Wilks test og en test Bartlett, henholdsvis, før man velger en passende parametrisk eller ikke-parametrisk statistisk test. Et resulterende p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett for å være signifikant. Paradatasettene ble analysert ved hjelp av Student t-tester eller enveis ANOVAs, etterfulgt av en hensiktsmessig post-hoc for eksempel en Tukey HSD. Ikke-paradatasettene ble analysert ved hjelp av enveis Kruskal Wallis ANOVA etterfulgt av en Nemenyi innlegg hoc, og Friedman tester etterfulgt av en parvis sammenligning bruker en Wilcoxon signert rank test med en Bonferroni justering.
Resultater
antistoff: MIRB kompleks molekylær karakterisering
ICP-AES ble anvendt for å beregne mengden av elementært jern til stede i hver av de konjugerte muIgG: MIRB og muJ591: MIRB komplekser. Vi har observert at muJ591: MIRB komplekser hadde 1958 ± 611 (n = 8) elementært jern per antistoff, mens muIgG: MIRB komplekser hadde 2906 ± 631 (n = 8) elementært jern per antistoff. Den jernnanopartikler tilstedeværelse på muJ591: MIRB komplekset ble ytterligere bekreftet av energi dispersive X-ray spektroskopi (figur 1). Nærværet av jern ble også bekreftet ved en rask relaksasjonstid T2 oppnådd ved NMR-analyse ved 400 MHz, som var 12,9 ± 0,7 ms for muJ591: MIRB kompleks og 10,2 ± 0,6 for muIgG:. MIRB kompleks
A. Skanning elektronmikroskop (SEM) av immobilisert muJ591: MIRB komplekser og B. energi dispersive X-ray (EDX) kartlegging for Fe, C, O og N lagt på SEM. Tilstedeværelsen av MIRB nanopartikler kan observeres som jern signal (fast pil) og antistoffet som organisk materiale signal (stiplet pil). De store hvite strukturer er salter fra den tørkede bufferen
Nærværet av muJ591:. MIRB kompleks immobilisert på saltkrystallene fra bufferen kan observeres i de overlagrede EDX-SEM-bilder (Figur 1). EDX kartleggingen viste tilstedeværelse av karbon, nitrogen og hydrogen, noe som tyder på tilstedeværelse av organiske komponenter (antistoff) samt jern fra MIRB nanopartikkel
De gjennomsnittlige partikkelstørrelser for den muJ591:. MIRB konjugater var 34,75 ± 14,41 nm med en polydispersitet indeks (PDI) verdi på 0,23 ± 0,01. Til sammenligning utførte vi partikkelstørrelse målinger for de MIRB nanopartikler alene og fikk 34,64 ± 10,83 nm med en PDI på 0,25 ± 0,02 som er innenfor de rapporterte av produsenten (35 nm) verdier
antistoff. MIRB kompleks spesifisitet
immunfluorescens-mikroskopi ble benyttet for å bestemme hvorvidt PSMA positiv LNCaP-celler ble spesifikt påvist ved den muJ591: MIRB kompleks. Figur 2 viser to timer etter behandlingstidspunktet, for både LNCaP og DU145 celler behandlet med muJ591: MIRB kompleks. AlexaFluor-488 farging tillatt for lokalisering av antistoffet innenfor sub-cellulære og ekstracellulære regioner av PSMA-uttrykk LNCaP-celler (figur 2A). Den Rhodamine-B fluorofor (rødt) som er festet til MIRB ble spesifikt påvist i PSMA-uttrykkende LNCaP-celler (figur 2C). Ingen røde eller grønne fluorescerende signaler ble observert i DU145 kontroll cellelinje (figur 2B og 2D) tyder høy spesifisitet muJ591: MIRB kompleks i å oppdage PSMA-positive prostatakreftceller
Fluorescensmikroskopi basert deteksjon av PSMA-. positiv prostatakreft cellelinje med muJ591: MIRB komplekset: Sekundært antistoff farging konjugert til AlexaFluor-488 viser binding av J591 antistoff i (A) LNCaP og mens (B) DU145 kontrollceller har ingen binding; og (C) Rhodamine-B fluorophore ble observert på LNCaP celler (PSMA-positiv) og ikke på (D) DU145 cellene (PSMA-negative).
fluorescens leskende og utslipp forbedring er rapportert for metall-fluoroforen konjugerte systemer [35]. Vi er fast bestemt på at fluorescerende quenching skjedde i vårt system ved å sammenligne fluorescens intensitet og peak λ
maks MIRB alene og muJ591: MIRB kompleks (figur 3). Den λ
max for MIRB alene var 575 nm, mens for muJ591: MIRB komplekse, λ
max viste to tydelige topper mellom 560-575 nm. I tillegg fluorescensstyrkene mellom topp X
høyeste verdi var 40 ± 2% lavere for muJ591: MIRB kompleks sammenlignet med MIRB alene. Denne reduksjonen i toppverdi og skiftet i peak λ
maks for den Rhodamine-B fluorophore antyder at konjugering kan slukke fluorescens kapasitet på Rhodamine-B fluorophore for komplekset.
Effekt av antistoff konjugering på den relative fluorescens intensitet Molday ION Rhodamine-B-komplekset (n = 3)
spesifisitet og opptak av muJ591. MIRB sammenliknet med ikke konjugert muJ591 og kontrollere muIgG ble undersøkt på live prostatakreft cellelinjer ved hjelp av strømningscytometri. LNCaP-celler ble behandlet med muJ591 eller muJ591: MIRB viste en signifikant fluorescens intensitet skift på FL-2, sammenlignet med de ubehandlede celler eller MIRB-bare behandling og de begge hadde en tilsvarende forskyvning (figur 4A). Skiftet for muJ591 og muJ591: MIRB behandling av LNCaP celler viser at det er konkret og høyt opptak av antistoff og antistoff-nanopartikkel kompleks av PSMA positive celler, og at det ikke endres etter konjugering med nanopartikler. Ikke-spesifikk binding som testet av muIgG og muIgG: MIRB ble ikke observert (tabell 1). Kontroll DU145 cellene blottet for PSMA viste ikke endring i intensitet for enhver behandling (figur 4B)
spesifisitet og opptak av muJ591. MIRB, muIgG: MIRB, muJ591 og muIgG av prostata kreft celler. A. LNCaP celler presenterte et skifte som viste opptak av muJ591 og av den konjugerte muJ591: MIRB og ingen opptak for kontrollene muIgG antistoff eller muIgG: MIRB antistoff konjugert. B. Kontroll DU145 cellene viste ikke opptaket
antistoff. MIRB kompleks funksjonalitet
Vi bestemte de potensielle anti-proliferative, pro-apoptotiske og anti-tumorigen effekter av den muJ591: MIRB konjugert nanopartikler. På plater belagt med både muJ591 og muJ591: MIRB absorbansen lesing viste en redusert klebeevne på LNCaP celler seeded etter belegg (figur 5A, p 0,01). Det var ingen forskjell i virkning på klebeevnen mellom muJ591 antistoffet og muJ591: MIRB kompleks (p = 0,7). Belegget hadde også en effekt på DU145 cellene klebrighet, men det var mindre uttalt (figur 5B). Disse resultater antyder at effekten av muJ591 antistoff på celle klebrighet forble upåvirket av antistoff-merking med MIRB.
A. Betydelig redusert vedheft på LNCaP celler (t-test, ** p 0,01, n = 4) ble observert som en reduksjon på absorbans forårsaket av både muJ591 mAb og muJ591: MIRB belegg. B. Adhesjon ble også redusert med dette belegget på DU145 celler, men effekten var ikke så uttalt.
Resazurin-baserte fluorometriske analyser utført på 2, 6, 12 og 24 timer etter behandling bestemmes anti-proliferative effekter av muJ591: MIRB på PSMA-positive LNCaP prostatakreftceller. En tidsavhengig reduksjon i celleformering i LNCaP-celler og ingen endring i PSMA-negative DU145-celler ble observert (figur 6). Dette tyder på at muJ591: MIRB var meget spesifikke i å begrense celleformering av LNCaP-celler
Virkning på celle-proliferasjon av LNCaP og DU145 prostatakreftceller følgende muJ591:. MIRB behandling ved forskjellige tidspunkter oppnådd som den normaliserte Resazurin fluorescerende enhet (RFU) verdi for behandlede celler enn ikke-behandlede celler. LNCaP celler viste en betydelig lavere RFU enn kontrollbehandlede LNCaP celler som starter på 6 timer tidspoeng, mens ble det ikke observert signifikante endringer i muJ591: MIRB behandlet DU145 cellene. Student t-test, * p 0,05 anses vesentlig, n = 4.
Det var betydelig høyere nivåer av Annexin V positive celler i muJ591: MIRB-behandlede LNCaP celler sammenlignet med kontrollgruppen (kjøretøy eller muIgG : MIRB) behandlet LNCaP celler. Figur 7 viser prosentandelen av levende og døde LNCaP-celler som vurdert av Annexin V flowcytometri, i nærvær av muJ591: MIRB og kontrollbehandlinger;
