Abstract
Vi beskriver en roman bioinformatiske og translasjonell patologi tilnærming, genet Signatur Finder algoritme (gSFA) for å identifisere biomarkører forbundet med tykktarmskreft (CRC) overlevelse. Her et robust sett CRC markører velges som et ensemble metode. Ved å bruke et datasett fra 232 genuttrykk profiler, oppdager gSFA 16 svært viktige små gen signaturer. Analyse av dichotomies generert av signaturene resulterer i et sett med 133 sampler stabilt klassifisert i god prognose gruppe og 56 prøver i dårlig prognose gruppe, mens 43 forbli unreliably klassifisert.
AKAP12
,
DCBLD2
,
NT5E Hotell og
SPON1
er særlig representert i signaturer og valgt for validering
in vivo
på to uavhengige pasienter kohorter som omfatter 140 tumorvev og 60 matchet normalt vev. Deres uttrykk og regulatoriske programmer er undersøkt
in vitro
. Vi viser at den koplede uttrykk for
NT5E
og
DCBLD2
robust stratifiserer våre pasienter i to grupper (hvorav den ene med 100% overlevelse ved fem år). Vi viser at
NT5E
er et mål av TNF-α signale
in vitro
; tumor suppressor PPARy fungerer som en roman
NT5E
antagonist som positivt og samtidig regulerer
DCBLD2
i en kreftcelle kontekstavhengig måte
Citation. Pagnotta SM, Laudanna C , Pancione M, Sabatino L, Votino C, Remo A, et al. (2013) Ensemble of Gene Signaturer Identifiserer Novel Biomarkører i tykktarmskreft Aktivert gjennom PPARy og TNFa signale. PLoS ONE åtte (8): e72638. doi: 10,1371 /journal.pone.0072638
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 18 april 2013; Godkjent: 11 juli 2013; Publisert: 19 august 2013
Copyright: © 2013 Pagnotta et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Minis dell’Università e della Ricerca henhold stipend (PRIN2008-20085CH22F) og av Associazione Italiana per la lotta ai linfomi e leucemie. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste kreftformen på verdensbasis og en utbredt årsak til sykelighet og dødelighet. CRC overlevelse er nært knyttet til klinisk og patologisk stadium av sykdommen ved diagnose; over en tredjedel av CRC pasienter dø innen fem år fra den første diagnosen og de fleste av dødelig utfall skyldes levermetastaser [1].
Til tross for den nylige lanseringen av mer effektive terapeutiske midler, er det bare noen få validerte prognostiske biomarkører å vurdere aggressivitet av sykdommen og sannsynligheten for tilbakefall eller død etter operasjonen. Nyere studier foreslår små gen signaturer som kjennetegner tumorstadium [1,2]. Oppdatert integrerende studier oppdaget presiseringer av
ErbB2 Hotell og
IGF2 Hotell og gener betydelig mutert i CRC som
APC, TP53, SMAD4, PIK3CA Hotell og
KRAS
som potensielle terapeutiske mål [3]. Således vil den nøyaktige identifikasjon av prediktive og prognostiske markører kombinert med økende arsenal av terapeutiske midler tilveiebringe mer effektiv behandling relatert til pasientens molekylprofilminimallivstruende toksisitet [4].
Vi utviklet en ny beregningsorientert tilnærming , genet Signatur Finder algoritme (gSFA) for å generere flere små gensettene som stratifisere pasienter i form av overlevelse. Vår strategi gjør bruk av tilgjengeligheten av store genekspresjon datasett for å velge kandidater som kan deretter validert i uavhengige biblioteker av vev. Vi nærmet problemet med å trekke ut egnede funksjoner fra global genekspresjon som best korrelerer med klinisk informasjon for å skape prognostiske signaturer. De fleste av de nåværende fremgangsmåter er basert på ekspertkunnskap for å velge blant flere tusen gener, molekylære markører som kan forbindes med prognose [5]. Nylig, nye metoder, jordet på data mining, maskinlæring [6] og statistisk regresjon [7] for «Signatur læring » har blitt foreslått. Dette er et interessant tema i Computational Biology og kan modelleres som et problem for optimal utvalg funksjonen [8]. Her har vi tatt i bruk som optimalitet kriterium betydningen av log-rank test mellom overlevelseskurver for gruppene indusert av de valgte funksjonene og brukte en roman prosedyre som integrerer flere signaturer som genereres av en grunnleggende grådig algoritme. Signatur gener blir deretter rangert på grunnlag av noen rille beregninger som måler bidraget av genet for å underskriftene den tilhører.
Fra en offentlig datasett fra to hundre og trettito CRC genuttrykk profiler, vår algoritme valgt, blant annet overlevelsesrelaterte biomarkører som
AKAP12, DCBLD2, NT5E
, og romanen CRC-spesifikke markører for eksempel
SPON1
. Vi skjermet kandidatgener på to uavhengige kohorter av 140 pasienter med primær sporadisk CRC ved hjelp immunhistokjemi på microarray (TMA). Variasjonene i genuttrykk ble deretter testet i en
in vitro
cellesystem som bekreftet
in vivo
data. Kollektivt, våre data gi en ny metode for å identifisere nye og robuste biomarkører som et verdifullt skritt mot en bedre prognostisk lagdeling og behandling av pasienter.
Materiale og metode
Mikromatrise datasett
Vi bruker
gSFA plakater (beskrevet nedenfor) til offentlige datasett for å identifisere et sett av biomarkører. Dataene tas i betraktning er de fra samlingene rapportert i [9] og tilgjengelig som GSE17536 og GSE17537 datasett i Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Begge datasettene er genuttrykk profilering oppnås ved hjelp av Affymetrix Genechip Human Genome U133 Plus 2.0 Array. GSE17536 teller 177 prøver på 54613 gen-prober, mens GSE17537 har 55 prøver på de samme prober. De 232 rå celle filene ble lastet ned fra begge samlingene, så bakgrunnskorreksjon, quantile normalisering og samandrag ble brukt.
tumorprøver
Vi analyserte CRC prøver fra to uavhengige pasientenes kohorter som omfatter en testserie og en validerings serie (I og II), henholdsvis. Cohort I omfatter nittiåtte CRC tilfeller og 60 paret tilsynelatende normal slimhinne fjernes i samme operasjon. Dette datasettet omfatter både parafin innebygd og flytende nitrogen frosset prøver, som rapportert [10,11]. Cohort II består av 42 tilfeller av sporadisk CRC innsamlet ved Avdeling for patologi og onkologi, Legnago Hospital Verona, Italia i perioden 2005-2007. Svulster ble klassifisert og gradert i henhold til kriteriene for TNM og kreft etapper klassifiseringssystemer I-IV; Gjennomsnittsalderen for pasientene var 71,2 ± 18,21. Ingen av pasientene hadde en familiær historie med intestinal dysfunksjon eller CRC, hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før reseksjon heller hadde tatt ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler på en jevnlig basis. Konvensjonelle postoperative behandlinger ble gitt til alle pasienter, avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen. Samlet lengde av overlevelse ble beregnet ut fra den første operasjonen. Pasientene ble fulgt opp med en median på 55 måneder eller inntil døden.
Immunhistokjemisk analyse og evaluering av flekker
For immunhistokjemisk analyse, ble vevssnitt deparaffinized, hydrert i gradert alkohol, og mikrobølgeovn behandlet for 20 minutter ved 750 W. Heat-indusert epitop gjenfinning ble utført ved oppvarming av TMA skred midt i henting buffer citrate (pH 6,0). Snittene ble inkubert med 3% hydrogenperoksid i 20 minutter ved romtemperatur, og deretter med de spesifikke antistoffer: AKAP12 (fortynning 1: 500; WH0009590M1, mus monoklonalt, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Spondin1 (fortynning 1: 250, AB40797, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK)); NT5E (fortynning 1:50; AB115289, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK); og DCBLD2 (fortynning 1: 100; AB115451, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK) alle antistoffene ble inkubert over natten ved 4 ° C. Sekundære antistoffer, etterfulgt av streptavidin-pepperrot system ble inkubert i 30 minutter hver, ved hjelp av streptavidin-biotin-peroksidase kit-farging (LSAB + System- HRP; Dako Cytomation, Glostrup, Danmark). Immunreaktiviteten ble avslørt ved inkubasjon i 3,3-diaminobenzidin (DAB) substrat i 5 minutter. Deretter ble seksjonene kontra med hematoksylin, de-hydrert, og cover-sklei. Primære antistoffer ble utelatt i negative kontroller.
En semikvantitativ tilnærmingen ble anvendt for å evaluere immunoreaktiviteten tar hensyn til antallet positive celler og farging fordeling av fargingen i subcellulære rom (cytosolisk og /eller membran). For hver prøve ble hele stykke mikro vev undersøkt gjennom lysmikroskopi ved 20x forstørrelse. Prosentandelen av kreftceller, identifisert av immunreaktiviteten for hver markør, ble beregnet for alle prøver i TMA. Representative områder (5 synsfelt) som inneholder den høyeste andelen av kreftceller ble brukt for å telle kreftceller per seksjon. Fraksjonen (prosentandel av immunreaktive tumorceller, i tre eksemplarer prøver) uttrykt som antall positive celler for Fields (PCFs), ble deretter beregnet.
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble utført i henhold til prinsippene i Helsinkideklarasjonen og godkjent av Institutional Review Board of «Fatebenefratelli» Hospital i Benevento og Legnago Hospital, Verona, Italia. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke til uttak av prøver og påfølgende analyse
Statistisk analyse:. Gen Signatur Finder algoritme (gSFA)
Vårt genet utvelgelsesprosessen benytter en effektiv wrapper metoden [8] basert på uten tilsyn gruppering, med en forstyrrelse ordningen genererer flere gen-sett med forskjellige startbetingelser for å starte genet utvalg. Startbetingelsene tilsvarer frø gener som viser noen egenskaper som å være en god innledende hypotese. Den resulterende algoritmen er definert
geneSignatureFinder plakater (gSFA) implementert i en R-pakken og tilgjengelig på CRAN (https://cran.r-project.org/web/packages/geneSignatureFinder/index.html) i et åpen kildekode for nedlasting. gSFA, som er en generalisering av den modifiserte maksimale konvergensforeslått av Boutros et al. [6], består av fire hovedtrinn (figur 1):
genet Signatur Finder algoritme
består av 4 separate trinn: (1) finne kandidat frø gener; (2) å generere en signatur som starter fra hvert frø gen; (3) beskjære signaturer av statistisk inferens; (4) integrere signaturer av genet ranking
Trinn 1:.
Frø Finder
første trinn i algoritmen vår er rettet mot å velge et sett av gener som kan være en pålitelig start frø for å utvide signaturen. Vi brukte et sett av gener i henhold til to hovedbetingelser: (a) en bimodal fordeling av uttrykket nivåer, (b) evnen til å skille datasettet i to grupper på basis av overlevelsesanalyse test. Spesielt for hvert gen
i
anser sekvensen g
i
= {
x
ij
,
jeg
= 1 …,
M
}, der
x
ij
er uttrykket nivået av genet
i
i prøven
j
. Bayesiansk Information Criterion (BIC) [12] blir så brukt til å kontrollere bimodalitet hypotese for sekvensen g
i
. Sekvensen g
i
er gruppert i to undergrupper S
1 og S
2 ved hjelp av en
k
-median algoritme (
k
= 2) og avstanden mellom overlevelseskurver for prøvene i S
1 og S
2 blir så beregnet. Seed gener er de manifestere bimodalitet og avstanden mellom kurvene under en valgt betydning terskel (i alle våre eksperimenter 0.05)
Trinn 2:.
Signatur forplantning Book Gitt et sett med
K
frø gener valgt som det forrige trinnet, utvidet vi aa liten gen signatur fra hvert frø genet. En grådig strategi er adoptert ved å velge som neste signatur gen genet maksimere økningen av avstanden mellom overlevelseskurver for de to sett S
1 og S
2 oppnås ved clustering den to-dimensjonale datasett (innehold av frø-genet og den neste kandidat signatur-genet). Algoritmen fortsetter å legge gener til hver signatur på denne måten til ingen ytterligere forbedring av avstanden mellom overlevelseskurver oppnås
Trinn 3:.
Signatur analyse og beskjæring
En
betydningen indeks
blir beregnet for hvert gen av de
K
signaturene, er det et mål på hvor mye en enkelt gen bidrar til å øke avstanden mellom overlevelseskurver i forhold til avstanden basert på alle gener i en signatur. Det er definert som en minus forholdet mellom avstandene mellom overlevelseskurver som oppnås når det valgte genet fjernes fra signaturen (detaljer i de vedlagte fil Tilsetnings gSFA prosedyre). Så hver signatur er beskjæres av gener som ikke vesentlig bidrar til utskillelse av dikotomien generert av signaturen
Trinn 4:.
Gene Ranking
Fra ensemble av genet i
K
signaturer, kan vi få ulike score for å velge kandidat gener som er potensielt knyttet til prognostiske grupper. Vi scorer genene på grunnlag av antall underskrifter som de oppstår og deres gjennomsnittlige betydning indeksen
De vedlagte Materialer og amp.; Metoder S1 (Supplementary gSFA prosedyre) inneholder alle detaljer om algoritmen og kommandoene for å gjenskape hele analysen med R bruker gSFA pakken.
Resultater
genet Signatur Finder algoritme (gSFA) avslører mange signaturer i forbindelse med celle adhesjon og ekstracellulære matrise organisasjon
Vi søkte den gSFA til et datasett av to hundre og trettito CRC prøver og identifisert 16 frø-gener som viser en signifikant (
p
0,05 etter korreksjon) univariate separasjon av overlevelseskurver mellom god og dårlig prognose-grupper, og er bi-modale på samme tid (ca. 1/3 av probene viser bimodalitet). Fra hver av frø-genene vi fått underskriftene som er oppført i tabell 1; de tilsvarende overlevelseskurver er illustrert i figur S1. I de fleste tilfeller er
p
-verdi ikke Computable gitt at
t
-verdi er utenfor maskinens presisjon. Selv om de valgte genet undergrupper kan være forskjellig, overlevelseskurver ofte ligne (figur S1), så vi bedt om differansen mellom separasjons indusert av hver signatur. Vi beregnet at avstanden mellom clustering oppnådd ved hver av de 16 signaturer og få den dendrogram rapportert i figur 2a: vi observere at forskjellig gen signatur kan eventuelt generere lignende dikotomier. Dette dendrogram gjør det mulig å oppnå en robust klassifikasjon av prøvene i to grupper i henhold til det antall ganger en gitt prøve faller i en av gruppene. Spesielt
stabilt god prognose gruppe
består prøvene at det i minst 80% av dikotomier faller i god prognose gruppen, analogt for
stabilt dårlig prognose gruppe
. Således ble 133 og 56 prøvene klassifisert i stabil god eller dårlig prognose gruppe, respektivt, mens 43 forble upålitelig klassifisert og definert usikre prøver. De tilsvarende overlevelseskurver er rapportert i figur 2b, gir log-rank test mellom de tre kurvene en
p
-verdi 10
-16. 1609 differensielt uttrykte gener (endring 1,5 og korrigert
p
-verdi 0,05) mellom de to stabile prognostiske grupper generert clustering heatmap av figur 2c. Prøvene ble delt i to hoved klynger: den første består 113 ut av 133 (85%) av stabilt klassifisert som god prognose gruppe; den andre 55 av 56 (98%) av den dårlig prognose gruppe. De tilsvarende overlevelseskurver er rapportert i figur 2d, gir log-rank test mellom de to kurvene
p
= 6,6 · 10
-6. Silhuetten av klyngen separasjon er også rapportert i den medfølgende filen Supplerende gSFA prosedyre.
Seed Gene
t
-verdi Innlogging (
p
-verdi)
Signatur
PCSK5 (205560_at) 76,572 -16PCSK5, AKAP12, NPR3, AGPAT5, GMFB, C6orf141, 1569202_x_at, KCNH8FST (226847_at) 75,757 -16FST, AKAP12, ULBP2, SLC25A43, EI24, 1563467_at, CLDN8POSTN ( 214981_at) 74,023 -16POSTN, AKAP12, AGPAT5, ATL3, SLC44A2SUSD5 (214954_at) 71,842 -16AKAP12, 241867_at, ADAMTS5, APLP2, PITPNC1, 1556983_a_atKIAA1462 (231841_s_at) 67.624-15.654KIAA1462, DCBLD2, ADIPOQ, FAM217B, C17orf48DCBLD2 (230175_s_at ) 66.71-15.477DCBLD2, AKAP12, GUSBP11, CDR2L, MGC16703, METTL4NPR3 (219054_at) 66.457-15.477NPR3, DZIP1, 243820_at, 238109_at, 236795_at, DNAJC4, FOXA1, EMID2AKAP12 (227530_at) 65.522-15.256AKAP12, ISM1, C11orf9, 244026_at, ARHGAP9, NOL3, AP2A1PAPPA (201981_at) 65.024-15.109PAPPA, NT5E, DUSP7, 230711_at, CD96, ABI2ETV1 (221911_at) 61.631-14.386ETV1, LONRF3, NGEF, RAB2A, U2AF2, CPOKIAA1462 (213316_at) 60.733-14.184KIAA1462, AKAP12, UGGT2 , 231989_s_atSRGAP2P1 (1568955_at) 58.417-13.674SRGAP2P1, AKAP12, SNX16, NT5ELOC100132891 (228438_at) 58.037-13.589LOC100132891, DCBLD2, ADIPOQ, SLFN5DCBLD2 (224911_s_at) 50.106-11.837DCBLD2, ADCY7, EHD2CTGF (209101_at) 46.099-10.949CTGF, FERMT1, AKAP12 , CDK1EFHA2 (238458_at) 42.166-10.076EFHA2, ST18, ACACBTable 1. Signaturer utviklet fra 16 frø-gener.
CSV ned CSV
a. Dendrogram av dikotomier som genereres av hver av de 16 gSFA signaturer (Tabell 1 og figur S1); b. Survival tomt på de 133 prøvene stabilt klassifisert i god prognose gruppen, 56 prøver i dårlig prognose gruppen og 43 usikre prøver (log-rank test gir
p
10
– 16); c. heatmap av degs mellom de to stabile grupper, indikerer Red overuttrykte gener (uttrykk nivåer over median) og grønn indikerer underexpressed gener (uttrykk nivåer under median); d. overlevelseskurver prøver i de to klynger av heatmap som i c. (
p
= 6,6 · 10
-6).
For å belyse biologiske prosesser og funksjoner knyttet til disse to klyngene, vi identifiserte 1394 forskjellig uttrykt probesets tilsvarer 1024 forskjellige gener (degs), 87% av som finnes i listen over degs mellom stabile prognostiske grupper. Den degs liste beriket flere Gene ontologi (GO) kategorier. Vår gSFA prosedyre valgt, som er relatert til dårlig prognose gruppe, et sett av prøver med mesenchymale funksjoner assosiert med gener som er involvert i proliferasjon og celleadhesjon. Spesielt GÅ analyse av gener oppregulert i den fattige gruppen viste at
celle adhesjon
ble beriket med 123 degs (
p
10
-28),
ekstracellulære matrise Organisasjon
med 34 gener (
p
10
-15),
Response to såret
med 95 degs (
p
10
-22),
immun~~POS=TRUNC respons~~POS=HEADCOMP
med 91 gener (
p
10
-14). Videre disse degs beriket KEGG Pathways
ECM-reseptor interaksjon product: (
p
10
-10) og
Focal vedheft product: (
p
10
-8). Når lastet på oppfinnsomhet Pathway Analysis, vår liste over degs produsert et sett av anrikede kategorier som
p
-verdi er rapportert i figur S2A. Spesielt ble andre kategorier knyttet til vev utvikling og kreft betydelig beriket; spesielt de som er knyttet til tykktarmskreft ble beriket på
p
10
-14.
For å forstå de viktigste regulatorer involvert i separasjon i de to prognostiske grupper, en berikelse analyse av oppstrøms regulatorer ble utført. Interessant, transformerende vekstfaktor beta 1 (TGFβ1) var oppregulert i dårlig prognose klynge [13]. Videre kan nettverket av de 20 regulatorer som er vist i fig S2B forklare virkemåten av 177 av de utvalgte gener. De øverste regulatorer av nettverket omfatter også andre oppløselige vekstfaktorer, for eksempel medlemmer av fibroblast vekstfaktor (FGF) og tumornekrosefaktor (TNF) familien. De utvalgte gener som er involvert hovedsakelig i TGFβ1 signalering, som 109 molekyler (
p
10
-51) er dens kommenterte mål i IPA kunnskapsbase. Reseptor-mediert signalisering som reaksjon på disse ligandene utløser aktivering av intracellulære effektor molekyler, slik som de små GTPase familie RAS, medlemmer av Src-tyrosin-kinase familien eller transkripsjonsfaktorer, inkludert, SMAD, RUNX2, STAT3, NFKB, p53 og β- catenin. Disse effektbokser har en sentral rolle i CRC progresjon og metastatisk invasjon fremme dannelsen av en tumor-assosiert mikromiljøet.
TMA validering av biomarkører identifisert av ensemblet signaturer
For å identifisere robuste biomarkører knyttet til CRC prognose som kan valideres i våre to biblioteker av vev, brukte vi rangeringen rapportert i tredje trinn av gSFA og de resulterende genene er vist i tabell S1, der
AKAP12, DCBLD2, NT5E
var den vanligste gener valgt av algoritmen i de forskjellige signaturer. Vi har også validert SPON1 som, uventet, det var blant de mest differensielt uttrykte gener av de to grupper; men har sin rolle i CRC ikke blitt behandlet ennå. Vi screenet ved immunhistokjemi (IHC) den TMA av denne serien av 140 CRC og et undersett av 60 normale passet colonic prøver for å bestemme den prognostiske potensialet i de utvalgte gener. Markører «uttrykk mønster ble registrert som andel positive celler: en positiv farging over 25% av tumorceller ble definert høy uttrykk. Figur 3a rapporterer representative vev lysbilder i TMA merket med antistoffer mot AKAP12, DCBLD2, NTE5 og SPON1. Figur 3b rapporterer samlede prosenter av gjenkjenning mellom tumor og normale prøver. I figur S3 ytterligere farging av DCBLD2 og NT5E med høyere oppløsning er illustrert.
a. «Kolonner fra venstre til høyre» tilsier farging mønster i normale colonic prøver og CRC kjerner negative og positive for hver markør AKAP12, DCBLD2, NT5E, SPON1. Svarte piler indikerer immunhistokjemisk fargingsmønsteret i normale eller maligne colonic celler. Hvite piler viser immunofarging fordelingen i stromal rommet (endotelceller, regulatoriske T-celler og makrofager) er karakteristisk for NT5E uttrykksmønster. Forstørrelse 10X; b. Antall positive tilfeller oppdages på TMA validering serie bestående av vevsprøver (TUM) og en undergruppe av matchet normal tarmslimhinnen (NM). Feilfelt angir standardavvik fra gjennomsnittet (
p
0,05); c. Fire representative frosne CRC-prøver (T) og tilpasset normal slimhinne (N) ble identifisert i den samme kohort av pasienter og analysert ved immunblot. Molekylvektmarkører er indikert i kilodalton. β-tubulin ble brukt som lasting kontroll for å normalisere bandet intensiteter.
I normal colonic slimhinnen, var alltid positiv, lokalisert til cytosol og hovedsakelig i den apikale krypten rommet dvs. i mer differensiert AKAP12 farging celler. I CRC prøvene ble AKAP12 immunoreaktivitets beholdt i 55% og fraværende i ca 45% av tilfellene.
DCBLD2 var alltid positiv i normale colonic celler og jevnt lokalisert på BASO-lateral plasmamembraner. I CRC prøvene ble farging påvist hos ca. 52% av tilfellene. I noen tumorsnitt ble DCBLD2 immunopositivity også lokalisert til den cytosoliske rommet.
NT5E immunopositivity ble hovedsakelig funnet i stromale celler (endotelceller eller regulatoriske T-celler) i normal tykktarmsslimhinne, mens den var svakt positiv eller negativ i epiteliale colonic celler. I tråd med dette funnet, NT5E immunopositivity markerte tumorassosiert stroma og var fraværende i ondartede celler i omtrent 40% av tumorprøver. Interessant, i de resterende 60%, NT5E farging merket også ondartede epitelceller, i tillegg til de stromale seg.
SPON1 immunreaktivitet var positiv bare i omtrent 20% av de normale colonic prøver. Bemerkelsesverdig, SPON1 ble påvist hos ca. 70% av CRC prøver, med en membran eller cytosoliske lokalisering. Positivitet i svulster var signifikant korrelert med kollagen IV og vimentin uttrykk, noe som tyder på en rolle SPON1 i omorganiseringen og ombygging av svulst ekstra matriks (ECM) (data ikke vist).
Western Blot Analyse på primær CRC
for å underbygge den IHC uttrykk profil og å ha mer kvantitative data, tjue tilfeldig valgte CRC prøver og matchet normale mucosas fra samme kohort av pasienter ble analysert ved western blot, med de samme antistoffene ansatt i IHC. Denne analysen også bekreftet spesifisiteten til antistoffene. De erholdte bånd ble kvantifisert ved densitometri etter normalisering til p-tubulin for protein lasting. AKAP12 og DCBLD2 ofte ble oppdaget på lavere nivåer i tumor (T) enn vanlige matchet vev (N). I motsetning til dette, NT5E og SPON1 uttrykk viste signifikant høyere nivåer i tumorer enn kontrollene. Figur 3c rapporterer bånd tilsvarende fire representative prøver, kvantiseringen av disse er rapportert i figur S4a. Selv om dataene gjaldt bare 20 tilfeller, de bekreftet spesifisiteten av resultatene og forsterket forskjellene mellom normale og tumorprøver påvist ved IHC på TMA.
Biomarkører Expression Profiler og klinisk-patologiske Parametere
Vi utførte en multippel sammenligningstest evaluere IHC uttrykk frekvensen for hver biomarkør og klinisk-patologiske parametere. Vi fant ingen sammenheng mellom AKAP12 eller SPON1 genuttrykk profil og pasientenes alder, kjønn, tumorstadium, differensiering eller histologi, tilstedeværelse av nodal og levermetastaser. I kontrast, ble tapet av DCBLD2 korrelert med avanserte stadier av sykdommen (
p
= 0,021). Faktisk, 37,4% av prøvene som ble testet for lav DCBLD2 ekspresjon var hyppigere trinn IV-tumorer, sammenlignet med 15% av DCBLD2 høy som uttrykker seg. Følgelig også tilfeller assosiert med fjernmetastaser hadde signifikant lavere nivåer av DCBLD2 uttrykk enn de uten levermetastaser (
p
= 5.71 · 10
-5). Spesielt, svulster også uttrykker høye nivåer av NT5E viste en lignende mottakelighet for metastatiske svulster (
p
= 6.62 · 10
-4). Sammenhengen mellom biomarkører og klinisk-patologisk parametere i vår CRC datasettet er illustrert i tabell S2.
For å utforske hvilke av utvalgte gener var også en uavhengig prediktor for pasient overlevelse i vår CRC validering serien, klassifisert vi svulster som lav eller høy uttrykker hver av biomarkører under etterforskning. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at tap av AKAP12 ble marginalt assosiert med dårlig total overlevelse (OS) (
p
= 0,0758, figur 4a). Bemerkelsesverdig, lav membranassosiert uttrykk for DCBLD2 og overekspresjon av NT5E i tumorceller var sterkt assosiert med kortere overlevelse (
p
= 5,97 · 10
-7and
p
= 1,01 · 10
-5 henholdsvis figur 4c og 4d). Ingen signifikant sammenheng med OS ble funnet å ta hensyn bare NT5E immunopositivity i tumorassosiert-stroma (figur S5). SPON1 over-uttrykk ble ikke korrelert med pasientenes prognose (data ikke vist).
a. Overlevelseskurver på vår CRC validering serien, kategorisert som å ha høy (rød kurve) og lav (grønn kurve) AKAP12, DCBLD2 og NT5E uttrykk.
p
-verdi for nullhypotesen om lik befolkningsoverlevelseskurver er levert av log-rank test i hver graf; b. Overlevelseskurver anslått å kombinere uttrykket (
høy Hotell og
lav
) av alle 3 markører (AKAP12, DLBLC2, NTE5). Rød kurve representerer kombinasjonen
høy /høy
; den blå kurven representerer kombinasjonen
høy /lav
; den sorte kurven representerer kombinasjonen
lav /høy
; den grønne kurven representerer kombinasjonen
lav /lav
.
Til slutt, evaluert vi om alle tre prediktive markører (AKAP12, DCBLD2, NT5E) kunne utøve gjensidige effekter og forbedre prognostisk nøyaktighet. Sakene ble klassifisert i 4 grupper etter deres uttrykk nivåer (figur 4d, 4e, 4f). Spesielt, 100% av pasientene som viser kombinasjonen DCBLD2
høy /NT5E
lav var i live 5 år etter diagnose. I motsetning var bare 30% av pasientene med tumorer som uttrykker kombinasjonen DCBLD2
lav /NT5E
høy live. Dette overlevelse forskjellen var uavhengig av adjuvant kjemoterapi eller stadium av sykdommen.
Uttrykk av utvalgte biomarkører i CRC cellelinjer
For å få ytterligere innsikt i kandidatgener, vi vurderte sin protein uttrykk profil i seks representative menneskelige CRC avledet cellelinjer (figur S3b). AKAP12 protein ble påvist bare i HCT116 og DLD1 celler i henhold til tidligere studier [14]. DCBLD2 ble uttrykt ved svært lave nivåer i de fleste cellelinjer, mens NT5E ble sterkt uttrykt i HT29 og HCT116 i forhold til de andre cellelinjer. Til slutt ble SPON1 påvist i de fleste cellelinjer, med de høyeste nivåene i DLD1.
Cross-talk mellom TNF-α og PPARy signale regulerer NT5E og DCBLD2
i vivo
resultater antydet at NT5E og DCBLD2 er involvert i tumorinvasjon og metastase sannsynlig gjennom en tumor-indusert immunundertrykkende mekanisme. Derfor fokuserte vi vår oppmerksomhet på TNF-α, et cytokin som regulerer et signaleringsnett implisert i betennelsessykdommer og tumorigenesis [15]. Oppfinnsomhet Pathway Analysis ble forespurt å markere effektene av TNF-α og samspill cytokiner. NFkB dukket opp som den viktigste knutepunkt i nettverket av oppstrøms regulering av de utvalgte degs og i sin tur, som en viktig modulator av gener involvert i inflammatoriske og immunrespons (figur S6a) [16]. Basert på disse observasjonene, vi søkte på cis-virkende regulatoriske DNA-elementer i
NT5E Hotell og
DCBLD2
arrangører (Figur S6b) og identifisert flere antatte NFkB språk lignende elementer. For å kontrollere om
NT5E
, og muligens
DCBLD2
, kan bli regulert av inflammatorisk kaskade, vi behandlet HEK 293T celler med LPS, en kraftig pro-inflammatorisk NFkB inducer, og fått en betydelig tid -avhengig induksjon av
NT5E
; på samme måte, ektopisk ekspresjon av p65 /Rela NFkB-subenheten forårsaket en signifikant induksjon ytterligere forbedret med LPS behandling. I kontrast, transfeksjon av super suppressor IκBα S32 /36 fullt avskaffet LPS stimulerende effekt på
NT5E
(Tall S6c og S6d). b. av tre uavhengige eksperimenter. b. en. b. c. Metoder S1.
