Abstract
Bakgrunn
Kreftceller
in vivo
møte ulike typer microenvironments både stedet av primærtumor og på områder av fjernmetastaser. Forstå hvordan de ulike mekaniske egenskapene til disse microenvironments påvirke biologien til kreftceller i løpet av sykdomsutvikling er avgjørende for å identifisere molekylære mål for kreftbehandling.
metodikk /hovedfunnene
Denne studien bruker fleksible polyakrylamidgeler som substrater for cellevekst i forbindelse med en ny proteomikk tilnærming for å identifisere egenskaper med hensyn til stivhet avhengige kreftcellelinjer som bidrar til deres differensial vekst på myke og stive substrater. Sammenlignet med celler som vokser på mer stive /stive substrater ( 10 000 Pa), celler på myke underlag (150-300 Pa) oppviste en lengre cellesyklus, på grunn av hovedsakelig til en forlengelse av G1-fasen av cellesyklusen, og ble metabolsk mindre aktiv, redusert som viser nivåene av intracellulær ATP og en markert reduksjon i proteinsyntesen. Ved hjelp av stabil isotop merking av aminosyrer i kultur (SILAC) og massespektroskopi, målte vi satsene for proteinsyntese på over 1200 cellulære proteiner under vekstbetingelser i myke og harde /stive substrater. Vi identifiserte cellulære proteiner som synteser ble enten fortrinnsvis hemmet eller konservert på myke matriser. Den tidligere kategorien skal inkluderes proteiner som regulerer cytoskeletal strukturer (f.eks tubulins) og glykolyse (f.eks phosphofructokinase-1), mens sistnevnte kategori inkludert proteiner som regulerer viktige metabolske veier som kreves for å overleve, for eksempel, nikotinamid phosphoribosyltransferase, en regulator av NAD berging sti.
Konklusjon /Betydning
de cellulære egenskapene til stivhet avhengige kreftceller vokser på myke matriser minner om egenskapene til sovende kreftceller, for eksempel, langsom vekst og redusert metabolisme. Vi foreslår at bruk av relativt myk gele som cellekultur underlag ville tillate molekylære stier å bli studert under forhold som gjenspeiler de ulike mekaniske miljøer som oppdages av kreftceller ved metastaser til fjerne områder
Citation. Tilghman RW, Blais EM, Cowan CR, Sherman NE, Grigera PR, Jeffery ED, et al. (2012) Matrix Stivhet Regulerer kreft celle vekst ved å modulere cellenes stoffskifte og proteinsyntese. PLoS ONE 7 (5): e37231. doi: 10,1371 /journal.pone.0037231
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 14 februar 2012; Godkjent: 16 april 2012; Publisert: May 18, 2012 |
Copyright: © 2012 Tilghman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd National Institutes of Health (NIH) -National Cancer Institute (NCI) CA40042 (JTP) og NIH 1U54 GM64346 (JTP og JWF) (www.nih.gov) og finansiering fra Coulter Foundation translasjonell Partners Award (www. whcf.org) (JTP). EMB ble støttet av NIH-NCI T32 CA09109. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Føle de mekaniske egenskapene til den ekstracellulære matriks (ECM) er en sentral mekanisme for regulering av differensieringen og formeringen av en rekke celletyper både
in vitro
og
in vivo
. Rikelig med bevis impliserer endringer i signalveier som regulerer responsen av celler til microenvironmental signaler som kritiske hendelser i startfasen, progresjon, metastaser og kanskje svulst dormancy [1], [2]. I tillegg, er økningen i vev stivhet på grunn av lokal akkumulering av en tett, tverrbundet kollagen matriks et kjennetegn på kreft progresjon i mykt vev, og er basis for påvisning av mange typer av tumorer ved fysisk palpasjon [3], [4].
Analyse av humane kreftcellelinjer i cellekultur er nesten alltid utført ved anvendelse av celler dyrket på stiv plast, eller, mindre ofte, i Matrigel eller myk agar, de mekaniske egenskaper av disse er dårlig definert og /eller vanskelige å modulere. Vi har tidligere beskrevet en enkel high-throughput metode for dyrking av kreftceller på biologisk relevante fleksible underlag ved hjelp ECM konjugert polyakrylamid (PA) geleer som kan strekke seg over en stivhet utvalg omfatter elastisitetsmoduler på 100 pascal ([Pa] eller N /m2) -150000 Pa [5]. I denne analysen benytter vi en 96-brønn assay-system som matriser PA geler av varierende stivhet i brukerdefinerte intervaller på tvers av platen [6]. Vi har brukt denne analyse for å vurdere hvordan endringer i stivheten av ECM modulere de biologiske egenskapene til tumorceller, inkludert vekst, morfologi, og trekkende egenskaper. De kreftcellelinjer som ble testet ble gruppert i to kategorier basert på deres sprednings profiler: «stivhet avhengige» linjer utstilt øke cellevekst som ekstracellulære stivhet økt, mens «stivhet uavhengig» linjer vokste like godt over hele testet spekteret av matrise stivhet. Viktigere, celler som vokste dårlig på myke geler oppviste redusert spredning og migrering under disse betingelser og vokste dårlig når det innføres i det myke vevet omgivelsen i lungen. Stivheten avhengige lungekarsinom linje A549 svarte til kulturen på myke geler ved å uttrykke den differensierte epiteliale markør E-cadherin og redusere ekspresjonen av mesenchymale transkripsjonsfaktor Slug. Tilsvarende har stivhet også blitt funnet å modulere epiteliale-til-mesenchymal overgang i normale epitelceller [7]. Disse observasjonene demonstrerer at de mekaniske egenskapene til matriksen miljø spiller en betydelig rolle i regulering av proliferasjon og de morfologiske egenskaper til kreftceller, og at den «stivhet profil» er en iboende egenskap av hver kreftcellelinje.
mange kreftcellelinjer svare på mindre stive microenvironments av prolifererende mer langsomt; Imidlertid, endringer i cellulær metabolisme som skyldes endringer i stivheten i mikromiljøet er ikke blitt godt karakterisert. Celleforandringer i metabolske prosesser som proteinsyntese kan være særlig relevant som kreftceller inngå en «sovende» tilstand, hovedsakelig i områder av fjernmetastaser der cellene har blitt introdusert til en utenlandsk mikro [8], [9]. I denne studien undersøkte vi egenskapene til stivhet avhengige kreftcellelinjer som bidrar til deres differensial vekst på myke og stive polyakrylamid substrater. Sammenlignet med celler som vokser på mer stive /stive substrater, celler på myke underlag (150-300 Pa) oppviste en lengre cellesyklus, på grunn av hovedsakelig til en forlengelse av G1-fasen av cellesyklusen, og ble metabolsk mindre aktive, som viser redusert nivå av intracellulær ATP og en markert reduksjon i proteinsyntesen. For å identifisere proteinene som oppviser differensial-syntesehastighetene når cellene er dyrket på myk versus stive geler, vi brukte en nylig utviklet anvendelse av stabile isotop merking av aminosyrer i kultur (SILAC) og massespektrometri for å måle forekomst av proteinsyntese i løpet 1200 cellulære proteiner under betingelser for vekst på myke og harde /stive substrater [10]. Mens samlede tallene for proteinsyntesen reduseres markant i stivhet avhengige celler dyrket på myke underlag, identifiserte vi cellulære proteiner som synteser ble fortrinnsvis hemmet ved dyrking på myke underlag og proteiner som synteser ble relativt bevart når det vokser på myke matriser. Førstnevnte kategori inkluderes proteiner som regulerer cytoskeletal strukturer (f.eks tubulin subenheter) og glykolyse (f.eks, fosfofruktokinase P-1 og ATP syntase), mens den sistnevnte kategori er inkludert proteiner som regulerer viktige metabolske baner som er nødvendige for å motvirke skade som følge av reaktive oksygenforbindelser, slik som aldo-keto reduktase familiemedlemmer og nikotinamid phosphoribosyltransferase, en regulator av NAD berging veien. Den cellulære egenskapene til stivhet avhengige kreftceller vokser på myke matriser minner om egenskapene til sovende kreftceller, dvs. langsom vekst og redusert metabolisme. Disse data understøtter ideen om at stivheten av mikromiljøet kan modulere tumorcelleformering ved modulering av fundamentale celleprosesser. Videre kan den myke plate teknologi gir en unik plattform for studiet av kreftceller som gjennomgår dynamisk regulering av proliferasjon i respons til endringer i den mekaniske miljø, og dermed gi innsikt i hvordan microenvironmental endringer modulere kreftcellevekst i eksperimentelle dyremodeller og hos pasienter.
Resultater
cellecyklusprogresjonen av stivhet avhengige celler på myk gele
Vi har tidligere vist at et panel av kreftcellelinjer kan bli separert basert på evnen til å spre på myke ( 1000 Pa) kollagen-belagt geler. A549 celler (lungekreft) og MDA-MB-231 celler (brystkreft) er klassifisert som «stivhet avhengig» og utstillingen dobling ganger at er minst to ganger lenger på myk versus stive matriser. I motsetning til de «stivhet uavhengige» mPanc96 celler (bukspyttkjertelkreft) vokser like godt på myk sammenlignet med stive matriser og har lignende dobling ganger under disse forholdene ([5], upubliserte observasjoner).
For å forstå molekylære basis for den langsomme vekst av stivhet avhengige kreftcellelinjer for myke matriser, målte vi viktige regulatorer av cellesyklusutvikling, så vel som den tid som kreves for celler til tversgående cellesyklusen på myke eller stive substrater. Cyclin D1 er kritisk for celler å gå inn i cellesyklus, og tapet av cyclin D1 uttrykk er en markør for celler som er kommet ut av cellesyklusen, og er stillestående [11]. I tillegg har cyklin D1 ekspresjon er vist å være regulert av matrise stivhet ved FAK-avhengig aktivering av Rac i utransformerte celler [12]. Ekspresjonen av cyclin D1 i stivhet avhengige kreftceller ble målt for å bestemme om cellene som går ut av cellesyklusen når de dyrkes på myke geler. Stivhet avhengig A549 eller MDA-MB-231-celler ble dyrket på 150 Pa, 4800 Pa, eller 19200 Pa geler i 2 eller 5 dager, og cyklin D1-ekspresjon ble målt ved hjelp av western blot. Begge cellelinjer likevel uttrykt cyklin D1 til og med når de dyrkes på den myke (150 Pa) gels (figur 1). Disse data indikerer at fasthets-avhengige celler som ikke går ut av cellesyklusen, selv på myke geler hvor cellene oppviser langsommere vekst.
A549 celler og MDA-MB-231-celler ble dyrket på 150 Pa, 4800 Pa, eller 19200 Pa polyakrylamidgeler i 2 eller 5 dager. Celler ble lysert og analysert ved western blot for ekspresjon av Cyclin D1 (øvre panel). Uttrykket av GAPDH ble analysert som en lasting kontroll (nedre panel). Blottet er representative for tre eksperimenter.
Siden stivhet avhengig A549 celler som ikke går ut av cellesyklusen når belagt på myke geler, og bare ~ 5% av cellene som gjennomgår apoptose under disse betingelser [5 ], hypotese vi at disse cellene er framdrift gjennom cellesyklusen mer langsomt enn når de vokser på stive substrater. For å undersøke graden av progresjon gjennom særskilte faser av cellesyklusen, ble stivheten avhengige lungekarsinom linje A549 dyrket på myke (150 Pa) eller stive (19200 Pa) gels for to eller fem dager, og deretter pulset i 30 minutter med den nukleotid analog bromdeoksyuridin (BrdU) for å merke populasjon av celler som gjennomgår DNA-syntese. Tid brukt i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved FACS for å spore den BrdU-positive populasjon som cellene kommet gjennom S- og G2 fasene og samlet opp i G1 fase [13]. Som vist i figur 2, cellene på myke geler kommet mer langsomt gjennom G1-fasen av cellesyklus sammenlignet med de samme celler som vokser på stive matriser (figur 2), i samsvar med en global reduksjon i cellulær metabolisme eller anabole prosesser som påvirker den cellulære «vekst» fasen av cellesyklusen. På grunn av at cellesyklus profilene er lik etter 2 og 5 dager på myke geler, er det sannsynlig at dette representerer et steady-state måling, i motsetning til muligheten for at celleveksten gradvis avtar ned over tid. På grunnlag av den beregnede lengde av cellesyklus for celler som vokser på myk versus stive geler etter 5 dager forholdet mellom celler med myke versus stive matriser ville være 1:4.3. Det samme forholdet av vekst på myk versus stive geler (1:4.3) ble observert ved manuelt å telle antallet celler tilstede i fem dager, for derved å validere BrdU puls-chase-beregninger.
A549-celler ble pulset med BrdU i 30 minutter etter vekst på myke eller stive geler i 2 dager. A. merking celler med BrdU i cellesyklus analyse. Celler blir pulset med BrdU i 30 minutter, og den BrdU-positive populasjon følges over tid som den overganger gjennom fasene av cellesyklusen. B. spredningsplott histogrammer av BrdU-merkede celler på myk (toppanelet) eller stive (nederst panel) geleer, farget for DNA-innhold (X-aksen) og BrdU (Y-aksen). Tidene er oppgitt er de tider, i timer, etter BrdU puls. ble utført C. cellecyklusprogresjonen analyse på punktplott histogrammer fra cellene dyrket på geleer i 2 dager (venstre) eller 5 dager (til høyre).
Cellular metabolisme i stivhet avhengige celler dyrket på myke geler
G1-fasen av cellesyklusen avhengig tungt på cellulære metabolske hendelser og er kritisk for syntesen av strukturelle proteiner og enzymer som bidrar til dannelsen av nye organeller og den generelle veksten av cellen. På grunn av at G1 fasen av cellesyklusen ble forlenget i stivhet avhengige celler dyrket på myke geler, hypotese vi at det kan være metabolske forandringer under betingelser for vekst av myke substrater. Dyrking av den stivhet avhengige A549 eller MDA-MB-231-celler på myke geler i 2 dager resulterte i en omtrent 50% reduksjon i ATP-nivåer sammenlignet med celler som vokser på stive geler (figur 3). Som forlengelse av G1 fasen, de lavere nivåer av cellulære ATP er i samsvar med en reduksjon i cellulær metabolisme når stivhet avhengige celler dyrkes på myke geler.
ATP-nivåer ble målt i A549-celler (venstre) eller MDA-MB-231-celler (høyre) etter dyrking på polyakrylamidgeler i 2 dager. Dataene representerer gjennomsnittet av to eksperimenter utført in triplo ± S.E., celler på myke (300 Pa) eller stive (19200 Pa) gels. Total ATP-nivåer ble normalisert til celle tall. * P. 0,05
Effekt av stivhet på proteinsyntese i cellene dyrket på myk gele
På grunn av den langvarige G1 fase og nedgangen i ATP nivåer i celler dyrket på myk gele , bestemt vi enten matrise stivhet kan regulere netto proteinsyntese i stivhet avhengige celler. For å vurdere forandringene i global proteinsyntese, og for å identifisere proteiner som kan bli differensielt syntetiseres i henhold til myk sammenlignet med stive betingelser, vi brukte en nylig utviklet anvendelse av stabile isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) i forbindelse med massespektrometri [10 ]. Stivhet avhengige A549 celler og stivhet uavhengige mPanc96-celler ble dyrket i media SILAC for to generasjoner på plast-vevskulturskåler til fullt ut å merke proteome med «tunge» aminosyrer (Figur 4A). Cellene ble deretter sådd ut på enten myke eller stive geler og ytterligere dyrket i «tunge» aminosyrer i ytterligere 4 dager. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer ( «puls») i «lette» (medie normalt vev vekstmedium), og cellulære proteiner ble isolert fra hver av prøvene og løst på SDS-PAGE. Proteiner tilstede i myke og stive prøver ble analysert ved å ta ti gel stykker fra hvert protein bane, og å underkaste hver for spalting med trypsin. Netto proteinsyntese i løpet av 24-timers «puls» ble målt ved å bestemme forholdet mellom tunge å lette peptider ved hjelp av massespektrometri for proteiner i de myke og stive prøver. En foreløpig eksperiment med A549 celler dyrket på plast ga tungt å lette forhold (H /L-forhold) av peptider som var lik de av A549 celler dyrket på stive geler (0,6246 ± 0.2326 for plast vs. 0,5482 ± 0.1785 for stive gels). Figur 4B viser boksplott for H /L forhold av proteiner identifisert for A549 og mPanc96 celler på myke og stive gels bruker SILAC. Den gjennomsnittlige tung /lett-forhold på peptider i A549 cellene på myke geler var signifikant høyere (p 0,05) enn i cellene på stive geler, noe som indikerer at netto proteinsyntese var redusert i celler som på myke geler, (dvs. mindre lys amino- syrer ble innlemmet i puls i cellen vokser på myke underlag sammenlignet med stive underlag). I motsetning til tunge /lette forhold av peptider i mPanc96 celler var ikke signifikant forskjellig mellom celler som vokser på myke eller stive geler (p 0,05). (Figur 4B)
A549-celler ble underkastet SILAC analyse for å fastslå forekomst av proteinsyntese på myke eller stive geler. A. Oversikt over SILAC prosedyre. A549-celler ble dyrket på myke eller stive geler i 4 dager i nærvær av «tunge» medier, etterfulgt av en 24-timers inkubering med «lys» medier. Cellene ble lysert, cellulære proteiner ble fordøyd med trypsin, og de resulterende peptider ble analysert ved massespektrometri. B. boksplott for tung for lys (H /L) prosenter av proteiner fra A549 celler (venstre) eller mPanc96 celler (høyre) dyrket på stive (19200 Pa) eller myke (150 Pa) underlag. H /L ratio distribusjoner er signifikant forskjellig mellom stiv og myk for A549 celler, men ikke for mPanc96 celler ved hjelp av to-tailed uparede t-tester. Boksene inneholder data mellom 25 og 75 persentil, og linjen inne i boksen indikerer median. Den stiplede linjen på toppen av diagrammet markerer øvre grense, over som uteliggere ble avkortet.
massespektrometri analyse identifiserte 631 unike proteiner i A549 celler og 729 unike proteiner i mPanc96 cellene (tabell S1 og S2). Relative priser av syntese (H /L ratio) for individuelle proteiner ble deretter sammenlignet mellom celler dyrket i stive og myke forhold for å bestemme proteiner som er forskjellig «uttrykt» eller oversatt. Siden distribusjoner av H /L forhold skilte mellom stive og myke eksperimenter, ble H /L-forhold og antatt variasjon normalisert uavhengig for A549 og mPanc96 prøver (se metoder), og vi identifiserte proteiner med vesentlig forskjellig H /L ratio (p 0,05 ) ved hjelp av t-tester. Figur 5 viser scatterplots av normalisert H /L forhold mellom prøvene vekst på stive og myke underlag. Proteiner som har en betydelig mindre H /L-forhold (konservert syntese) i myk sammenlignet med stive geler er angitt i rødt og proteiner som har en signifikant høyere H /L-forhold (langsommere syntese) i myk enn stive geler er angitt i grønt. Den stiplede linjen viser den forventede H /L ratio under nullhypotesen at proteiner opprettholde samme H /L ratio i forhold til gjennomsnittet.
H /L prosenter av proteiner identifisert i både stive og myke prøvene plottet mot hverandre annet for A549 celler (til venstre) og mPanc96 celler (høyre). H /L-forhold fra figur 4 var quantile normalisert og t-tester ble utført ved hjelp av estimerte variasjon (se metoder) for å identifisere individuelle proteiner med relativt forskjellige syntese priser mellom stive og myke prøver. Proteiner som syntetiseres raskere (relativt lavere H /L-forhold og p-verdi 0,05). I myke prøver (i forhold til stive prøver) er vist i rødt, og proteiner som er syntetisert langsommere i myke prøver er vist i grønt
fra proteiner identifisert ved massespektroskopi, vi skilt ut de proteinene som viste signifikant forskjellige H /L-forhold (p 0,05) mellom celler dyrket på stive og myke gels (Tabell S3 for A549 celler, tabell S4 for mPanc96 celler). I A549 celler, flere proteiner med felles biologiske funksjoner gruppert i kategorien tregere syntese på myk gele (tabell 1). Disse inkluderte proteiner involvert i proteinsyntese, for eksempel ribosomale proteiner og forlengelsesfaktorer. Subenheter av mikrotubuli (tubulins) også gruppert i kategorien tregere syntese på myke geler. Interessant, to proteiner med viktige roller i ATP produksjon vises også tregere syntese priser på myk gele: 6-phosphofructokinase type C (PFKP-1) og en underenhet av ATP syntase. Disse dataene antyder at når A549 celler dyrkes i en myk mikromiljø, en undergruppe av proteiner – inkludert de som er involvert i oversettelses og mikrotubulidynamikk – syntetiseres saktere i forhold til den gjennomsnittlige syntesehastighet enn når dyrket på stive geler
Omvendt, proteiner som hadde høyere syntese priser enn hoveddelen av de cellulære proteiner når utsådd på myke geler inkludert medlemmer av aldo-keto-reduktase-familien, som er involvert i beskyttelse mot oksygenradikaler og nikotinamid-fosforibosyltransferase, som er viktig for å opprettholde fysiologiske nivåer av nikotinamid-kofaktorer (dvs. NADPH) som er viktige for disse redoksreaksjoner (tabell 2). I tillegg proteiner med roller i endocytose og vesikkel menneskehandel, spesielt annexins og Rab proteiner, ble også funnet å være bevart i A549 celler dyrket på myke geler. Dataene i denne tabellen viser at når A549-celler dyrkes i en myk mikromiljøet, er syntese av proteiner som er viktige for regulering av reaktive oksygenforbindelser og membran dynamikk bevares.
I likhet med A549 cellene dyrket på myk gele, ble flere ribosomale proteiner også syntetisert saktere i mPanc96 celler som ble dyrket på myke gels (Tabell 3). Men i motsetning til A549 celler, flere proteiner med roller i oversettelse ble også funnet å ha høyere syntese priser i mPanc96-celler når de dyrkes på myke geler (tabell 4). I tillegg, mens A549-cellene viste proteiner involvert i vesikkel trafikk og oksidativt stress-trasé som å ha bevart syntese priser på myke geler, proteiner som er involvert i disse prosessene, som for eksempel coatomer underenheter og superoksid dismutase, henholdsvis, ble syntetisert mer langsomt i mPanc96 celler dyrket på myk gele (Tabell 3), noe som tyder på at disse prosessene kan bli nedregulert når mPanc96 celler vokser i myke microenvironments. Interessant nok flere proteiner som er involvert i regulering av celle-matrise-adhesjon og actin dynamikk, inkludert Rac familiemedlem RhoG, fascin, og invertert formin-2, ble funnet å ha høyere forekomst av syntese når mPanc96 celler dyrkes på myke geler (tabell 4), i tillegg til to proteiner (citrat-syntase og malat dehydrogenase) som har avgjørende roller i sitronsyresyklusen, en viktig metabolsk prosess for produksjon av ATP og aminosyre-forløpere. Disse data antyder at når stivheten-uavhengig cellelinje mPanc96 er dyrket i en myk mikromiljøet, er det en reduksjon i syntesen av proteiner som er involvert i vesikkel trafikk og oksidativt stress-trasé, mens det er en økning i syntesen av proteiner som er involvert i aktin dynamikk og sitronsyresyklusen.
Fordi disse dataene gjenspeiler bare syntesen av proteiner, og de overordnede nivåene av proteinene bestemmes av balansen mellom syntese og nedbrytning, vi søkt å teste om denne endring av proteinsyntese var faktisk påvirker cellulære nivåer av disse proteiner. Lysater fra A549 og mPanc96 celler dyrket på myke eller stive geler ble underkastet Western blot for aktin, et protein som hadde viste ingen signifikante endringer i relativ syntese når de dyrkes på myke geler, og to proteiner som viste høy følsomhet til stivhet, nemlig tubulin og phosphofructokinase-en. Nivåene av proteinene ble normalisert til GAPDH som en lastekontroll, fordi det ikke var en signifikant forskjell i den relative syntesen av GAPDH mellom myke og stive geler (p = 0,55, se tabell S1, linje 275). Som vist i figur 6, ble actin uttrykt på samme nivå når de ble dyrket på myke eller stive geler, mens nivåene av tubulin og PFKP-en var lavere på den myke gelene i A549-celler, noe som antyder at den lavere rate av syntesen av disse proteiner observert i SILAC data reflekteres ved lavere nivåer av disse proteiner i cellene. I motsetning mPanc96 celler viste ingen endringer i tubulin eller PFKP-1-nivå når dyrket på myke geler. Disse data indikerer at, i det minste for proteinene undersøkt (tubulin og PFKP-1), en langsommere hastighet på syntese tilsvarer lavere nivåer av cellulært protein.
A. Nivåene av actin, tubulin, og fosfofruktokinase-1 i A549-celler dyrket på myke (150 Pa) eller stive (19200 Pa) gels ble analysert ved hjelp av western blot. Bottom panelene viser nivåene av GAPDH som en lasting kontroll. B. Nivåene av aktin, tubulin, og PFKP-en i mPanc96 celler dyrket på myke eller stive geler som analyseres ved western blot. Bottom panelene viser nivåene av GAPDH i cellelysater som en lasting kontroll. C. Kvantifisering av vestlige blot resultater i (A) og (B). Nivåene av hvert protein ble normalisert til mengden GAPDH i hver prøve. De nivåer av protein i prøver fremstilt fra stive geler ble satt til 100%, og nivået av protein i den myke prøvene er vist som prosent ekspresjon av disse prøvene. Resultatene viser gjennomsnitt ± S.E. av minst tre forsøk. * P. 0,05 sammenlignet med nivået av aktin uttrykk
Diskusjoner
I denne artikkelen viser vi at stivheten av den ekstracellulære matrise regulerer cellenes stoffskifte og proteinsyntese i kreft celler. Stivheten-avhengige kreftcellelinjer A549 og MDA-MB-231 opprettholde ekspresjon av cyclin D1 når dyrket i serum på polyakrylamidgeler som har mekaniske egenskaper som ligner den av bløtvev slik som lunge og bryst. På tross av cyclin D1 ekspresjon, A549-celler, når de dyrkes på myke geler, viser en forlengelse av G1-fasen av cellesyklusen, noe som tyder på at det kan være feil i syntesen av de strukturelle og enzymatiske komponenter som er nødvendig for overgang til S-fasen . Følgelig stivhet avhengige cellelinjer viser lavere nivåer av mobilnettet ATP nivåer når dyrket på myke geler. I tillegg proteinsyntese i A549 celler er langsommere under disse forhold, med syntesen av spesifikke strukturelle proteiner og glykolytiske enzymer slik som tubulin, fosfofruktokinase, og ATP-syntase spesielt følsomme for reduksjonen i ekstracellulære stivhet. Proteiner som var mindre følsomme overfor endringer i stivheten inkludert enzymer, slik som aldo-keto-reduktase og nikotinamid-fosforibosyltransferase og som er involvert i metabolismen av ROS-produkter.
Matrix stivhet er blitt foreslått å være en mekanisme underliggende vevet tropisme av kreftmetastaser, fordi veksten av carcinoma-cellelinjer på myke eller stive geler korrelerer med deres evne til å vokse i myke eller stive vev [5], [14]. Imidlertid er mekanismen (e) som regulerer veksten av kreftceller i en vev-spesifikk måte er utvilsomt komplisert. Våre observasjoner tyder på at en måte som stivhet avhengige kreftceller kan svare på en mindre enn gunstig vev-matrise miljø, er å redusere deres metabolske tilstand, noe som gir en potensiell mekanisme for den observerte vev tropisme av tumorceller, og kanskje vev-avhengige svulst dvalen.
tumor dvalen er definert som et stadium i kreft progresjon der restsykdom er til stede, men er asymptomatisk [15]. Sovende kreftceller kan ligge uoppdaget på områder fjernt fra den primære svulsten, i påvente påfølgende vekst og klinisk tilbakefall [16]. Nyere studier støtter en modell hvor kreftcellene fra den primære svulsten vil spre tidlig i sykdomsutviklingen, slik at når den primære svulsten oppdages, kan det være sovende kreftceller allerede er bosatt i fjerne områder [17]. Disse cellene er enten midlertidig nonproliferative, eller det er en balanse mellom spredning og celledød, eller immunsystemet er å holde cellenumrene i sjakk. Interessant sistnevnte muligheten har kommet i søkelyset på grunn av studier som viser en mangel på svulst tilbakefall hos kreftpasienter som har gjennomgått immunsuppressiv behandling [18].
Nyere studier har innblandet mikromiljøet som en viktig regulator av tumorceller dvalen og tilbakefall. Nærmere bestemt, kan egenskapene til den ekstracellulære matriks på områder av metastasering spiller en viktig rolle i å bestemme tilstanden av disseminerte tumorceller [9]. Imidlertid er mekanistisk innsikt i hvordan uvirksom oppstår knappe, siden hvilende kreftceller er vanskelig å påvise og studere in vivo, og det er en mangelen av in vitro-modeller for tumorcelle uvirksom. Inntil nylig har slike modeller er begrenset til celler dyrket på chorioallantoic membraner (CAM) eller 3D datamatrise avledet fra Engelbreth-Holm-sverm tumor (EHS matrise, eller Matrigel) [19], [20]. Matrigel er en blanding av laminin, kollagen IV, og nidogen, i tillegg til en rekke proteaser og vekstfaktorer så som TGFfi, FGF, EGF, PDGF, IGF og [21]. Fordi det er generert fra en tumor, blir den spesifikke sammensetning av Matrigel ikke godt definert, og den kan variere fra sats til sats, produsere variasjoner i forsøksresultatene [22]. Mens de mekaniske egenskapene til Matrigel har blitt analysert, er de også er gjenstand for variasjon fordi polymerisasjonen påvirkes av sin sammensetning og andre eksperimentelle faktorer slik som temperaturen [23]. I tillegg, er for tiden den eneste måte å forandre de mekaniske egenskaper av Matrigel for å legge til flere matrikskomponenter som kollagen I [24], som også kan komplisere tolkningen av forsøksresultater.
Nylig har in vitro-modeller for svulst dvalen har utvidet til å omfatte bruk av polyakrylamidgeler som vekstunderlag [25]. I motsetning til Matrigel, er polyakrylamid en stabil, homogen polymer, og dets mekaniske egenskaper er ikke følsom for endringer i temperaturen [26]. Dens stivhet lett avstembar ved å modulere mengden av bis tverrbindingsmiddel uten å påvirke dens evne til å binde ECM-molekyler til overflaten [6]. Polyakrylamid-hydrogeler kan omfatte et spektrum av elastisitetsmoduler som omfatter en rekke humane vev fra fett til skjelettmuskel [27], og en rekke av ECM-molekyler kan konjugeres til sin overflate, inkludert kollagen, fibronectin, og upolymerisert Matrigel. I tillegg ble en high-throughput system nylig utviklet for å muliggjøre filtrering av lavmolekylære inhibitorer med celler dyrket på polyakrylamidgeler som spenner over en utvalg av elastisitetsmoduler [5], [6].
