Abstract
Forholdet mellom peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor γ (
PPARG
) uttrykk og epigenetiske endringene som skjer i tykktarmskreft patogenesen er i stor grad ukjent. Vi undersøkte om
PPARG
er epigenetiske regulert i tykk- og endetarmskreft (CRC) progresjon.
PPARG
uttrykk ble undersøkt i CRC vev og paret normal slimhinne av western blot og immunhistokjemi og knyttet til pasientenes clinicopathological parametere og overlevelse.
PPARG
promoter metylering ble analysert ved metylering spesifikke-PCR og bisulfitt sekvensering.
PPARG
uttrykk og formidler metylering ble likeledes undersøkt også i CRC avledet cellelinjer. Chromatin immunoprecipitation i basale forhold og etter epigenetisk behandlingen ble utført sammen med å banke ned eksperimenter av mulige regulatoriske forhold. Genekspresjon ble overvåket ved immunblotting og funksjonelle analyser av celleproliferasjon og invasivitet. Metylering på et bestemt område av arrangøren er sterkt korrelert med
PPARG
manglende uttrykk i 30% av primær CRC og med pasientenes dårlig prognose. Bemerkelsesverdig er det samme metylering mønster funnet i
PPARG
-negative CRC cellelinjer. Epigenetisk behandling med 5′-aza-2′-deoksycytidin kan tilbakestille denne tilstanden, og i kombinasjon med trichostatin A, dramatisk re-aktiveres gentranskripsjon og reseptor-aktivitet. Transkripsjonell lyddemping er på grunn av rekruttering av MeCP2, HDAC1 og EZH2 at formidle undertrykkende kromatin signaturer som bestemmer en økt celle proliferativ og invasiv potensial, funksjoner som kan eksperimentelt falt. Våre funn gir en roman mekanistisk innsikt i epigenetisk stanse av
PPARG
i CRC som kan være aktuell som en prognostisk markør for tumorprogresjon
Citation. Pancione M, Sabatino L, Fucci A, Carafa V, Nebbioso A, Forte N et al. (2010) epigenetiske stanse av peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor γ er en biomarkør for tykktarmskreft Progresjon og uønskede pasient Outcome. PLoS ONE 5 (12): e14229. doi: 10,1371 /journal.pone.0014229
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 10 juli 2010; Godkjent: 09.11.2010; Publisert: 03.12.2010
Copyright: © 2010 Pancione et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) til VC og L.A .; EU-prosjekt til LA De organer hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
peroksisomproliferatoraktiverende Aktivert reseptor (PPAR) er ligand-avhengig transkripsjonsfaktorer som tilhører atom hormon reseptor super [1]. Tre forskjellige PPAR-isoformer, α, β og γ har blitt isolert hittil, hver med en distinkt mønster av vev uttrykk og evne til å reagere med forskjellige klasser av forbindelser. Nærmere bestemt er det PPARy isoformen implisert i en rekke fysiologiske prosesser [2]: den integrerer styringen av energi, lipid og glukosehomeostase og spiller en sentral rolle i adipogenese, inflammatorisk respons og differensiering av mange epitelceller [3]. Konsekvent, variasjoner i
PPARG
uttrykk eller genmutasjoner har vært forbundet med tumorigenesis [4] – [6]. Imidlertid har motstridende resultater rapportert så langt, å reise spørsmålet om hvorvidt PPARy letter eller undertrykker tumorigenesis [7], [8]. Nylig har vi vist at sporadiske kolorektal kreft (CRC) presenterer reduserte PPARy uttrykk nivåer er betydelig assosiert med pasientenes dårligere prognose; i den samme type av tumorer,
PPARG
har vist seg å være en uavhengig prognostisk faktor [9], [10], som tyder på muligheten for å målrette dette gen med legemidler i klinisk anvendelse [10]. De molekylære mekanismene bak
PPARG
uttrykk regulering i CRC progresjon er fortsatt ukjent [9].
Det blir stadig klarere at i tillegg til genetiske endringer, epigenetiske modifikasjoner bidra til tumorigenesis [11] . Epigenetisk regulering innebærer arvelige endringer som ikke endrer DNA-sekvenser, men gir «ekstra» lag av kontroll for å regulere kromatin organisasjon og genuttrykk [12]. Avvikende DNA metylering ved CpG-rike sekvenser, også kjent som «CpG øyer», som ligger i promotorområdene på ca halvparten av de kjente gener, fører til epigenetisk stanse av genekspresjon [11], [12]. I CRC, har omfattende DNA metylering blitt oppdaget på flere loci, spesielt mot promotorområdene av tumorsuppressorgener (TSG), en karakteristikk av en undergruppe av svulster presentere den såkalte «CpG island methylator fenotype» (CIMP) [13] . Andre epigenetiske hendelser, for eksempel undertrykkende histonmodifikasjonene, samarbeide for å etablere stabile genet demping. En «histon code» har vært foreslått for å tilveiebringe en signatur på bestemte aminosyrerester som korrelerer med aktiv eller trykt genekspresjon [11], [12]. Koblingen mellom DNA-metylering og histonmodifikasjonene ser ut til å være formidlet av metyl CpG DNA-bindende proteiner, et medlem av hvilke MeCP2 spiller en viktig rolle for å etablere denne interaksjonen [14]. DNA metylert regioner, vanligvis anriket på modifiserte histoner, generere et mer tettpakket kromatin hvor tilgangen av spesifikke transkripsjonsfaktorer til deres beslektede bindingsseter blir sterkt svekket [12]. Hvor DNA-metylering og mønsteret av histonmodifikasjonene på promotorområdene av spesifikke gener som er assosiert med kreft initiering og progresjon, spesielt i sporadisk CRC, gjenstår å bli belyst [15]. I denne rapporten har vi analysert ett-hundre og femti-to primære CRC og paret normal slimhinne for å korrelere
PPARG
uttrykk variasjoner formidlet av epigenetiske hendelser med tumorprogresjon og pasientenes overlevelse. Vi utvidet analysen til CRC avledet cellelinjer som et system for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn
PPARG
lyddemping på grunn av epigenetiske variasjoner.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av Institutional Review Board of Fatebenefratelli Hospital i Benevento. Alle pasienter forutsatt skriftlig informert samtykke til uttak av prøver og påfølgende analyse.
tumorprøver
Ett hundre og femti-to pasienter diagnostisert primær sporadisk CRC og kirurgisk behandlet ved Kirurgisk avdeling, Fatebenefratelli Hospital, Benevento, Italia, mellom 1999-2004, ble undersøkt i denne studien. Femtito tilfeller omfatte både flytende nitrogen snap-frosne prøver, hentet rett etter kirurgisk reseksjon og parafinblokker. Hver prøve ble matchet med den tilstøtende tilsynelatende normal slimhinne (ved 20 cm avstand fra tumormassen) fjernes under den samme operasjonen. Ingen av pasientene hadde en familiær historie med intestinal dysfunksjon eller CRC, hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før reseksjon heller hadde tatt ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler på en jevnlig basis. Konvensjonelle postoperative behandlinger ble gitt til alle pasienter, avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen. De klinisk-patologiske trekk ved de undersøkte pasienter er rapportert (tabell 1). Oppfølgingen var tilgjengelig for alle pasienter, med en median postoperativ varighet på 59,5 ± 26,5 måneder. Samlet lengde av overlevelse ble beregnet ut fra den første operasjonen. Pasientene ble prospektivt fulgt inntil død eller deres siste legeundersøkelse.
cellelinjer og 5′-aza-2′-Deoxycytidine og Trichostatin En behandling
Twelve CRC avledet cellelinjer var anvendt i denne studien, og ble oppnådd fra ATCC og dyrket som foreslått. For DNA-demetylering, ble cellene behandlet med 1 eller 5 pM 5′-aza-2′-deoksycytidin (AZA) i 72 t eller 300 nM Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) i 24 hs, alene eller i kombinasjon. Etter behandlingene ble cellene høstet for DNA, RNA eller protein ekstraksjon.
DNA ekstraksjon, bisulfitt behandling, metylering analyse og sekvensering
Genomisk DNA ble isolert fra frosset vev eller fra parafin-innleiret prøvene ved hjelp en standard prosedyre [6], eller vev kit FFPE (56404, Qiagen, Hilden, Tyskland), henholdsvis. Ett pg av hver DNA-prøve ble bisulfitt modifisert i henhold til produsentens protokoll (59104, Qiagen, Hilden, Tyskland). Både universelt unmethylated (59665) og CpGenome universelt denaturert DNA (59655, Qiagen, Hilden, Tyskland) ble brukt i hver reaksjon som unmethylated eller denaturert kontroll, henholdsvis. Letingen etter CpG innhold i
PPARG
arrangøren ble utført ved hjelp av Methprimer programvaren i henhold til CpG island definisjon. PCR primere for metylering spesifikk PCR (MS-PCR) ble utformet ved hjelp av Methyl Primer Express-programvaren v1. Både unmethylated (U) og denaturert (M) bestemte sett med primere ble utformet basert på den positive tråden i bisulfit-konvertert DNA dekker CpG øyer innenfor
PPARG
promoter-regionen. MS-PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av MS-PCR kit (59305, Qiagen, Hilden, Tyskland) etter produsentens anvisninger. PCR-produktene ble fylt på ikke-denaturerende 3% agarosegeler, farget med etidiumbromid, og visualisert under en UV-transilluminator. Primer sekvenser er listet opp (tabell S1). Bisulfitt-sekvensering (BS) ble automatisk utført på PCR-amplifisering produkt oppnådd ved hjelp av et primersett som ikke inneholder CpG steder innenfor deres sekvenser og utformet på bisulfit modifisert DNA (Applied Biosystems, Applera, Foster City, USA).
chip og MeDIP analysen
chip analyser og q-PCR forsterkning (Biorad, Hercules, USA) ble utført som beskrevet [16]. Primerne anvendt er beskrevet (tabell S1). MeDIP Analysen ble utført som anbefalt av leverandør (Diagenode, Liège, Belgia). Antistoffer reist mot: AcH3K9, H3K4me3, HDAC1 og MeCP2 (Abcam, Cambridge, UK), H3K27me3, (Millipore, Billerica, USA), RNA pol II og P-RNA pol II (Covance, Dallas, USA), ZAC og renset IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) ble brukt i chip analyser.
Western blot og immunhistokjemisk analyse
Western blot analyse ble utført på proteinekstrakter fra tumorvev og tilstøtende normal slimhinne tatt under kirurgi og CRC cellelinjer, som tidligere rapportert [6], [9]. Immunhistokjemisk analyse av tumorer og fjerne ikke-neoplastisk mukosa ble utført som beskrevet [9]. De følgende antistoffer ble anvendt: anti-PPARy (E-8), anti-ZAC (H-253), anti-ERK 1/2 (MK1) og anti-p-ERK (E-4) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA); anti-E-cadherin (610 405) (BD Transduction Laboratories, Lexington, USA); anti-MeCP2 (ab55538), anti-HDAC1 (ab19845) (Abcam, Cambridge, UK); anti-EZH2 (4905) (Cell Signaling, Boston, USA); anti-β-aktin (A5441) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).
MTT og apoptose-analyser
Cellene ble sådd ut i triplikat i 24 eller i 96-brønners-plater og MTT-analyse (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ble utført i henhold til produsentens protokoll ved 0, 24, 48, 72 og 96 t etter å ha nådd konfluens, som angitt. De vekstkurver ble satt opp med å ta hensyn til de gjennomsnittlige resultatene oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. Å analysere chemo-følsomhet for PPARy agonister celler ble behandlet med 5 mikrometer troglitazon (TZD). Apoptose-analysen ble utført ved flowcytometrisk analyse (FCA) ved anvendelse av propidiumjodid (PI) farging. I korthet, etter inkubering med TZD, ble cellene høstet og fiksert i 70% iskald etanol /PBS og lagret ved 4 ° C over natten. De suspenderte celler ble så vasket med PBS, inkubert i en PI oppløsning i 15 min. ved 37 ° C og umiddelbart analysert med en FAC scan flowcytometer (Becton Dichinson, San Jose, USA).
Migrasjon og invasjon analyser
For sårhelende analysen ble cellene belagt i 60 mm plater og vokst til samløpet. Etter en 6 hs lang serum sult, ble et sår laget ved hjelp av en mikropipette spissen for å skrape av cellene. Cellemotilitet ble undersøkt etter 24 og 48 hs, følgende celler fra forskjellige mikroskop felt. Til slutt, tilsvarende sårområdet på hvert tidspunkt ble digitalisert og kvantifisert ved hjelp Metamorph Imaging System Software versjon 6.0 for Microsoft Windows. En gjennomsnittlig andel for sårheling ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. For å bestemme invasivitet en transwell analysen ble utført ved hjelp av en 24 godt cellekultur innsats, 8 mikrometer pore (3097, Falcon-Becton Dickinson, USA). Etter hydratisering av Matrigel i det øvre kammeret, celler ble sådd og inkubert. Tjue-fire og åtte og førti hs senere cellene i den øvre overflaten av filteret ble fjernet med en bomullspinne; de under ble fiksert med 4% paraformaldehyde, farget med 0,2% krystallfiolett og telles. Kvantifisering ble oppnådd ved å telle minst 10 lavere kraft felt fra tre uavhengige eksperimenter.
RNA ekstraksjon og semi-kvantitativ revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble isolert fra cellelinjer og vev med Trizol med mindre modifikasjoner (Invitrogen Carlsbad, USA). Revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) ble gjort ved hjelp av Super-script II (Invitrogen, Carlsbad, USA) og PCR forsterkning ved hjelp av spesifikke primere for
PPARG
. RT-PCR-betingelsene og de anvendte primerene er tidligere blitt rapportert [5]. I alle PCR reaksjoner,
GAPDH
fungerte som en intern kontroll for normalisering. De amplifiserte produkter ble kjørt på en 2% agarosegel og farget med etidiumbromid.
plasmider og transfections
PPRE-TK drevet luciferase reporter plasmid, pcDNA3 bærer villtype
PPARG
cDNA og transfeksjonsagensene betingelser er allerede blitt beskrevet [6]. For gene re-aktiveringsanalyser, ble cellene sådd ut i 6-brønns plater, behandlet med AZA og TSA alene eller i kombinasjon, og transient transfektert med reporter plasmid. Etter 12 hs, 1 uM TZD eller kjøretøyet alene ble tilsatt til mediet. Når angitt, GW9662, en selektiv PPARy antagonist, ble brukt.
siRNA
En retroviral vektor PSM2C (klone ID VH2-203345) som bærer en kort hårnål DNA (shRNA, katalognummer RHS1764- 9494331) for målretting PPARy mRNA ble anvendt. HT29-celler ble stabilt transfektert med shRNA-PPARy-vektoren og de positive kloner valgt ved anvendelse av 1 uM puromycin. En vektor som bærer ikke-spesifikke shRNAs eller en tom vektor ble anvendt som kontroller. SiRNA designet for å målrette menneskelig MeCP2 mRNA (Kode: HS-MECP2-7HP SI02664893, Qiagen, Hilden, Tyskland) ble vennlig levert av Prof. Chiariotti. HCT116-celler ble sådd ut i 6-brønns plater og transient transfektert med MeCP2 siRNA eller ikke-spesifikke oligonukleotider i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, USA). Til taushet EZH2, en retroviral vektor PSM2C bærer en EZH2-shRNA (kode: RHS1764-9100483, CN: V2HS-63033) egge shRNAs eller en tom vektor ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, USA). I begge tilfeller ble cellene høstet for western blot analyse 56 hs senere.
Tap av heterozygositet,
BRAF Hotell og
KRAS
mutasjoner og mikro ustabilitet analyse
Tap av heterozygositet (LOH) ble vurdert som tidligere beskrevet, ved hjelp av mikro markører D31259 og D3S3701, som flankerer
PPARG product: [6]. Mikro ustabilitet (MSI) ble utført som rapportert [17].
MLH1
promoter metylering ble også vurdert på noen representative tumorprøver [18].
BRAF Hotell og
KRAS
mutasjoner i kodon 600 i ekson 15 og kodon 12/13 i ekson 2, henholdsvis, ble evaluert av PCR /sekvensering og Real-Time PCR ved bruk av primere tidligere beskrevet [18 ].
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført med SPSS (versjon 15.0) for Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Sammenheng mellom
PPARG
promoter metylering, andre markører og klinisk-patologiske parametere ble vurdert ved hjelp av χ
2 test eller Spearman rank test, som angitt. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å estimere overlevelse; overlevelse forskjeller ble analysert med log-rank test. Data ble rapportert som gjennomsnitt ± SD, og gjennomsnittsverdiene ble sammenlignet med Student t test eller Mann-Whitney test. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant når en
P
≤0.05 ble oppnådd.
Resultater
PPARG
promoter metylering i CRC korrelerer med genekspresjon og er assosiert med pasientenes utfall
for å vurdere rollen som
PPARG
spiller i kolorektal tumorigenesis
in vivo
, analyserte vi 152 primærsporadiske CRC og matchet tilstøtende ikke-neoplastisk slimhinnen for
PPARG
uttrykk (Figur 1, panel A). Om lag 60% av svulstene viste
PPARG
over-uttrykk og 5% av tilfellene viste ikke signifikante forskjeller mellom tumorvev og matchet normal slimhinne. I motsetning til 35% av svulstene viste lavere PPARy nivåer enn normal slimhinne og en signifikant sammenheng med fjernmetastaser og reduserte pasientenes overlevelse, i tråd med våre tidligere data (figur 1, paneler B og C) [9]. Vi har allerede rapportert at redusert
PPARG
uttrykk i sporadisk CRC er ikke forbundet med LOH [6]. Derfor, for å bestemme hvorvidt
PPARG
redusert ekspresjon er korrelert med DNA-metylering, undersøkte vi hele promoter-regionen. Inspeksjon av det humane
PPARG
promotoren viste at kjerneområdet, -474 til 600 i forhold til transkripsjons-startsetet, er spesielt anriket på «CpG øyer» som kan være mål-DNA-metylering (Figur 1 , panel D). En kortere CpG-rikt DNA-tarmkanalen som befinner seg oppstrøms (-793 til -580) er funnet stabilt denaturert i en studie som evaluerer epigenetisk risikofaktor forbundet med tidlig debut av voksen metabolsk syndrom (figur 1, panel D) [19]. For å undersøke hvorvidt disse to regionene er differensielt metylert i primær CRC og sammenkoblet normal slimhinne, utførte vi MS-PCR på fire promotor segmenter (M1-M4 å starte fra flere nedstrøms) (figur 1, panel D). Segmenter M4 (fra-746 til -616) og M1 (-123 til 49) var alltid denaturert eller unmethylated i normale og tumorprøver og var ikke korrelert med
PPARG
uttrykk nivåer (Figur 1, panel E ). M2 (-235 til -151) var variabelt denaturert og, til slutt, M3 (-359 til -260) ble metylert i omtrent 30% av tumorer sammenlignet med 8% av sammenkoblede normale mucosas (n = 80) og korrelert med reduksjon /tap av
PPARG
uttrykk (Figur 1, panel E og tabell 1). En nærmere inspeksjon av M3-segmentet identifisert 9 CpG-områder, metylering status som ble analysert ved bisulfitt-sekvensering (figur 1, panel F). CPG øyene metylering nivået var signifikant høyere i
PPARG
-negativ enn
PPARG
-positive svulster og sammenkoblede normale mucosas (figur 1, panel G). Konsekvent, M3 regionen metylering korrelert med pasientens alder, dyp invasjon, Dukes C og D stadier, mens ingen sammenheng ble påvist med svulst plassering (proksimale eller distale colon) og kjønn (Figur 1, panel H og tabell 1).
PPARG
metylering ble oftere observert i en undergruppe av mikro høy (MSI-H) enn i mikro stabile (MSS) svulster. Videre disse tilfellene var ikke relatert med
KRAS
eller
BRAF
mutasjoner (Figur S1). Til sammen tyder disse resultatene på at
PPARG
promoter metylering, spesielt på M3-regionen, er signifikant korrelert med tumorprogresjon og pasientenes dårlig resultat (Figur 1, panel I).
(A) femti mikrogram av totalt protein ekstrakter fra tumorvev (T) og tilpasset ikke-neoplastiske slimhinne (N) ble analysert ved hjelp av Western blot. I panelet bare noen representative prøver (fra 1 til 8) er vist. Histogrammet rapporterer kvantifisering p-aktin, brukt som intern kontroll. (B) Korrelasjon av
PPARG
uttrykk nivåer i fravær = M0 eller tilstedeværelse = M1 av fjernmetastaser. (C) Kaplan Meier overlevelsesanalyse relatert til
PPARG
uttrykk nivåer.
P
verdi er rapportert i hver graf. (D) Skjematisk struktur av
PPARG
promoter og identifisering av CpG-beriket regioner som omfatter transkripsjon start stedet for det menneskelige genet. MS-PCR-regionene som ble analysert (M1-M4), og posisjonene til de anvendte primerene er vist som rektangler. (E) Representative MS-PCR viser en sammenheng mellom metylering av M3-regionen og redusert
PPARG
ekspresjon i tumorvev sammenlignet med matchet normal slimhinne, C + indikerer denaturert (M) og unmethylated (U) kontroller. (F) Et M3 nukleotidsekvens er blitt rapportert; CPG øyene er uthevet. Kromatogrammene viser hvilke CpG dinucleotide er metylert i noen representative prøver etter BS. Svarte eller hvite sirklene indikerer denaturert eller unmethylated cytosines hhv. (G) metylering nivåer oppdaget av BS i tumor og normal slimhinne prøver. M3 region metyleringen er relatert til tumor fase (Dukes fra A til D) (H) og pasientoverlevelse (I).
P
verdi er rapportert i hver graf.
PPARG
stanse i CRC cellelinjer korrelerer med arrangøren metylering
For å undersøke molekylære mekanismen (e) bak denne sammenhengen, søkte vi å bruke en
in vitro
cellekultur system. Vi screenet en rekke menneskelige CRC cellelinjer (tabell S2) for
PPARG
uttrykk nivåer og korrelert disse med mulige Silencing hendelser. PPARy-ekspresjon ble undersøkt på mRNA og proteinnivå ved hjelp av RT-PCR og western blot analyse, henholdsvis (figur 2, felt A). PPARy mRNA speilet proteinnivåer med et bredt spekter av variasjoner fra det høyeste i HT29 til det laveste i HCT116-celler. Forskjellene detekterte ble tilskrevet transkripsjons variasjoner; en redusert proteinekspresjon ikke er relatert til mRNA-nivåer ble observert bare i Caco-2 celler, sannsynligvis på grunn av post-translasjonell mekanisme (r). Blant disse cellelinjene, valgte vi HT29 og HCT116 for nærmere undersøkelser. Vi oppdaget ikke tap av heterozygositet på
PPARG
locus i begge cellelinjer. På samme måte vi ikke relatere de ulike
PPARG
nivåer observert i HCT116 og HT29 celler med posttranslasjonelle modifikasjoner forårsaket av en aktiv mitogen-aktivert protein kinase (MAPK /ERK) veien (figur S2) [6], [20]. For å undersøke om
PPARG
uttrykk korrelerer med arrangøren metylering i CRC cellelinjer utførte vi MS-PCR (figur 2, panel B). M4 og M1 segmentene var stabilt denaturert eller unmethylated i alle cellelinjer, uavhengig av PPARy uttrykk. M2-segmentet ble metylert i 5 av 8 cellelinjer, inkludert HCT116. Interessant nok var det M3 segmentet metylert bare i HCT116 ut av de åtte CRC-cellelinjer ble analysert (figur 2, felt B). Ved å undersøke ytterligere fire CRC cellelinjer, fant vi at også RKO celler var negative for
PPARG
uttrykk, på grunn av avvikende metylert M3 regionen (tabell S2 og data ikke vist). MeDIP analyser bekreftet disse resultatene:
PPARG
promoter DNA (-368 til -166) var tre ganger mer metylert i HCT116 enn i HT29 celler, noe som indikerer en mer tettpakket kromatinstruktur (figur S2). 90% av CpG områdene inneholdt i M3-segmentet ble metylert i HCT116, mens bare få eller ingen ble metylert i andre cellelinjer som bedømt ved bisulfitt-sekvensering (figur 2, felt C). Disse funnene tyder på at arrangøren metylering kan spille en rolle i å kneble
PPARG
uttrykk i CRC cellelinjer analysert.
(A)
PPARG
mRNA og proteinnivåer oppdages ved RT -PCR ad western blot-analyse i et panel på åtte CRC-cellelinjer.
GAPDH
og β-aktin ble benyttet som kontroller, respektivt. (B) MS-PCR resultater oppnådd på M1-M4 promoter regioner analysert; M, metylert; U, unmethylated; C + indikerer denaturert og unmethylated kontroller. Metylering status for alle CRC-cellelinjer analysert er oppsummert, med HCT116 og HT29 celler avbildet i grått. (C) CpG dinukleotider metylering ble bedømt ved BS. Resultatene av noen representative cellelinjer er rapportert. Denaturert eller unmethylated CpG dinukleotider er avbildet som svarte eller hvite sirklene, henholdsvis. (D) Farmakologisk demetylering indusert
PPARG
ekspresjon i HCT116 mens ingen signifikant forskjell ble funnet i HT29-celler anvendt som kontroll. Celler ble utsatt for en og fem mikrometer AZA i 72 hs, MS-PCR ble utført på M2 og M3 regioner, før og etter behandling, **
P
. 0,01
PPARG
uttrykk er re-aktiveres ved farmakologisk demetylering
For å verifisere om
PPARG
uttrykket kan reaktiveres ved farmakologisk demetylering, behandlet vi HCT116-celler med AZA , en kjent inhibitor av DNA-metylering. RT-PCR-analyse fra HCT116 utsatt for en og 5 uM AZA viste en doseavhengig økning av PPARy mRNA, mens viste ingen signifikante variasjoner i HT29-celler, som forventet (fig 2, panel D). MS-PCR utført på M3-regionen, som er metylert bare i HCT116-celler, viste tap av metylering fulgt behandlingen; M2-regionen, som i basale betingelser metyleres i begge cellelinjer, ble demetylert etter behandling (figur 2, panel D). Alle sammen disse dataene viser at omfattende promoter metylering er assosiert med redusert
PPARG
uttrykk i CRC cellelinjer.
Co-operative effekten av AZA og TSA på
PPARG
re- aktivering
det spesifikke regioner av
PPARG
arrangøren er ulikt denaturert påpeker at epigenetisk mekanisme (e) er involvert i sin deregulert uttrykk i CRC celler. For å bekrefte denne hypotesen, behandlet vi HCT116 med AZA, alene eller i kombinasjon med TSA, en kjent histondeacetylase inhibitor (HDACi). HT29-celler ble anvendt som en kontroll.
PPARG
ekspresjon ble synergistisk indusert av den kombinerte behandling med AZA og TSA i HCT116-celler, mens ikke ble påvirket på HT29-celler, når medikamentene ble anvendt enten alene eller i kombinasjon (fig S3). Disse data indikerer at kromatin-assosiert histon enzymer kan medvirke til genet Slå. For å avgjøre om re-aktivert PPARy oppfører seg som en
bona fide
funksjonell Transkripsjonsfaktor, behandlet vi HCT116-celler med AZA eller TSA alene eller i kombinasjon, og deretter transfektert med en PPRE drevet luciferasereportergenet. Luciferaseaktivitet bestemt i celleekstrakter øket ved AZA og /eller TSA behandling og, påfallende, ytterligere ved tilsetning av troglitazon, en spesifikk PPARy ligand (figur S3). For å demonstrere at økningen i luciferase-aktivitet var veldig avhengig av den re-aktivert reseptor, eksponert vi de transfekterte cellene til PPARy-antagonist, GW9662. En betydelig reduksjon av reportergen aktivitet ble observert på grunn av GW9662 evne til irreversibelt påvirke den transaktive evnen av det modne proteinet (figur S3). Alle sammen disse dataene viser at DNA promoter metylering og histonmodifikasjonene sannsynlig samarbeide for å nedregulerer
PPARG
uttrykk, noe som tyder på at epigenetiske behandlinger reetablere gentranskripsjon og aktivitet.
Spesifikk undertrykkende kromatin merker og DNA metylering er forbundet med
PPARG
transkripsjon
å gi innsikt i mekanismen (e) der DNA metylering og histonmodifikasjonene påvirke
PPARG
uttrykk, kvantitative chip analyser ble utført for å undersøke den promotorsegment som strekker seg -368 til -166 i HCT116-celler. I samsvar med MeDIP data, HDAC1 ble tett bundet til
PPARG
promoter, mens RNA-polymerase II (RNAPol-II) og fosforylert form (P-RNAPol-II) var knapt til stede i ubehandlede HCT116-celler (Figur 3, panel A). Ved eksponering for AZA og TSA i kombinasjon, ble HDAC1 bemerkelsesverdig tømt sammen med en redusert DNA-metylering (figur S2), mens RNAPol-II og P-RNAPol-II ble sterkt forbedret, noe som indikerer gjenvinning av transkripsjon (figur 3, felt A). Følgelig trimetylert H3K4 og acetylert H3K9, som befinner histonmodifikasjonene som normalt forbindes med transkripsjonen aktivitet, ble nesten redusert i ubehandlede HCT116-celler, og betydelig økt med TSA, AZA eller deres kombinasjon (figur 3, felt B). Av notatet, trimetylert H3K9, en markør for forstummet kromatin, ble beriket på
PPARG
promoter og gradvis tømt etter epigenetiske behandlinger, mens trimetylert H3K27 ble betydelig bare redusert med AZA /TSA kombinert behandling (figur 3, panel C). Denne analysen viser at DNA metylering er nært forbundet med repressive kromatin merkene på
PPARG
arrangøren å svekke genuttrykk i CRC celler.
(A) Kvantitativ ChIP analyse i HCT116-celler ble utført før og etter behandlingen med AZA og TSA alene eller i kombinasjon. Native kromatin ble inkubert med antistoffer rettet mot de angitte proteiner. Den immunopresipitert DNA ble brukt som mal i qPCR reaksjoner ved bruk av spesifikke primere for
PPARG
promoter regionen *
P
0,05, **
P
0,01. (B) Chip analysene ble utført som beskrevet ovenfor mot acetylert H3K9 og trimetylert H3K4 *
P
0,05, **
P
0,01 eller (C) trimetylert H3K9 og H3K27 *
P
0,05. Tids-poeng for co-behandlinger var 72 t for fem mikrometer AZA og 24 hs for 300 nM TSA, alene eller i kombinasjon; CC indikerer ubehandlede kontrollceller. Resultatene er gjennomsnittsverdiene ± SD av tre uavhengige eksperimenter, hver utført i duplikat.
siRNA mediert knock-down av MeCP2 og EZH2 redder
PPARG
uttrykk i HCT116 tykktarm kreft celler
koblingen mellom DNA-metylering og histonmodifikasjonene ser ut til å være formidlet av en gruppe proteiner med metyl DNA-bindende aktivitet som inkluderer metyl CpG-bindende protein 2 (MeCP2) [14]. Disse proteinene lokalisere til denaturert promoter regioner og rekruttere protein komplekser som inneholder HDACs, spesielt HDAC1, og histone metyltransferaser (HMTs). Enhancer av Zeste 2 (EZH2) er et medlem av polycomb repressor komplekse 2 (PRC2) med histone metyl-transferase aktivitet på bestemte H3K27 nettsteder [21]. Både MeCP2 og EZH2 har blitt rapportert å være involvert i
Pparg
undertrykkelse i musestel celler som gjennomgår lever fibrogenese [22]. *
P
0,05. **
P
0,01.
