Abstract
Formål
tetraspanin CD151 fungerer som en formidler av metastaser og invasjonen i flere svulster. Men rollen som CD151 i human magekreft (HGC) er fortsatt uklart.
Metoder
Twenty HGC prøver og matchet nontumor prøver, menneskelige mage epitelceller (HGEC), og fire magekreftcelle linjer ble anvendt for å analysere ekspresjon CD151. Kort hårnål RNA-mediert nedregulering av CD151 uttrykk i HGC celler ble utført for å undersøke hvilken rolle CD151 i spredning og metastase /invasjon av HGC celler
in vivo Hotell og
in vitro
. Forholdet mellom CD151 med inte α3 i HGC celler ble undersøkt ved å kneble inte α3 fulgt av co-immunoprecipitation og immunfluorescens farging. Til slutt ble den prognostiske verdien av CD151 og inte α3 evaluert av immunhistokjemi i microarray av 76 HGC pasienter.
Resultater
CD151 ble uttrykt på et høyere nivå i HGC vev og HGC celler enn i nontumor vev og HGEC celler. Nedregulering av CD151 ved vshRNA-CD151 nedsatt metastasering og invasjon av HGC-27 celler, men ikke påvirke celledeling. CD151 dannet et kompleks med inte α3 i HGC celler. CD151-cDNA transfeksjon reddet metastatisk potensial og invasivitet av HGC-27-vshCD151 celler, men ikke de av HGC-27-vshintegrin a3 celler
in vitro
. Klinisk CD151 overekspresjon var signifikant korrelert med høy TNM stadium, dybden av invasjonen og positiv spredning til lymfeknuter (
p
0,05), og høye nivåer av integrin α3 var forbundet med stor svulst størrelse, høy TNM stadium, dybden av invasjon og spredning til lymfeknuter (
p
0,05). Viktigere, den postoperative 5-års overlevelse for pasienter med CD151
lav og /eller inte α3
lav var høyere enn for pasienter med CD151
høy og /eller inte α3
høy.
Konklusjon
CD151 er positivt forbundet med invasivitet av HGC, og CD151 eller kombinasjonen av CD151 og integrin α3 er en ny markør for å forutsi prognosen for pasienter HGC og kan være potensielle terapeutiske mål.
Citation: Yang YM, Zhang ZW, Liu QM, Sun YF, Yu JR, Xu WX (2013) Overuttrykte CD151 Spår Prognose hos pasienter med resected Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58990. doi: 10,1371 /journal.pone.0058990
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, Canada
mottatt: 07.10.2012; Godkjent: 08.02.2013; Publisert: 22 mars 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Akademiker Workstation fondet i Shaoxing Second Folkets sykehus. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Menneskemagekreft (HGC) er den hyppigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1]. Forekomsten av HGC ble anslått til å være 934,000 tilfeller per år med 56% av nye tilfeller forekommer i Øst-Asia, blant annet 41% i Kina og 11% i Japan [2]. Selv om den globale forekomsten av GC har gått ned de siste årene, er dens dødelighet i Kina den høyeste blant alle svulster og utgjør 25% av GC dødelighet på verdensbasis [3]. Til tross for nylige fremskritt i kjemoterapi og kirurgiske teknikker, er det 5-års total overlevelse (OS) raten i Kina lav på 40%. De fleste HGCs er diagnostisert ved stadium III eller IV, og frekvensen av lymfeknutemetastase fra GC er høy (50-75%) [4]. Patogenesen av HGC er multifaktoriell inkludert genetisk disposisjon og miljøfaktorer. Flere genetiske endringer er forbundet med predisposisjon for HGC, inkludert de som omfatter tumorsuppressorgener, onkogener, celleadhesjonsmolekyler, vekstfaktorer, og genetisk ustabilitet [5]. Derfor, å oppnå en bedre forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i HGC og identifisere verdifulle diagnostiske markører og nye terapeutiske strategier er av stor klinisk betydning.
Tetraspanins er celleoverflateproteiner som spenner membranen fire ganger, og er funnet i flere celletyper hos mange organismer. De viser mange egenskaper som indikerer deres fysiologiske betydning i celleadhesjon, motilitet, aktivering og proliferasjon, samt deres bidrag til patologiske tilstander slik som metastase og patologisk angiogenese [6], [7], [8]. CD151 er et celleoverflateglykoprotein tilhører tetraspanin super som først ble vist seg å fremme metastaser i en studie der en ukjent antistoff spesifikt hemmet metastasedannelse i en human epidermoid carcinoma
in vivo product: [
9
]. Antistoffet anerkjent CD151 og hemmet cellevandring uten å påvirke heft eller spredning. Liten interfering RNA (siRNA) mediert nedregulering av CD151 uttrykk i primær melanocytter resulterte i tap av motilitet, mens det hadde liten effekt på steady-state nivåer av inte. Videre kan disse endringene bli reversert når CD151 ble gjen uttrykt [10]. Overekspresjon av CD151 ble vist å aktivere integrin og vekstfaktor-reseptor-avhengige signalveier, noe som resulterte i økt motilitet og invasivitet av kreftceller [11]. Denne prosess ble også foreslått å bidra til aktivering av reaksjonsveier mediert av små GTPases, noe som øker GTP-binding til Cdc42 og Rac, organiserte cellen cytoskjelettet. Adhesjonen-avhengig aktivering av Ras, ERK /MAPK1 /2 og protein-kinase B (PKB) /Akt har vist seg å være modulert av CD151 [7], [12]. Det store utvalget av funksjoner av CD151, og i særdeleshet sitt engasjement i invasivitet og metastasering av kreft celler, tyder på at en bedre forståelse av sitt uttrykk og rolle i HGC kan være viktig.
I denne studien har vi undersøkt uttrykk for CD151 i humane mage epitelceller (HGEC), HGC cellelinjer, HGC prøver, og tilstøtende nontumorous vev. I tillegg, vi utforsket effekten av siRNA stanse av CD151 på spredning, invasivitet og metastatisk evne HGC-27 celler, og undersøkt forholdet mellom CD151 og inte α3. Til slutt, ble ekspresjonen av CD151 og integrin α3 undersøkt ved immunhistokjemi i et vev microarray som består av 76 tilfeller av HGC, og den prognostiske rolle CD151 og /eller integrin α3 i HGC ble undersøkt.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
HGEC og HGC cellelinjer, inkludert HGC-27, AGS, MKN28, og MGC803, ble oppnådd fra American Type Culture Collection og holdt i vårt laboratorium. Alle cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) ved 37 ° C i en fuktet inkubator under 5% CO
2.
Pasienter og oppfølgings~~POS=TRUNC
Tjue ferske tumorprøver fra områder nær svulsten margin og matchet ikke-tumorvev (mer enn 3 cm fra tumor) ble blindt hentet fra påfølgende pasienter med HGC som gjennomgikk kurativ reseksjon mellom februar 2009 og november 2010 kl Shaoxing Second Folkets sykehus (Shaoxing, Kina). En annen 76 pasienter med magekreft som gjennomgikk R0 reseksjoner med utvidet lymfeknute disseksjon (D2) mellom september 2005 og september 2008 kl Shaoxing Second Folkets sykehus ble inkludert i denne studien. Evalueringen av resected prøvene ble utført i samsvar med retningslinjene i den japanske Gastric Cancer Association (1998). Hver standard reseksjon involvert fjerning av gruppe 1 og 2 lymfeknuter (range 36-60, mener 47,6). Stage klassifisering ble utført i henhold til TNM klassifikasjon for HGC (UICC). Prøvene ble valgt på grunnlag av tilgjengeligheten av egnede formalinfikserte, parafininnstøpte vev og fullstendig clinicopathologic og oppfølgings data fra pasientene. Karakteristikken av forsøkspersonene ble oppsummert i tabell 1. Denne studien ble godkjent av Shaoxing Second Folkets sykehus forskningsetiske komité og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle personer. Ingen av pasientene fikk kjemoterapi eller strålebehandling før eller etter operasjonen som en del av en adjuvant program. Oppfølging datainnsamling ble avsluttet september 2012. Median oppfølgingstid på 43,0 måneder (range 6-78 måneder). Oppfølgingsrutiner besto av interims historie, fysisk undersøkelse, vurdering av tumormarkører (CEA, CA-199), abdominal ultralyd og røntgen hver 2-3 måneder eller CT hver 6. måned. Total overlevelse (OS) ble definert som intervallet mellom kirurgi og død eller mellom kirurgi og den siste observasjon i overlevende pasienter. Dataene ble sensurert i siste oppfølging for å leve pasienter.
RNA Utvinning og revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av TRI reagens (Sigma) i henhold til produsentens protokoll. RNA ble deretter behandlet med DNaseI (Roche Diagnostics), renset gjennom en RNeasy-kolonne (Qiagen) og underkastet elektroforese for å bestemme integriteten til RNA før bruk i 5′-RACE-eksperimenter. Komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert fra 2 ug av total-RNA ved hjelp av tilfeldige heksamerer (Proligo) og Superscript III revers transkriptase (Invitrogen). RT-PCR ble utført på et panel av cellelinjer og tumorprøver. Primerne anvendt for PCR var som følger: CD151, 5′-ACTTCATCCTGCTCCTCATCAT-3 «og 5′-TCCGTGTTCAGCTGCTGGTA-3′; integrin α3, 5»-CGAGAGGAAAGAGGAAGTAGGGGGT-3 «og 5′-ATGAAGAAGGAGTGAGGGGTGAGCA-3′; Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 5»-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3 «og 5′-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3». RT-PCR-betingelsene var som følger: 10 min ved 94 ° C, denaturering ved 94 ° C i 20 s, annealing ved 59 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 60 sek. Uttrykket av CD151 og inte α3 forhold til husholdningsgenet GAPDH ble analysert ved tetthet analyse ved hjelp Band Scan v5.0 programvare. Alle forsøk ble utført in triplo.
Immunoblotting og Immunofluorescens-analyse
Total celleekstrakt protein (30 pg) ble separert ved SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, overført til polyvinylidendifluorid-membraner, og inkubert med den tilsvarende antistoffer. Membranene ble utviklet med den forbedrede chemiluminescence metoden (Pierce, Rockford, IL, USA). Mus anti-human CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) og anti-integrin-a3-monoklonale antistoffer (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) ble anvendt for å detektere ekspresjon av CD151 og integrin α3 hhv . GAPDH (1:5,000; Chemicon, USA) ble anvendt som en intern kontroll. Alle forsøk ble utført in triplo.
HGC-27 celler ble anvendt for å detektere beliggenheten til CD151 og integrin α3 som tidligere beskrevet [13]. Mus anti-humant CD151 monoklonalt antistoff (11G5a, 1:200; Serotec, UK) og muse anti-humant integrin α3 antistoff (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) ble anvendt. Skivene ble analysert ved fluorescens mikroskopi (Leica Microsystems Imaging Solutions).
Transfeksjon av Lentiviral vektorer med små hårnål RNA Mot CD151 og Inte α3
pGMLV /Neo-shRNA-CD151 vektor ble konstruert i henhold til produsentens instruksjoner (pGMLV, en liten hårnål RNA (shRNA) i Vector, Shanghai Genomeditch Co Ltd). Tre shRNA-CD151 lentiviral vektorer (pGMLV-GFP-shRNA -CD151) ble generert for å dempe uttrykk for CD151 i HGC-27 celler (shRNA-CD151-HGC-27). De shRNA målrettet mot sekvenser for CD151 var som følger: # 1, 5′-CATGTGGCACCGTTTGCCT-3 «; # 2, 5»-TACCTGCTGTTTACCTACA-3 «; # 3, 5»-CATACAGGTGCTCAA TAAA-3 «. Den shRNA targeting sekvens for inte α3 var som følger: 5’CCTCTATATTGGGTACACGAT-3 «(Shanghai Genomeditech, Shanghai, Kina). Stabilt transfekterte kloner ble karakterisert ved hjelp av RT-PCR og analysert ved immunblotting for uttrykket nivåer av CD151 og integrin a3-proteiner.
MTT-analyse, cellemigrering, og Matrigel bølgen Analyser
Celler ble sådd i 96-brønners plater (2.000 per 200 pl-brønn) og inkubert i 24, 48 og 72 timer. Et 20 ul volum av MTT-løsning ble tilsatt ved de angitte tidspunkter, og inkubert i 4 timer. Mediet (200 ul DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum) ble så erstattet med 150 ul DMSO, platene ble ristet i 10 minutter, og absorbansen ved 490 nm ble målt for å bestemme antall levedyktige celler i hver brønn. Alle forsøkene ble utført tre ganger.
Cellemigrering ble evaluert ved anvendelse av en sårhelende analysen. Celler ble dyrket til 80-90% konfluens i 24-brønners plater. Et sår ble laget ved å flytte en plastpipette spiss på tvers av celleoverflaten. De gjenværende cellene ble vasket tre ganger for å fjerne cellerester og inkubert ved 37 ° C med serumfritt medium. Ved de angitte tidspunkter ble migrerende celler ved såret fremre fotografert og sammenlignet. Tre separate eksperimenter ble utført
Cell invasjonen analysene ble utført ved hjelp av 24-brønns transwells (8 mikrometer porestørrelse Millipore). Forhåndsbelagt med Matrigel (Falcon 354 480, BD Biosciences). Totalt 1 x 10
5-celler ble deretter suspendert i 500 ul DMEM inneholdende 1% FBS og tilsatt til det øvre kammer, mens 750 ul DMEM inneholdende 10% FBS ble plassert i det nedre kammer. Etter 48 timers inkubering, ble Matrigel og celler som er igjen i det øvre kammer fjernet ved bomullspinner. Celler på den nedre overflaten av membranen ble fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med Giemsa. Celler i 5 mikroskopiske felt (forstørrelse, × 200) ble talt opp og fotografert. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
In Vivo metastaser Analyser
For in vivo metastase analyser, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 og MGC-803-vshRNA CD151-cDNA- CD151-celler ble transplantert inn i nakne mus (5 uker gamle BALB /c-nu /nu, 5 pr gruppe, 1 x 10
6 celler for hver mus) gjennom den laterale halevenen [14]. Etter 7 uker, ble musene avlivet. Deres lunger ble fjernet og underkastet hematoxylin og eosin (H eosin farging, og representative områder ble premarked i parafinblokker, vekk fra nekrotiske og hemoragisk materialer. Duplikater av 1-mm-diameter sylindre fra to forskjellige områder, tumor, og den nærmeste noncancerous margin (betegnet som intratumor og peritumor, henholdsvis, totalt fire slag) ble inkludert i hvert tilfelle, sammen med forskjellige kontroller, for å sikre reproduserbarhet og homogen farging av slides (Shanghai biochip Co Ltd, Shanghai). Således ble fire forskjellige vev mikromatrise blokker konstrueres, hver inneholdende 140 sylindere. §§ 4 mikrometer tykke ble plassert på lysbilder belagt med 3-aminopropyltrietoksysilan. Monoklonale mus anti-human CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) og muse anti-humant integrin α3 (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) antistoffer ble brukt til å påvise ekspresjon av CD151 og integrin α3 . Bilder ble tatt til fange av Leica QWin Plus v3 programvare. Intensiteten av positiv farging ble målt som beskrevet. Intensiteten av CD151 og integrin α3 ble klassifisert i to nivåer av ekspresjon i henhold til det midlere området av positiv farging som verdi cutoff som følger: CD151
høy, 50% av tumor-delen; og inte α3
høy, 25% av svulsten delen; CD151
lav, 50%, og inte α3
lav, 25% [15]
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med SPSS 16,0 programvare (. SPSS). Verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. For immunhistokjemiske markører, cutoff for definisjonen av undergruppene var median intensitet verdi. Den χ
2-test og t-test ble brukt for sammenligninger mellom grupper. OS ble definert som tidligere beskrevet [15]. Prognostisk betydning ble vurdert ved hjelp av Kaplan-Meier overlevelsesestimater og log-rank tester. Cox proporsjonale farer regresjonsmodell ble brukt til å analysere de uavhengige prognostiske faktorer. Alle testene var tosidige og
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
CD151 er overuttrykt i HGC
CD151 uttrykk ble analysert. ved RT-PCR og immunoblotting i HGC svulsten og matchet nontumor vev. CD151 ble uttrykt ved lave nivåer i nontumor vev sammenlignet med HGC vev. Som vist på fig. 1A, B og C, den relative ekspresjon av CD151-proteinet i HGC prøvene var 2,95 ± 0,21 (spredning, 1,13 til 3,59) sammenlignet med 1,30 ± 0,09 (range, 1,00 til 1,81) i nontumor prøver, og forskjellen var statistisk signifikant (
p
0,01). Videre CD151 uttrykk nivåer var signifikant lavere i HGEC enn i HGC-27, AGS, MKN28 og MGC803 celler (p 0,05). Ingen forskjeller i CD151 ekspresjonsnivåer ble detektert blant HGC celler (Fig. 1D, E og F). Immunohistochemstry (IHC) analyser bekreftet at CD151-proteinet ble uttrykt i høyere nivåer i HGC vev enn i matchet nontumor vev (fig. 1G).
(A) Ekspresjon av CD151 mRNA og protein i GC prøvene og den matchet nontumorous prøver; (B og C) et histogram viste CD151 mRNA i GC prøvene og de samsvar nontumorous prøvene (p 0,05); (D) RT-PCR og immunoblotting analysert uttrykk for CD151 i HGEC og HGC-27, AGS, MKN28 og MGC803 celler (p 0,05); (E og F) Et histogram viste CD151 mRNA og protein i HGEC og HGC-27, AGS, MKN28 og MGC803 celler (p 0,05).
CD151 fremmet invasjon og metastasering av HGC Cells
in vitro og in vivo
for å undersøke hvilken rolle CD151 i HGC celler, vi endret uttrykk av CD151 i HGC-27 celler ved RNA interferens og cDNA-CD151 transfeksjon (fig. 2A) . Resultatene av den til sårheling analysen viste en forsinkelse i den til lukking av sår frekvensen av shRNA-CD151-HGC-27-celler etter 48 timer sammenlignet med HGC-27-Mock-celler, som ble gjenvunnet ved cDNA-CD151 transfeksjon (fig. 2B). Nedregulering av CD151 hadde ingen signifikant effekt på celleformering (
p
0,05, figur 2C.). Imidlertid er nedregulering av ekspresjon CD151 svekket invasivitet av HGC-27-celler (figur 2D, E.)
(A) Ekspresjon av CD151 i HGC-27 celler ved hjelp av RNA-interferens og cDNA-CD151 transfeksjon.; (B) ned /eller oppregulering av CD151 har ingen innflytelse på celleproliferasjon (
p
0,05); (C) Den sårhelende analyse viste at en tydelig forsinkelse i den til lukking av sår frekvensen av HGC-27-vshRNA-CD151-celler ble funnet ved 24 og 48 timer, sammenlignet med HGC-27-Mock-celler, mens det var utvinningen av cDNA- CD151 transfeksjon; (D og E) Matrigel invasjons analyser viste at dun /eller opp-regulering av CD151-ekspresjon ble ledsaget av en stige /eller stige invasjon av HGC celler in vitro; (F og G) Serial seksjoner fra mus lunge viste metastase evnen til kreftceller som uttrykker forskjellige CD151 (Skala: 50 um).
For å undersøke hvilken rolle CD151 i metastase in vivo videre, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 og MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151 celler ble transplantert inn i hårløse mus gjennom den laterale halevenen. Histologisk analyse av lungene av mus bekreftet at nedregulering av CD151 trykkes lungemetastasedannelse. Tallene og størrelse av lungemetastase knuter ble betydelig redusert i MGC-803-vshRNACD151 gruppen sammenlignet med MGC-803-Mock og MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151-celler (fig. 2 F, G). Til sammen våre resultater tyder på at CD151 er en positiv regulator av magekreft metastaser.
CD151 danner et kompleks med Inte α3 og lyddemping av Inte α3 svekker HGC Cell Invasion indusert av CD151 Overuttrykte
involvering av tetraspanins i integrin-medierte regulering av kreftmetastaser er blitt demonstrert, og α3β1 integrin har vist seg å fremme GC invasjon og metastase [16]. Derfor, undersøkte vi forholdet mellom integrin α3 og CD151 i HGC celler. Som vist på fig. 3A, integrin α3 ble uttrykt i høyere nivåer i HGC celler enn i HGEC celler. Co-immunoutfellingsstudier Forsøkene viste at CD151 dannet et kompleks med integrin α3 i HGC-27-celler (fig. 3B, C). Dessuten, CD151 og integrin α3 co-lokalisert på plasmamembranen til HGC-27 celler, som vist ved immunofluorescens (Fig. 3D).
(A) Ekspresjon av integrin α3 var mye høyere i HGEC og HGC cellene ; (B og C) Dette ko-IP identifisert at integrinet α3 danne et kompleks med integrin α3; (D) Dobbelt flekker indikerte CD151 og integrinα3 samlokalisert på membranen av HGC-27 celler; (E) for nedregulering av integrin α3 i HGC celler; (F) Matrigel invasjonen analysene viste at nedregulering av inte α3 ble ledsaget av en descend invasjon av HGC celler, de inte α3 interferens og inte a3 antistoffer hemmet celler invasjonen utrustet med CD151.
Å ytterligere undersøke involvering av CD151 i inte α3 funksjon, ble cellene utsatt for RNA interferens eller cDNA transfeksjon og analysert av Transwell forsøk etter å ha byttet matrisen gel med laminin-332 [17]. Resultatene viste at tie av integrin α3 markert hemmet invasjonen av HGC-27-celler, og CD151 cDNA-transfeksjon reddet invasiv evne HGC-27-vshRNACD151, men ikke den av HGC-27-integrin vshRNA a3 celler. Videre integrin a3-antistoffer inhiberte invasjonen av HGC-27-vshRNACD151-cDNA-CD151-celler (fig. 3E, F). Disse resultatene antydet en samordnet funksjon av CD151-integrin α3 kompleks, og indikert at høye nivåer av CD151 og inte α3 er assosiert med den økte metastatisk potensial av GC-celler.
Ekspresjon av CD151 eller Inte α3 er positivt assosiert med Ondartede fenotyper av HGC av Immunohistochemistry
uttrykk for CD151 og inte α3 protein ble undersøkt i 76 primær HGC pasienter som bruker microarray (TMA). CD151 protein immunreaktivitet lokalisert til cellemembranen (Fig. 4A). I tumorvev, CD151 uttrykk viste betydelig heterogenitet i de ulike prøvene (fig. 4A1, b1, C1 og D1). CD151
høy utgjorde 50% (38/76) av hele kullet. Som vist i tabell 1, CD151
høy var signifikant korrelert med tumorstørrelse (
p =
0,021), dybde av invasjon (
p =
0,004), spredning til lymfeknuter (
p =
0,028) og høy tumorstadium (
p =
0,002). Men andre kliniske kjennetegn, blant annet alder, kjønn og tumor differensiering, var ikke signifikant relatert til uttrykk av CD151.
(A) immunreaktivitet av CD151 og integrinα3 protein ble plassert i cellemembranene. I tumorvev, CD151 uttrykk viste betydelig heterogenitet i de ulike prøvene (Fig.4a1, b1, C1 og D1). Positiv farging av Integrinα3 ble observert i membran av carcinomceller (fig. 4 a2, b2, c2, og D2). (B, C og D) Prognostic betydning vurderes av Kaplan-Meier overlevelsesestimater og log-rank tester. Sammenligninger av OS etter CD151 (B), Integrinα3 (C), og Co-overekspresjon av CD151 og integrinα3 (D).
membraner av tumorceller farget positivt for inte α3 (fig. 4A2, b2, c2 og d2). I alle vev analysert, ble høye nivåer av inte α3 uttrykk påvist i 27 vevsprøver HGC (35.52%). I samsvar med resultatene fra tidligere studier [16], [18], pasienter med høyt inte α3 uttrykket var mer sannsynlig vise aggressive egenskaper. Inte α3
høye pasientene viste større svulster (
p =
3.46E-4), større dybde av invasjon (
p =
0,001), høyere tumorstadium (
p =
0,005), og mer spredning til lymfeknuter (
p =
0,040) enn pasienter med lav inte α3 uttrykk (tabell 1).
Overuttrykte CD151 og /eller inte~~POS=TRUNC α3 er uavhengige faktorer Prognostisering av Prognose av HGC Pasienter
Frem til siste oppfølging, 3- og 5-års OS priser i hele befolkningen var 53,0 og 40,78%, 5-års OS i CD151
lav gruppen var signifikant høyere enn i CD151
høy gruppen (68,42%
vs.
23,68%, henholdsvis
p
= 0,007, fig. 4B), og den postoperative 5-års OS av HGC pasientene var høyere i inte α3
lav enn i inte α3
høy gruppen (66,67%
vs.
13,51%,
p
= 6,67 E-6). Evaluering av den kombinerte effekten av CD151 og inte α3 på prognosen for HGC viste at 5-års OS av CD151
høy /inte α3
høye pasienter (gruppe III, n = 23) var 17,40%, som var betydelig lavere enn for CD151
lav /inte α3
lave pasienter (77,78% gruppe i, n = 27) og enten lave pasienter (pasienter med lav CD151 eller lav inte α3 alene) (23,08%, gruppe II , n = 26, fig. 4C og D).
Univariat analyse viste at svulsten størrelse, dybde av invasjonen, spredning til lymfeknuter, høy tumorstadium, høy CD151 uttrykk, høy inte α3 og co-uttrykk av CD151 og integrin α3 var prediktorer for OS. Andre kjennetegn som alder, kjønn og differensiering hadde ingen prognostisk betydning for OS (tabell 2). Multivariat Cox modellen viste at dybden av invasjonen var en uavhengig prognostisk indikator for OS (tabell. 2).
Diskusjoner
Resultatene fra denne studien viste at CD151 ble uttrykt ved høyere nivåer i GC-celler og tumorvev enn i HGEC celler og nontumor vev, noe som er i samsvar med tidligere rapporter om CD151 ekspresjon i en rekke tumorer, inkludert intrahepatisk kolangiokarsinom, HCC, bryst, lunge, colon og prostata cancer [15], [19], [20], [21]. Videre vår studie viste at CD151 danner en funksjonell kompleks med inte α3, og nedregulering av CD151 eller inte α3 uttrykk markert hemmet invasjon og metastasering av HGC celler in vitro. Klinisk våre resultater viste at høyt nivå av CD151 uttrykk eller co-overekspresjon av CD151 og inte α3 kan ha ugunstig prognostisk betydning for pasienter med GC.
Den første bevis for at CD151 fremmer metastase kom fra en studie som viser at et antistoff med ukjent spesifisitet hemmet metastase dannelsen av et menneske epidermoid carcinoma linjen
in vivo
. Antistoffet anerkjent CD151 og hemmet cellevandring uten å påvirke heft eller spredning [22]. Overekspresjon av CD151 er blitt påvist i mange tumortyper, og øket CD151 ekspresjon har vært assosiert med en dårlig prognose i bryst, pankreas, og ikke-små-celle lungekreft, så vel som HCC. Videre CD151 har vist seg å være en bedre prediktor for prognosen hos pasienter med prostatakreft enn histologisk gradering [23]. I denne studien, to linjer med bevis indikerte at overekspresjon av CD151 er av klinisk betydning hos HGC. Først CD151 overekspresjon ble hyppigere observert i HGC pasienter med dårlig prognose. For det andre, økt uttrykk av CD151 forbedret invasjon og metastasering av HGC celler. I tillegg kliniske data avslørte at forhøyet CD151 uttrykk bedre enn andre vanlige kliniske parametre som økt tumorstørrelse og dårlig differensiering for å forutsi HGC prognose. Samlet utgjør disse funnene tyder på at CD151 spiller en viktig rolle i utviklingen av HGC. I denne studien, viser vi at CD151 samhandler med inte α3 i HGC celler. Modulering av uttrykket nivåer av integrin α3 i HGC-27-vshCD151-cDNA-CD151-celler viste dannelsen av en funksjonell CD151-integrin α3 kompleks og viste at co-overekspresjon av CD151 og integrin α3 var assosiert med øket metastatisk potensial på HGC cellene . Tatt i betraktning den etablerte rolle inte α3 i HGC [16], er det rimelig å anta at CD151 overekspresjon kan fremme metastase /invasjonen i GC.
På grunn av deres hydrofobe natur, tetraspanins forbinder med hverandre og med andre membran proteiner [24]. Faktisk er det vel etablert at tetraspanins tilveiebringe et signaleringsplattform i plasmamembranen ved dannelse av tetraspanin anriket mikroområder (tems) [6], [7]. Hittil har forskjellige typer av membranproteiner, blant annet vekstfaktorreseptorer, integriner, immunoglobulin-domener og EWI-F (en subfamilie av Ig-proteiner) ble funnet i tems [25]. Dessuten har funksjonene til disse membranproteiner er rapportert å være intimt forbundet med tems. For eksempel ble forskjellige kombinasjoner av tetraspanins danner tems funnet å påvirke funksjonen av vekstfaktorreseptorer og integrin. Enda viktigere, uttrykket nivået av individuelle tetraspanins i tems har også en betydelig effekt på de tilhørende proteiner [26], [27]. I nyere studier, knock-down av CD151 ble vist å påvirke dannelsen av temer og CD151 sletting inhiberte funksjon av flere membranproteiner, noe som indikerer at CD151 spiller en kritisk rolle i TEM-dannelse og funksjon [7], [26]. Videre blokkering av CD151 alvorlig forringet invasivitet og metastatisk potensial av tumorceller, og rettet mot den CD151 proteinet eller temer har blitt et lovende terapeutisk strategi [23]. I denne studien ble det uttrykk for CD151 vist seg å være en uavhengig prediktor for OS. Men den kombinerte ekspresjon av CD151 og integrin α3 var en mer pålitelig indikator for OS enn CD151 eller integrin α3 uttrykk alene, støtter ideen om at både CD151 og integrin α3 spiller en viktig rolle i HGC. Derfor våre resultater er betydelige og foreslår at CD151 eller CD151-inte α3 kompleks kan være viktige mål i behandling av pasienter med GC.
I konklusjonen, er CD151 overekspresjon en prediktor for dårlig utfall hos pasienter med HGC
