Abstract
Bakgrunn
multilegemiddelresistente kreftceller er vanskelig å utrydde for inefficacy av konvensjonelle kreft narkotika. Foruten rømmer de cytotoksiske effektene av kjemoterapi, de omgå også pro-immunogene effekter indusert av kreft narkotika: ja de ikke er godt anerkjent av verts dendrittiske celler og ikke lokke fram et holdbart anti-tumor immunitet. Det er ennå ikke undersøkt om multilegemiddelresistente celler har en annen evne til å indusere immunsuppresjon enn kjemosensitiv seg. Vi behandlet dette spørsmålet i menneskelige og murine kjemosensitiv og multidrug resistente kreftceller.
Resultater
Vi fant at aktivitet og uttrykk av indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1), som katalyserer konvertering av tryptofan i det immunsuppressive metabolitt kynurenine, var høyere i alle de multilegemiddelresistente celler analysert og at IDO1 hemming redusert vekst av resistente svulster hos immunkompetente dyr. I kjemoresistent celler den basale aktiviteten JAK1 /STAT1 og JAK1 /STAT3 signale var høyere, jo STAT3 inhibitor PIAS3 ble nedregulert, og autokrint produksjon av STAT3-mål og IDO1-indusere cytokiner IL-6, IL-4, IL- 1β, IL-13, TNF-α og CD40L, ble øket. Avbrudd i JAK /STAT signale senket IDO1 aktivitet og reversert kynurenine-indusert pro-immunsuppressive effekter, som avslørt av den restaurerte spredning av T-lymfocytter i STAT-forstummet kjemoresistent celler.
Konklusjoner
Vårt arbeid viser at multilegemiddelresistente celler har en sterkere immunundertrykkende holdning enn kjemosensitiv celler, på grunn av konstitutiv aktivering av JAK /STAT /IDO1 akse, noe som resulterer kjemo- og immun-unnvikende. Forstyrre denne aksen kan forbedre effekten av chemo-immunterapi protokoller mot resistente svulster
Citation. Campia jeg, Buondonno jeg, Ella B, Rolando B, Kopecka J, Gazzano E et al. (2015) En Autocrine cytokin /JAK /STAT-signale induserer Kynurenine Synthesis i multilegemiddelresistente humane kreftceller. PLoS ONE 10 (5): e0126159. doi: 10,1371 /journal.pone.0126159
Academic Redaktør: Michael Platten, Universitetssykehuset i Heidelberg, Tyskland
mottatt: 27 oktober 2014; Godkjent: 29 mars 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Campia et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC; gi MFAG 11475; www.airc.it), det italienske departementet for universitet og forskningsdepartementet ( «Future i forskningsprogrammet» FIRB 2012, gir RBFR12SOQ1, www.istruzione.it). JK er stipendiat i den italienske Foundation for Cancer Research (FIRC; www.fondazionefirc.it). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Å oppnå en god kjemoterapi effekt og indusere en holdbar anti-tumor immunrespons er de viktigste utfordringene i chemoimmunotherapy. Chemoresistance, særlig den samtidige motstand mot forskjellige kjemoterapeutiske midler kjent som multimedikamentresistens (MDR), er en av de største problemene som oppstår av kjemoterapi [1]. MDR kan være tilstede ved diagnose eller indusert ved selektivt trykk av kjemoterapi; det ofte er avhengig av overekspresjon av ATP-bindende kassett (ABC) transportører som er ansvarlig for den anticancer medikament dyseutstrømningen, slik som P-glykoprotein (Pgp), MDR beslektede proteiner (et maskinlesbart pass) og brystkreft motstand protein (BCRP). Sammen har de utstrømning både klassiske kjemoterapeutika (f.eks antracykliner, taxaner, Vinkaalkaloider, epipodofyllotoksiner, topotekan, metotreksat) og nye målrettede legemidler (f.eks imatinib, dasatinib, lapatinib, gefitinib, sorafenib, erlotinib), noe som begrenser deres cytotoksiske effekter [2].
spesifikke kjemoterapeutiske midler, så som antracykliner og oksaliplatin, induserer også pro-immunogene virkninger, ved å indusere trans på plasmamembranen til bestemte «eat me» signaler, som chaperon calreticulin, som utløser tumorcelle fagocytose og den etterfølgende aktivering av antitumor CD8
+ T-lymfocytter [3]. Denne mekanismen fungerer ikke i celler som overuttrykker Pgp [4-6], noe som resulterer samtidig kjemo- og immun-motstandsdyktig.
Videre tumorceller kan unngå vertens immunosurveillance ved å undertrykke aktiviteten av verten immunforsvar. En mengde mekanismer megle tumorindusert immunsuppresjon, inkludert: endringer i tumor overflateantigener; frigjøring av immunsuppressive cytokiner i svulsten mikromiljøet; ekspansjon av T-hjelper 2-lymfocytter, T-regulatoriske (treg) celler, myeloide avledet suppressorceller og type 2-tumorassosierte makrofager, noe som favoriserer tumorvekst og svekke aktiviteten av antitumor populasjoner, slik som T-hjelpe 1 lymfocytter , CD8
+ T-lymfocytter, type 1-tumorassosierte makrofager, naturlige dreperceller [7].
Et av de sterkeste mediatorer av den tumor-indusert immunsuppresjon er kynurenine, er produktet av tryptofan katabolisme via tryptofan dioksygenase (TDO) [8] og indoleamine 2,3-dioksygenase enzymer (IDO1 og IDO2) [9], som er indusert av interferon-γ (IFN-γ) [10, 11], nitrogenoksid (NO) [12 ] og jern [13]. Tryptofan er en essensiell aminosyre for spredning og overlevelse av CD8
+ og CD4
+ T-lymfocytter; dessuten den økede kynurenine /tryptofan-forhold kompromitterer sterkt effektiviteten av verten cellulær immunitet, fordi kynurenine hemmer aktiveringen av T-lymfocytter [7, 14]. IDO1 blir uttrykt i tumor-infiltrerende dendrittiske celler [15] og i stromale tumorceller [16], og det er blitt funnet konstitutivt uttrykt eller oppregulert i flere tumorceller [14, 17]. En økt serum kynurenine /tryptofan Forholdet er korrelert til en raskere progresjon av lungekreft [18] og IDO positivitet i tumorprøver er vanligvis forbundet med dårlig klinisk prognose [19-21]. IDO1 over-uttrykk støtter tumorvekst og progresjon av lungekrefttilfellene [22], noe som fører til hypoteser som kynurenine, i tillegg til sine immunsuppressive effekter, kan direkte forbedre svulsten utvikling.
Vi har tidligere vist at multidrug resistente cellene er resistente mot den immunogene død drives av dendrittiske celler-mediert fagocytose [4-6]. Det har ikke vært undersøkt om multilegemiddelresistente celler skiller seg fra kjemosensitiv seg også for evnen til å indusere immunosuppresjon: vi funnet at multimedikament-resistente celler hadde et basalt høyere produksjon av den immunsuppressive metabolitten kynurenine enn kjemosensitiv celler, og vi har undersøkt den molekylære basis for denne fenotype.
Materialer og metoder
Kjemi
plasticware for cellekulturer var fra Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Elektroforese reagenser ble oppnådd fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Det humane rekombinante IFN-γ ble oppnådd fra R pH ble justert til nøytralitet med NaOH.
Cells
Den menneskelige kjemosensitiv ikke-småcellet lungekreft A549 celler ble kjøpt fra Istituto Zooprofilattico Sperimentale «Bruno Umbertini» (Brescia, Italia). De menneskelige kjemosensitiv tykktarmskreft HT29 celler, menneske kjemosensitiv kronisk myelogen leukemi K562 celler, menneske kjemosensitiv mesothelial Met5A cellene og murine konstitutivt kjemoresistent melke JC celler fra ATCC (Manassas, Virginia) The resistente underlinjer A549 /dx, HT29 /dx, K562 /dx ble samlet i vårt laboratorium ved å dyrke de ovenfor nevnte foreldrecellene i et medium inneholdende økende konsentrasjoner av doxorubicin, som brukes som en MDR induser, som rapportert tidligere [4]. Den menneskelige konstitutivt kjemoresistent ondartet mesothelioma (HMM) celler ble samlet, etter informert skriftlig samtykke fra pasientene, ved Biologisk Bank of Ondartet Mesothelioma (S.S. Antonio e Biagio Hospital, Alessandria, Italia), hvor histologiske karakterisering ble utført [23]. Den eksperimentelle protokollen (kode: TASK3) ble vedtatt 09.11.2011 av bioetikkomité ( «Comitato Etico Interaziendale») av S.S. Antonio e Biagio Hospital, Alessandria, Italia. Cellene ble dyrket i respektive dyrkingsmedium supplert med 10% volum /volum føtalt bovint serum (FBS), 1% volum /volum penicillin-streptomycin, 1% volum /volum L-glutamin og ble holdt i en fuktig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO
2
Kynurenine måling
IDO-aktiviteten ble bestemt i henhold til [24], med mindre modifikasjoner:. 200 ul av cellekultur-supernatantene ble tilsatt til 100 ul 30% vekt /volum trikloreddiksyre (TCA) og inkubert i 30 minutter ved 50 ° C for å hydrolysere N-formylkynurenine til kynurenine. Etter sentrifugering ved 10 000 xg i 10 minutter, ble 100 ul av supernatanten overført til en 96-brønns plate, blandes med 100 ul av 2% w /v p-dimethylamino-benzaldehyd i 99,8% volum /volum eddiksyre og inkubert i 10 min ved romtemperatur. Kynurenine ble påvist ved å måle absorbansen ved 490 nm, ved hjelp av en Synergy HT multi Detection Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT). Absorbansen av kulturmediet alene ble betraktet som en blank og ble subtrahert fra verdien oppnådd i nærvær av cellene. Resultatene ble uttrykt som nmol kynurenine /mg celleprotein, ifølge en titreringskurven tidligere angitt. Kynurenine nivåer i cellekultursupernatanter ble målt parallelt ved hjelp av høytrykks-væskekromatografi (HPLC), som rapportert i [25], med mindre modifikasjoner: 400 ul av cellekultursupernatanter ble tilsatt til 100 pl 30% vekt /volum TCA , inkubert i 30 minutter ved 50 ° C og sentrifugert ved 15 000 xg i 10 min. Den klare Supernatanten ble filtrert gjennom 0,45 mikrometer PTFE filtre (Alltech, Nicholasville, KY) og analyseres av et Agilent LC system (Palo Alto, CA), utstyrt med vakuumavgasser (G1322A), kvartære pumpe (G1311A), manuell-injektor (Rheodyne , Cotati, CA) og multippel bølgelengde detektor (G1365A) integrert i HP1200 systemet. Dataene ble anskaffet og behandlet med Agilent ChemStation programvare. Injeksjonsvolumet var 20 ul. Et Agilent Eclipse XDB-C18-kolonne (125 mm x 4,0 mm, 5 um) ble anvendt for analyse ved 30 ° C. Kromatografisk separasjon ble utført ved anvendelse av den mobile fase bestående av 15 mmol /l acetat-buffer (pH 4,0) og acetonitril (90:10, v /v) ved en strømningshastighet på 0,8 ml /min. Eluatet ble overvåket ved 365 nm, betegnet mot en bølgelengde 700 nm. Kalibreringsprøvene ble fremstilt ved å tilsette kynurenine standarder (Sigma Chemical Co.) i konsentrasjonsområdet fra 0,50 til 50 pmol /l til kulturmediet. Resultatene ble uttrykt som nmol kynurenine /mg celleproteiner.
QRT-PCR og PCR arrays
Den totale RNA ble ekstrahert og revers-transkribert ved hjelp av iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories ). Den QRT-PCR ble utført med iTaq Universal SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad Laboratories). Det samme cDNA forberedelse ble brukt til å kvantifisere genet av interesse og husholdningsgenet
β-aktin
. Primersekvensene, designet med qPrimerDepot programvare (https://primerdepot.nci.nih.gov/), var: for
IDO1
: 5’CAGGCAGATGTTTAGCAATGA -3 «; 5’GATGAAGAAGTGGGCTTTGC -3 «; for
β-aktin
: 5’GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3 «; 5»- TGTCACGCACGATTTCC-3 «. Mengden av
IDO1
mRNA ble normalisert mot mengden av
β-aktin
mRNA, valgt som husholdningsgenet, og ble uttrykt som
IDO1 Twitter /
β- aktin
forholdet, ved hjelp av Bio-Rad programvare Gene Expression Kvantitering (Bio-Rad Laboratories). PCR arrays ble utført på en mikrogram cDNA ved hjelp av menneskelig JAK /STAT signalveien RT² Profiler PCR Array og Human IL-6 /STAT3 signalveien Plus RT² Profiler PCR Array (Qiagen, Hilden, Tyskland), etter produsentens anvisninger. Analysen av data ble utført med RT² Profiler PCR Array Data Analysis (Qiagen).
Western blotting
Cellene ble skylt med lysebuffer (125 mmol /L Tris-HCl, 750 mmol /l NaCl, 1% volum /volum NP40, 10% volum /volum glyserol, 50 mmol /l MgCl
2, 5 mmol /l EDTA, 25 mmol /l NaF, 1 mmol /l NAVO
4 , 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /ml pepstatin, 10 ug /ml aprotinin, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid; pH 7,5), ultralydbehandlet og sentrifugert ved 13 000 xg i 10 min ved 4 ° C. 20 ug av proteiner fra cellelysater ble underkastet Western blotting og probet med følgende antistoffer mot: IDO1 (kanin polyklonale, fortynnet 1: 2000, AG-25A-0029, Adipogen, San Diego, CA); IDO2 (mus monoklonalt, fortynnet 1: 500, SAB3701447, Sigma Chemical Co.); TDO (kanin polyklonalt, fortynnet 1: 1000, SAB2102400, Sigma Chemical Co.); fosfor (Tyr 1022/1023) -JAK1 (kanin polyklonale, fortynnet 1: 1000, # 3331, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); JAK1 (kanin polyklonale, fortynnet 1: 1000, # 3344, Cell Signaling Technology); fosfor (Tyr701) -STAT1 (kanin polyklonale, fortynnet 1: 1000, # 9167, Cell Signaling Technology); STAT1 (mus monoklonalt, fortynnet 1: 1000, klone 15H3, Thermo Scientific, Rockford, IL); fosfor (Tyr705) -STAT3 (kanin polyklonale, fortynnet 1: 2000, # 9145, Cell Signaling Technology); STAT3 (mus monoklonalt, fortynnet 1: 5000, klone 9D8, Thermo Scientific); Pgp (kanin polyklonale, fortynnet 1: 250, sc-8313, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP1 (mus monoklonalt, fortynnet 1: 100, ab32574, Abcam, Cambridge, UK); MRP2 (mus monoklonalt, fortynnet 1: 100, ab3373, Abcam); MRP3 (geitepolyklonalt, fortynnet 1: 250, sc-5776, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP4 (geitepolyklonalt, fortynnet 1: 250, ab77184, Abcam); MRP5 (geitepolyklonalt, fortynnet 1: 250, sc-5781, Santa Cruz Biotechnology Inc.); BCRP (kanin polyklonale, fortynnet 1: 500, sc-25882, Santa Cruz Biotechnology Inc.); β-tubulin (mus monoklonalt, fortynnet 1: 500, SC-5274, Santa Cruz Biotechnology Inc.), etterfulgt av en sekundær peroksidase-konjugert antistoff (Bio-Rad Laboratories). Proteinene ble påvist ved forsterket kjemiluminescens (Bio-Rad Laboratories). Atom ekstrakter ble utarbeidet med Nuclear Extract Kit (Active Motif, Rixensart, Belgia); 10 ug av nukleære proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE og analysert med følgende antistoffer mot: PIAS1 (kanin monoklonalt, fortynnet 1: 1000, ab109388, Abcam); PIAS3 (kanin polyklonale, fortynnet 1: 1000, ab22856, Abcam); fosfor (Tyr701) -STAT1; STAT1; fosfor (Tyr705) -STAT3; STAT3; TATA-bindende protein (TBP, kanin polyklonale, fortynnet 1.500, sc-273, Santa Cruz Biotechnology Inc.). For å utelukke cytosolic forurensning av atom ekstrakter, vi bekreftet at β-tubulin var umulig å oppdage i atomprøver (ikke vist).
In Vivo
tumorvekst
1 x 10
5 human A549, A549 /dx, HT29, HT29 /dx-celler i 20 pl kulturmedium, blandet med 20 ul av Cultrex BME (Trevigen, Gaithersburg, MD), ble implantert subkutant i høyre flanke på 6-8 uker gamle kvinnelige naken BALB /c mus, holdt under 12 timer lys /mørke syklus, med mat og drikke som tilbys
ad libitum
. 1 x 10
5 murine kjemoresistent JC-celler, syngen med BALB /c-mus [26], ble implantert i immunkompetente dyr. I en andre forsøkssett, når A549 /dx, HT29 /dx og JC tumorer nådde volum på 100 mm
3, ble dyrene randomisert i to grupper: «Kontroll» gruppe (behandlet med 100 ul saltoppløsning
per os
, 5 dager /uke i tre uker); «Brassinin» gruppe (behandlet med 400 mg /kg av IDO1 hemmer 5-Br-brassinin
per os
, 5 dager /uke i tre uker), som beskrevet i [27]. I begge forsøkssett ble tumorveksten måles daglig ved målepunktet, og ble beregnet i henhold til ligning (LxB
2) /2, hvor L = tumorlengde og W = tumorbredde. Musene ble avlivet på dag 21. De eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av bioetikkomité ( «Comitato Etico di Ateneo») ved Universitetet i Torino, Italia.
Cytokinproduksjon
produksjon av cytokiner ble målt i cellekultur supernatanten ved hjelp av følgende kommersielle kits: human interleukin-6 (IL-6) Duo Set Development Kit (R resultatene ble uttrykt som prosent av levedyktige celler versus ubehandlede celler.
Nitritt måling
Nivået av nitritt, et stabilt derivat av NO, i cellekultursupernatanter ble målt ved hjelp av Griess-metoden [ ,,,0],29]. Resultatene ble uttrykt som nmol nitritt /mg celleproteiner.
Jern måling
100 x 10
6-celler ble vasket med PBS, frittliggende med trypsin /EDTA, sentrifugert ved 12 000 xg i 2 min, resuspendert i 1 ml PBS og ultralydbehandlet. Den intracellulære jern ble målt ved hjelp av en AAnalyst 200 Atomic Absorption Spectrometer (PerkinElmer). Resultatene ble uttrykt som ng jern /ml cellesuspensjon.
Statistisk analyse
Alle data i tekst og tall er gitt som gjennomsnitt ± SD. Resultatene ble analysert ved hjelp av en en-veis analyse av varians (ANOVA). En
p
0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Kynurenine syntesen er høyere i multilegemiddelresistente celler og er modulert av 5-Br-brassinin, metyl-DL-tryptofan og interferon-γ
Vi først analysert kynurenine produksjon i et panel av kjemosensitiv og multilegemiddelresistente kreftceller, som viser et annet mønster av ABC transportører (S1 Fig): HT29, A549, K562, Met5A var menneskelig kjemosensitiv celler; HT29 /dx, A549 /dx og K562 /dx var modeller av ervervet MDR; HMM og JC var menneskelig og murine konstitutivt kjemoresistent celler, henholdsvis. De multilegemiddelresistente cellelinjer hadde høyere nivåer kynurenine-detektert ved hjelp av HPLC (S2) og fig spektrofotometrisk analyse (Fig 1 A) -og økte nivåer av IDO1 protein sammenlignet med kjemosensitiv celler (figur 1B). IDO2 ble oppdaget ved variable beløp i kjemosensitiv og kjemoresistent celler; TDO ble påvist i alle cellelinjene som ble analysert, unntatt i A549 /dx-celler (figur 1B).
IDO1
mRNA resulterte også høyere i multidrug resistente celler enn i kjemosensitiv seg (fig 1c).
Menneskelige kjemosensitiv lungekreft A549 celler og kjemoresistent A549 /dx celler, menneske kjemosensitiv tykktarmskreft HT29 celler og kjemoresistent HT29 /dx celler, menneske kjemosensitiv kronisk myelogen leukemi K562 celler og kjemoresistent K562 /dx celler, menneske kjemosensitiv mesothelial Met5A celler og menneske kjemoresistent ondartede mesothelioma HMM celler, ble murine kjemoresistent melke JC celler utsatt for følgende undersøkelser. A. kynurenine nivåene i cellekultursupernatanter ble målt spektrofotometrisk. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 4). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001: kjemoresistent-celler (MDR-positive) som funksjon av de tilsvarende kjemosensitiv (MDR-negative) celler. B. Western blot analyse av IDO1, IDO2 og TDO uttrykk. Den β-tubulin-ekspresjon ble anvendt som kontroll av lik protein lasting. Figuren er representative for 3 forsøk med lignende resultater. C. Ekspresjonsnivået av
IDO1
mRNA ble målt ved QRT-PCR. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 4). * P 0,01, ** p 0.002. Kjemoresistent celler (MDR-positive) versus de tilsvarende kjemosensitiv (MDR-negative) celler
Menneskelig kjemoresistent A549 /DX celler og HT29 /dx cellene vokste raskere enn kjemosensitiv A549 og HT29 celler implantert i nakne BALB /c-mus (figur 2A). De murine kjemoresistent JC celler hadde høyest vekst (figur 2A). Interessant, IDO1 inhibitoren 5-Br-brassinin [27] ikke å hemme veksten av A549 /dx og HT29 /dx tumorer implantert i immunodefekte mus, men det betydelig redusert progresjon av JC svulster, implantert i immunkompetente dyr (Fig 2B ). Disse dataene antyder at IDO aktivitet kan støtte den raske veksten av kjemoresistent svulster hos immunkompetente verter.
A. 1 x 10
5 human A549, A549 /dx, HT29, HT29 /dx-celler ble implantert subkutant i 6-8 uker gamle hunnkjønns nakne BALB /c-mus, 1 x 10
5 murine JC-celler ble implantert i immunkompetente BALB /c-mus. Tumorvekst ble overvåket daglig av skyvelære måling. Data er presentert som middelverdier ± SD av 10 mus /gruppe. * P 0,02, ** p 0.005, *** p 0,001: A549 /dx eller HT29 /dx celler versus A549 eller HT29 celler, på tilsvarende tidspunkt. B. Dyr peiling A549 /DX, HT29 /DX, JC-tumor ble randomisert i to grupper når svulster nådd volum på 100 mm
3: «Control» gruppe (behandlet med 100 mL av saltvann
per os
, 5 dager /uke i tre uker, Ctrl); «Brassinin» gruppe (behandlet med 400 mg /kg av IDO1 hemmer 5-Br-brassinin
per os
, 5 dager /uke i tre uker, BRA). Tumorvekst ble overvåket daglig av skyvelære måling. Data er presentert som middelverdier ± SD fra 6 mus /gruppe. ** P 0,005. BRA-gruppen versus CTRL-gruppe, på tilsvarende tidspunkt
Vi neste undersøkt årsaken til forskjellen i kynurenine produksjon mellom kjemosensitiv og kjemoresistent celler. For enkelhets skyld har vi fokusert på A549 og A549 /dx-celler som modeller for kjemosensitiv og multilegemiddelresistente celler, henholdsvis, da det i disse cellene forskjellen i kynurenine nivåer og IDO1 ekspresjon var meget tydelig. Siden HPLC-målingen og den spektrofotometriske analyse ga superimposable resultater for A549 og A549 /dx-celler (S2 figur og figur 1A), vi brukte sistnevnte analysen som en pålitelig metode for å evaluere forskjellene i kynurenine nivåene mellom disse to cellelinjene.
Vi analyserte om kynurenine nivåene varieres på en annen måte i respons til kjemoterapeutiske medikamenter til som multilegemiddelresistente celler er insensitive-, til IDO1 aktivatorer, så som NO, jern og IFN-γ, og til IDO1 inhibitorer, så som 5- Br-brassinin og metyl-DL-tryptofan [30].
doxorubicin, cisplatin, gemcitabin og mitoksantron, anvendt ved konsentrasjoner som er redusert til 50% levedyktigheten av følsomme A549-celler uten å påvirke levedyktigheten av resistent A549 /dx celler (Fig S3A), endret ikke de kynurenine nivåer, som forble signifikant høyere i A549 /dx-celler enn i A549-celler, enten i fravær eller i nærvær av kjemoterapeutiske midler (S3b Fig). Tilsvarende NO givere S-nitrosoglutathione og S-nitroso-N-acetylpenicillamine, som økte nivåene av NO i kjemosensitiv og multilegemiddelresistente celler (S4A Fig), endret ikke kynurenine syntese sammenlignet med ubehandlede celler i begge cellepopulasjoner (S4B fig). Å modulere den intracellulære jern, behandlet vi A549 og A549 /dx-celler med cellepermeable iron-frigjørende forbindelse FeNTA og med den jernbindende desferroxamine, som henholdsvis økes og reduseres mengden av cellen jern (S5a figur): igjen, hverken FeNTA heller desferroxamine varierte kynurenine produksjon (S5b figur).
IFN-γ økte kynurenine nivåene i både kjemosensitiv og multilegemiddelresistente celler, men omfanget av slik økning var større i A549 /dx celler (figur 3A). Effekten av IFN-γ, som ble redusert med inhibitorene metyl-DL-tryptofan og 5-Br-brassinin (figur 3A), ble forbundet med økningen av
IDO1
mRNA (figur 3B) og protein ( fig 3C). Også i dette tilfelle økningen utløst av IFN-γ var mer uttalt i A549 /dx enn i A549-celler (figur 3B og 3C), noe som tyder på at den multilegemiddelresistente celler var mer mottakelig for cytokinet. Lignende effekter av IFN-γ, metyl-DL-tryptofan og 5-Br-brassinin ble påvist i HT29 og HT29 /dx-celler, K562 og K562 /dx-celler, Met5A og HMM-celler (data ikke vist).
A549 og A549 /dx-celler ble inkubert i 48 timer i friskt medium (CTRL), eller i medium inneholdende det IDO1 inhibitorer metyl-DL-tryptofan (1 mmol /l, mTrp) eller 5-Br-brassinin (100 umol /L, BRA), og den IDO1 indus IFN-γ (100 ng /ml IFNy), alene eller i kombinasjon. A. kynurenine nivåene i cellekultursupernatanter ble målt spektrofotometrisk. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 4). * P 0.01: kontra A549 CTRL celler; °°° p 0.001: kontra A549 /dx CTRL;
◊◊ p 0,005: IFN-γ + mTrp-behandlede, IFN-y + BRA-behandlede A549 og A549 /dx-celler versus de tilsvarende celler behandlet med IFN-γ alene. B. Ekspresjonsnivået av
IDO1
mRNA ble målt ved QRT-PCR. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 4). *** P 0.001: kontra A549 CTRL celler; °°° p 0.001: kontra A549 /dx CTRL celler. C. Western blot-analyse av IDO1 uttrykk. Den β-tubulin-ekspresjon ble anvendt som kontroll av lik protein lasting. Figuren er representativ for 3 eksperimenter med lignende resultater.
multilegemiddelresistente celler har en høyere aktivitet av JAK /STAT signalering og økt autokrint produksjon av Stat3 avhengig cytokiner enn kjemosensitiv celler
Siden IFN-γ aktiverer JAK /STAT1-3 signaliserer [31], og STAT1 og STAT3 er potente transkripsjonsaktivatorer av
IDO1
genet i de fleste pattedyrceller [32, 33], analyserte vi uttrykket nivåer av nøkkelgener av JAK /STAT banen ved en high-throughput PCR-screening. Som vist i tabell S1 og figur 4A, ble A549 /dx-celler ikke skiller seg fra A549-celler for ekspresjon av
JAK1-2-3
, men oppviste høyere ekspresjon av
STAT1
og
STAT3
. I tråd med denne trenden, klassisk STAT1- og STAT3-målgener (
A2M
,
BCL2L1
,
CDKN1A
,
CRP
,
CXCL9
,
FAS
,
IRF1
,
JUNB
,
MMP3
,
MYC
,
NOS2
,
SOCS1
) var oppregulert i multilegemiddelresistente celler (S1 Table). I Western blotting validering, fant vi tilsvarende nivåer av total JAK1 protein i helcellelysater av A549 og A549 /dx-celler, men høyere nivåer av det aktive tyrosin-fosforylert JAK1 i multilegemiddelresistente celler (figur 4B). Mengden av STAT1, fosfor (Tyr701) -STAT1, STAT3, fosfor (Tyr705) -STAT3 var også høyere i kjemoresistent celler (figur 4B). MRNA nivået av STAT1 inhibitor PIAS1 var ikke signifikant forskjellig mellom A549 og A549 /dx celler (S1 Tabell og figur 4A), og nivået på PIAS1 protein var den samme i de kjernefysiske ekstrakter (fig 4C). I motsetning til den kjernefysiske mengden av STAT3 inhibitor PIAS3 var lavere i A549 /DX-celler (figur 4C); Dette var i tråd med den nedre delen av
PIAS3
mRNA (S2 tabell). Interessant, STAT1, fosfor (Tyr701) -STAT1, STAT3, fosfor (Tyr705) -STAT3 var alle mer translocated inn i kjernen av multiresistente celler (fig 4C). Dette mønsteret, noe som sannsynligvis skyldes høyere beløp og fosforylering av STAT1 /STAT3 og til lavere uttrykk for PIAS3, ledet oss til hypoteser som STAT1- og særlig STAT3-målgener bør være oppregulert i for multiresistent celler.
Å. CDNA fra A549 og A549 /DX-celler ble analysert ved hjelp av en PCR-matrise som er spesifikt for JAK /STAT signalering, som rapportert i henhold Materialer og metoder. Folden regulering av de 83 gener ble analysert, uttrykt i logaritmisk skala, er representert i en kolorimetrisk skala. Figuren er gjennomsnittet av 4 forsøk. B. Cellene ble lysert og utsatt for Western blot-analyse for fosfo (Tyr 1022/1023) -JAK1, JAK1, fosfo (Tyr701) -STAT1, STAT1, fosfo (Tyr705) -STAT3, STAT3. * P * P * P * P * P 0,05, ** p * P * P
