Abstract
Bakgrunn
Genomisk sletting ved tumor suppressor loci er et felles genetisk avvik i humane kreftformer. Studien forsøkte å utforske kandidat tumorsuppressorgener på kromosom 4q25-q28.2 og å avgrense nye prognostiske biomarkører assosiert med tykk- og endetarmskreft (CRC).
Metoder
Sletting kartlegging av kromosom 4q25-q28 0,2 ble gjennomført i 114 sporadisk CRC ved tap av heterozygositet studie med 11 mikro markører. En roman kandidat tumor suppressor genet, nemlig
NDST4
, ble identifisert på 4q26. Genuttrykk av
NDST4
ble undersøkt i 52 par av primære CRC vev ved kvantitativ revers transkripsjon-polymerase chain reaction. Allel tap av
NDST4
genet ble videre bestemt i 174 kolorektal karsinom ved tap av heterozygositet analyse, og deretter ble vurdert for klinisk relevans.
Resultater
En minimal sletting regionen var avgrenset mellom D4S2297 og D4S2303 loci på 4q26, der
NDST4
var den eneste gen som markert hadde blitt nedregulert i CRC svulster. Ved laser capture mikrodisseksjon,
NDST4
RNA uttrykk ble vist i colonic epitelceller, men var umulig å oppdage i tumorceller. I alt 30 (57,7%) av 52 kolorektale karsinomer viste en dramatisk reduksjon i
NDST4
genekspresjon sammenlignet med matchet normale slimhinner. Den genetiske tap av
NDST4
var signifikant assosiert med avansert patologisk stadium (
P =
0,039) og dårligere total overlevelse for pasienter (
P =
0,036).
Konklusjoner
NDST4
genet er en roman kandidat tumorsuppressorgen i menneskelig kreft, og tapet av sin funksjon kan være involvert i CRC progresjon. I tillegg er tap av heterozygositet assay, som ble etablert for å bestemme den alleliske tap av
NDST4
genet, kan være et kostnadseffektivt verktøy for å tilveiebringe et nyttig biomarkør av ugunstig prognose i CRC.
Citation: Tzeng ST, Tsai MH, Chen CL, Lee JX, Jao TM, Yu SL, et al. (2013)
NDST4
er en roman Kandidat tumorsuppressorgen på kromosom 4q26 og sin genetiske Loss Spår alvorlig prognose i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (6): e67040. doi: 10,1371 /journal.pone.0067040
Redaktør: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA
mottatt: 24 januar 2013; Godkjent: 13 mai 2013; Publisert: 25 juni 2013
Copyright: © 2013 Tzeng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet med tilskudd fra National Science Council Executive Yuan (NSC99-2320-B-002-020-My3), kardinal Tien Hospital (CTH-93-1-2A01), og National Health Research Institutes (NHRI-EX101 -10136BI), Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste årsakene til kreft dødsfall over hele verden, og de fleste svulster oppstår sporadisk ved en kombinasjon av diskrete mutasjoner og kromosom endringer [1] – [3]. Til tross for aggressive operasjoner supplert med ulike adjuvant terapi og en økt forståelse av de genetiske mekanismene bak denne lidelsen, har det vært lite forbedring i overlevelse av pasienter med invasiv CRC [4], [5]. Selv histopatologiske funksjoner og iscenesettelse på tidspunktet for presentasjonen er fortsatt de viktigste prognostiske indikatorer, mange pasienter med lignende patologiske funksjoner vise betydelig forskjellige kliniske resultater [6]. Derfor kan bruk av sensitive genetisk analyse være nyttig for å identifisere høyrisikopasienter og deretter for stratifying utformingen av adjuvant behandling. I tillegg kan en bedre forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i kolorektal tumorigenesis gi nye biomarkører for potensielle mål for terapeutisk intervensjon og prognostiske indikatorer for kirurgisk inngrep [7].
kromosom ustabilitet er den vanligste genetiske avvik i sporadisk CRC [8], [9]. Betydelige studier har vist at allele tap på flere regioner av kromosom 4 er forbundet med fasen progresjon, tumormetastase, og kortere overlevelse i mange humane kreftformer, noe som indikerer tilstedeværelsen av en eller flere tumor-suppressor-gen (TSG) loci [10] – [15 ]. Imidlertid har noen TSGs på kromosom 4 involvert i CRC patogenesen blitt identifisert. Vi har nylig utført sletting kartlegging av kromosom 4 ved tap av heterozygositet (LOH) studie, og identifisert D4S402 locus på 4q27 som viste den høyeste allel tapsfrekvens på 32,5% i 106 sporadisk CRC (våre upubliserte data). I denne studien ønsket vi å utforske CRC-forbundet TSGs i den tilstøtende regionen D4S402. To tilnærminger ble gjennomført: (1) fin sletting kartlegging på kromosom 4q25-q28.2 å avgrense regionen husing TSGs, og (2) analyser av endringer (genekspresjon og allel sletting) av søker TSGs i primær CRC svulster. I tillegg ble den genetiske tap av kandidaten TSG vurderes for klinisk relevans.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
Totalt 174 pasienter med sporadisk CRC, som gjennomgikk kirurgi på Cardinal Tien Hospital, Taiwan, ble rekruttert mellom august 1997 og desember 2008 (tabell 1). Følg-ups ble gjennomført frem til april 2010. Alle 174 pasienter ble operert for histologisk verifisert kolorektal adenokarsinom uten preoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling. Både paret svulsten og tilstøtende normal slimhinne prøver ble samlet inn fra hver pasient under operasjonen. I tillegg ble adenomatøse polypp vev samlet inn fra 57 pasienter som gjennomgikk colonoscopic polypectomy. Alle vevsprøver ble umiddelbart frosset etter reseksjon og lagret i flytende nitrogen inntil nukleinsyre-ekstraksjon. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke, og undersøkelsen ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og godkjent av Institutional Review Board of Cardinal Tien Hospital, Taiwan.
LOH Analyse
DNA ble ekstrahert fra frosne vev ved hjelp av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). For fine sletting kartlegging av kromosom 4q25-q28.2 (12,9 cm), LOH studie med et panel av 11 mikrosatellitter ble gjennomført i 114 par av CRC vev DNA (figur 1A og tabell 2). For ytterligere å bestemme allel tap av
NDST4
genet, LOH studie med to mikro markører, MS5850 (UniSTS: 536617) og D4S1580, ble gjennomført i 174 CRC tilfeller (figur 1A og tabell 2). I hvert primer-par ble forover primer syntetisert med 6-FAM, VIC eller NED fluorescerende markør, avhengig av amplikonet størrelse. PCR-amplifikasjon ble utført i et endelig volum på 6 pl ved anvendelse av 20 ng av DNA, 500 nM av hver av de respektive primere, 200 pM av hver dNTP, og 0,3 enheter av AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems). PCR ble utført under følgende betingelser sykkel: en pre-PCR-innkuberingstrinn ved 95 ° C i 15 min; etterfulgt av 35 sykluser av 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 45 s, og 72 ° C i 30 s; og en endelig forlengelse på 72 ° C i 10 min. De forsterkede fragmenter ble separert i 6% denaturerende polyakrylamidgeler på en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), som beskrevet i produsentens instruksjoner. Normal og kreft DNA-par ble sammenlignet for endringer i antall allel topper og topphøyde for hver markør ved hjelp Genescan Analysis programvare (Applied Biosystems). Den LOH Indeksen for hver normal og tumor-DNA paret ble beregnet som tidligere beskrevet [16]. I korthet, ble forholdet mellom de allel topphøyder beregnet for hver tumorprøve dividert med topphøyden allelet forholdet mellom den normale samsvarende kontroll. En LOH indeks over ≤0.67 eller ≥1.5, som representerer minst 33% reduksjon av en svulst allel, var indikasjon på allel tap.
A. Mikro markører brukes for tap av heterozygositet studien. Tre gener er lokalisert i minimal sletting region avgrenset av D4S2297 og D4S2303. Svarte striper indikerer
UGT8 Hotell og
NDST4
gener.
MIR-577 plakater (
MIR577
) ligger i intron av
UGT8
. B. Analyse av
UGT8 Hotell og
NDST4
mRNA i tumorer (T) og matchet normal slimhinne (N) av CRC vev ved RT-PCR.
β-ACTIN
ble anvendt som en intern kontroll RNA. C. Analyse av
MIR-577
uttrykk i CRC vev ved QRT-PCR. Uttrykket nivåer av tumorer ble normalisert til de av tilsvarende normale slimhinner. Data representerer gjennomsnitt ± SD.
RNA Utvinning
Total RNA ble ekstrahert fra de frosne vev og 10 CRC cellelinjer (COLO205, HCC2998, HCT116, HCT15, HT29 , KM12 og SW620 fra US National Cancer Institute, LoVo, SW48 og SW480 fra Bioresource Collection og Research Center, Taiwan) ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrasjonen og renheten av RNA ble bestemt med et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific), og RNA integritet ble bekreftet ved agarosegelelektroforese.
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
ti tilfeldig valgte CRC tilfeller ble brukt i en pilotstudie for genekspresjon. Komplementært DNA (cDNA) ble reverstranskribert fra total-RNA (2 pg /20 pl reaksjon) ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Revers transkripsjon ble utført under følgende betingelser: 25 ° C i 10 min, 37 ° C i 2 timer, og 85 ° C i 5 minutter. Den resulterende cDNA ble fortynnet 5 ganger med dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlet H
2o. Genspesifikke primer sett utformet som strekker seg over eksoner var som følger:
NDST4
fremover 5′-TCTGGGAGTTACACCTCG-3 «og 5′-revers TCTTGAGAGGCTTAGTTCTTG-3»;
UGT8
fremover 5′-TTATATTATTCGTCACAATGG-3 «og 5′-revers AAAACTAAGGTCTGACACAGT-3»;
β-ACTIN
frem 5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3 «og omvendt 5′-TCATCTTCTCGCGGTTGG -3». PCR-amplifikasjon ble utført i et endelig volum på 25 pl ved bruk av 2,5 mL av fortynnet cDNA, 1 pM av hver av de respektive primere, 250 pM av hver dNTP, og 1 enhet av Super-Therm Gold-DNA-polymerase (Bertec Enterprise). PCR ble utført under følgende betingelser sykkel: en pre-PCR-innkuberingstrinn ved 95 ° C i 10 min; 36 (
NDST4 Hotell og
UGT8
) eller 28 (
β-ACTIN
) sykluser på 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 45 s og 72 ° C i 45 s; etterfulgt av en endelig forlengelse på 72 ° C i 3 minutter. De forsterkede fragmenter ble analysert ved agarosegelelektroforese.
Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
For kvantifisering av
NDST4
RNA uttrykk i 52 par av primær CRC vev og 57 polypper, en TaqMan Gene Expression analyse (Hs00224024_m1, Applied Biosystems) ble brukt med en referanse gen
TBP plakater (TATA-boks-bindende protein, Hs00920497_m1) som en kontroll for RNA kvalitet og kvantitet. CDNA ble syntetisert som nevnt i RT-PCR-delen. Kvantitative PCR data ble tatt til fange av en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System og analysert av ABI PRISM 7000 SDS programvare (Applied Biosystems). Reaksjonsblandingen inkluderte 5 ul av den fortynnede cDNA, 1 pl av en hydrolyse sonde blanding, 10 ul av TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), med tillegg av DEPC-behandlet H
2o til et endelig volum på 20 ul . Reaksjonene ble utført i duplikat i henhold til de følgende betingelser: sykkel et inkuberingstrinn ved 50 ° C i 2 minutter; og en enzymaktiveringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Uttrykket nivåer av
NDST4
i tumorer, normale slimhinner og polypper ble normalisert til den enkelte referansen genet,
TBP
. Svulsten-til-matchet-normale slimhinner forhold på
NDST4
RNA uttrykk ble beregnet ved hjelp av komparative Ct metode, 2
-ΔΔCt [17]. De relative uttrykk nivåer av
NDST4
i CRC cellelinjer ble sammenlignet med et bety uttrykk for 52 normal slimhinner, som ble justert til 1.
mikroRNA 577 Expression Analysis
for kvantifisering av
mikroRNA 577 plakater (
MIR-577
) uttrykk i 10 par tilfeldig utvalgte primær CRC vev, små RNA ble ekstrahert ved hjelp av Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA maler ble fremstilt fra total RNA ved hjelp av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), som benytter stilk-løkke reverse primere. I korte trekk, ble 10 ng av total-RNA blandet med 0,8 ul av stem-loop RT-primere, 0,15 pl 100 mM dNTP, 1,5 pl 10 x RT-buffer, 0,2 ul RNase-inhibitor (20 U /ul), og 1.0 ul MultiScribe revers transkriptase (50 U /mL). Den blanding (sluttvolum 15 pl) ble inkubert ved 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 minutter, og deretter holdt ved 4 ° C. Etter RT, cDNA-produktene, i tillegg til de TaqMan primere og prober, ble blandet med de andre PCR-reagenser i PCR Universal Master Mix Kit (Applied Biosystems), og qPCR ble utført i triplikat i den ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. PCR-betingelsene er inkludert første inkubering ved 50 ° C i 2 min og denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Primere som brukes for
MIR-577 plakater (delenummer 4408995) og
RNU6B plakater (RNA, U6 liten atom 2, 4.373.381) ble kjøpt fra Applied Biosystems. Som en endogen kontroll,
RNU6B
ble forsterket i parallell, og Ct verdien av
MIR-577
ble normalisert til at av
RNU6B
. Uttrykket nivåer av svulstene ble sammenlignet med matchet normal slimhinner, som ble justert til 1.
Laser Capture mikrodisseksjon
For å bekrefte
NDST4
RNA uttrykk i spesifikke celletyper primære CRC vev, kolorektal karsinom og epitelceller fra den samsvar normal slimhinne ble samlet inn fra to CRC tilfeller, så vel som slimhinne-assosiert lymfoid-celler ble samlet fra den tredje normalt vev delen. Frysesnitt ble fiksert og farget med HistoGene LCM Frozen § Farging Kit (Arcturus Engineering). Celler ble isolert ved å utføre laser capture mikrodisseksjon med AutoPix Automated Laser Capture mikrodisseksjon System (Arcturus Engineering). Etter mikrodisseksjon, ble cellene fanget på lokket umiddelbart inkubert med en utvinning buffer, og total RNA ble isolert ved hjelp av PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus Engineering), i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistical Analysis
Sammenhengen mellom allel tap av
NDST4
genet og clinicopathological variabler ble analysert av Student
t
-test (for alder), lineær-by-lineær sammenheng chi-kvadrat test ( for Dukes «etapper) eller Pearson chi-kvadrat test (for andre kategoriske variabler). En to-sidig
P
verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Survival tid ble ansett intervallet mellom kirurgi og datoen for siste oppfølging eller død av sykdom (total overlevelse, OS), eller dato for siste oppfølging eller tilbakefall (sykdomsfri overlevelse, DFS). Overlevelseskurver, anslått med Kaplan-Meier-metoden, ble sammenlignet med log-rank test. Alle statistiske analyser ble utført med IBM SPSS® programvare, versjon 17.0.
Resultater
NDST4 Gene er en kandidat tumorsuppressorgen på kromosom 4q26
Totalt 114 par primære CRC vev ble anvendt for å bestemme den minimale region delesjon på kromosom 4q25-q28.2 ved hjelp av LOH analyse. Femti (43,9%) av de 114 svulster utstilt LOH på ett eller flere mikro markører. Hyppig LOH, definert som forekommer hos mer enn 30% av informative svulster, ble observert i fire loci, inkludert D4S2297, D4S2303, D4S402, og D4S2394. Følgelig en minimal sletting region med en genetisk lengde på 1,4 Mb ble så avgrenset mellom D4S2297 og D4S2303, som var involvert i 80,0% (40/50) av svulstene med LOH. Resultatene viser en høy frekvens av kromosom 4q26 tap i kolorektal karsinom, og avslører en antatt TSG locus involvert i CRC utvikling.
Ved å søke i National Center for Biotechnology Information (NCBI) database, bare to proteinkodende gener,
UGT8 Hotell og
NDST4
, samt en mikroRNA,
MIR-577
, ble vist å være plassert i det definerte minimal sletting regionen. Uttrykket av
UGT8
,
NDST4
, og
MIR-577
ble vist i 10 par tilfeldig utvalgte primær CRC vev ved RT-PCR eller QRT-PCR (figur 1B og 1C). Uttrykket nivåer av
UGT8 Hotell og
MIR-577
i de testede svulstene var forenlig med deres tilstøtende normale slimhinner. Resultatene viste at
NDST4
genekspresjon ble tydeligvis gått ned i seks av 10 svulster. Resultatene tyder på at
NDST4
kan være en roman TSG ligger i regionen 4q26, som ofte slettet i CRC.
NDST4 Gene er uttrykt i Normal Kolon slimhinner og polypper, men er nedregulert i tykktarms Kreftsvulster
Colorectal carcinoma stammer fra colonic slimhinnen gjennom oppbygging av genetiske endringer. Som en kandidat av CRC-assosiert TSG,
NDST4
bør uttrykkes i kolonepitelet. Derfor laser fange mikrodisseksjon ble utført for å isolere forskjellige celletyper i vevssnittene, inkludert epiteliale og lymfoide celler fra normal slimhinne, så vel som de tumorceller av CRC, og deretter
NDST4
ekspresjon ble bestemt ved QRT -PCR (figur 2). Resultatene viste at
NDST4
mRNA var detekterbar i epitel-celler fra begge tilfeller med normal mucosa, men hverken i deres sammenkoblede tumorceller eller i lymfoidceller, selv etter 45 sykluser med PCR-amplifikasjon. For å fastslå nedregulering av
NDST4
uttrykk i CRC, vi videre analysert 52 par av primære vev. I henhold til Knudson to-rammet hypotese, kan en funksjonell kopi av et TSG bidra til delvis genekspresjon [18]. Derfor er en 0,25 gangers nedgang ble definert som terskelen betydelig nedregulering. Totalt 30 svulster (57,7%) viste en tydelig nedgang i
NDST4
uttrykk, sammenlignet med sine matchet normal slimhinne (figur 3A). I tillegg
NDST4
genekspresjon ble også bestemt i 57 adenomatøse polypper. I motsetning til CRC tumorer, hvori
NDST4
ekspresjon ble redusert i det vesentlige de adenomer viste et tilsvarende nivå av ekspresjon som normal slimhinne (figur 3B). I tillegg studerte alle 10 CRC-cellelinjer uttrykte ekstremt lave eller ikke målbare nivåer av
NDST4
mRNA (Figur 3C). En dramatisk reduksjon av
NDST4
uttrykk i CRC opprett at
NDST4
er en roman kandidat TSG, og at tapet av sin funksjon kan spille en rolle i kolorektal tumorigenesis.
EN. Laser fangst mikrodisseksjon forskjellige celletyper fra CRC svulsten og matchet normal slimhinne seksjoner. Representative bilder av HistoGene-fargede slides før og etter laser capture mikrodisseksjon vises. B. og C. QRT-PCR analyse av
NDST4 Hotell og
TBP
uttrykk i de fangede celler.
TBP
ble anvendt som en intern kontroll RNA. Rn, normalisert reporter signal.
A. Sammenligning av
NDST4
uttrykk mellom svulst og matchet normal slimhinne i 52 par med CRC vev ved QRT-PCR. Den relative uttrykket (svulst /normal) i hvert tilfelle er angitt med en kolonne. B. nedregulering av
NDST4
uttrykk i CRC svulster, men ikke i adenomatøse polypper.
NDST4
uttrykk i forhold til en intern kontroll,
TBP
, illustreres via boksplott analyse. Værhårene betegne intervallet mellom 5
th og 95
th persentiler. En vesentlig forskjell mellom gruppene ble testet med Student
t
-test (paret, tumor
vs
slimhinnen,. Uparet, slimhinner
vs
polypp.). N.S., ikke signifikant. C. nedregulering av
NDST4
uttrykk i alt 10 mennesker CRC cellelinjer testet. De relative ekspresjonsnivåer av CRC-celler ble sammenlignet med den midlere ekspresjon av 52 normal colonic slimhinner. Data representerer gjennomsnitt ± SD.
Allelic Tap av NDST4 Gene er signifikant assosiert med Advanced Patologisk Stage and Poor Overlevelse i CRC
For å bestemme nøyaktig den genetiske sletting av
NDST4
i CRC, den WebSat, web programvare for mikro markør utvikling, ble brukt til å identifisere korte tandem repetisjoner innenfor
NDST4
genet [19]. En ny markør, MS5850, som ble utviklet i denne studien, og D4S1580 ble anvendt for LOH analyse i 174 par av primære CRC vev (Figur 1a). Sammenhenger mellom genetisk endring og clinicopathological egenskaper er listet i tabell 1. Totalt 53 (30,5%) av de 174 svulstene var positive for allel tap av
NDST4
genet. Den genetiske avvik ble økt betydelig i svulster med høyere patologiske stadier (T3 og T4) (
P =
0,039). I tillegg, selv om det ikke er statistisk signifikant, ble en økende tendens observert i progresjonen av fjern metastase og Dukes fase (
P =
0,075 og 0,083, respektivt). Likevel, den genetiske tap var ikke forbundet med andre clinicopathological funksjoner.
Korrelasjonen av allel tap av
NDST4
gen med pasientens overlevelse ble ytterligere evaluert. OS analyse ble utført på 174 pasienter, hvorav OS rente var 67,8% (n = 118) med en gjennomsnittlig overlevelse på 94 måneder. Ved å bruke Kaplan-Meier overlevelseskurve analyse, den alleliske tap av
NDST4
genet spådd en verre OS (
P
= 0,036) (figur 4). Femti-tre pasienter med denne genetiske avvik hadde et OS på 60,4% og en gjennomsnittlig overlevelse på 74 måneder, mens de øvrige 121 pasientene hadde en OS på 71,1% og en gjennomsnittlig overlevelse på 100 måneder. I tillegg ble det utført DFS analyse på 118 pasienter med Dukes trinn B og C, hvorav den DFS hastigheten var 73,7% (n = 87) med en midlere DFS 104 måneder. Likevel, den genetiske funksjonen ble ikke identifisert som en signifikant prediktor for DFS for pasientgruppen med Dukes «etapper B og C.
Kaplan-Meier analyse ble utført for å sammenligne pasienter med allel tap av
NDST4
gen til de andre (ikke allel tap). Genetisk tap av
NDST4
viser signifikant sammenheng med dårligere overlevelse (log-rank test).
Diskusjoner
I denne studien identifiserte vi
NDST4
genet som en roman kandidat TSG på kromosom 4q26, som er en vanlig sletting region i CRC. I motsetning til normal tarmslimhinnen med
NDST4
uttrykk, et flertall av CRC svulster og cellelinjer viste en dramatisk reduksjon i genuttrykk. I tillegg har vi utviklet en LOH analysen med to mikro markører, og avslørte at den genetiske tap av
NDST4
var signifikant assosiert med avansert patologisk stadium og dårlig overlevelse, støtter tumor suppressor funksjon NDST4 i CRC.
til tross for enkelte molekylære stier som ligger til grunn belyst tykktarms tumorigenesis kan ulike genetiske endringer resultere i en bestemt fenotype som er korrelert med ulike kreft atferd og pasientutfall [20]. Derfor er identifisering av nye molekylære markører nødvendig å forbedre strategier for målrettet terapi og skreddersydd behandling av pasienten. I studien, belyst vi en minimal sletting region på 1,4 Mb på kromosom 4q26 i sporadisk CRC, i samsvar med den forrige rapporten at hyppigheten av alleliske sletting ved 4q26 ble økt i kolorektal karsinom sammenlignet med adenomer [11]. Selv om mange tidligere studier har antydet kandidat TSG loci på kromosom 4 [14], [15], her identifiserte vi, for første gang,
NDST4
genet som en roman kandidat TSG på 4q26. I tillegg, fordi LOH på polymorfe loci tillater uttrykksfullhet tap-av-funksjon sletting i TSGs, har denne genetiske studien diagnostisk og prognostisk betydning [21]. Den LOH analysen etablert i studien kan være et kostnadseffektivt verktøy for å gi en nyttig biomarkør for negative prognose i CRC.
NDST4 er ett medlem av N-deacetylase /N-sulfotransferaseaktivitet (heparan glukosaminylgruppe) (NDST ) familien, som er ansvarlig for heparansulfat (HS) biosyntesen på et kjerneprotein for å danne heparinsulfat-proteoglykaner (HSPGs) [22], [23]. HSPGs overalt befinner seg på celleoverflaten, inne i cellen, og i den ekstracellulære matrisen [24]. HS kjeder av HSPGs samvirke med et bredt spekter av protein ligander så som vekstfaktor familier, og dermed bidra til vevet struktur og funksjon i løpet av utvikling og homeostase voksen [25], [26]. Viktigere er innholdet og fordelingen av HSPGs forandres under tumorgenese, som har vært implisert i positive eller negative sider ved tumorprogresjon. For eksempel, HSPGs funksjon som ko-reseptorer for vekstfaktorer og deres reseptor-tyrosin-kinaser å stabilsignaleringskompleksene i løpet av tumor proliferasjon og invasjon [27]. I kontrast, HSPGs fremme celle-celle og celle-ekstracellulær matrix interaksjoner og bygge hemmende barrierer for tumorinvasjon. Derfor er redusert nivå av HSPGs korrelerer med tumorprogresjon [28], [29]. I denne studien, den genetiske tap av
NDST4
var signifikant assosiert med avansert patologisk stadium, som refererer til den lokale svulsten dybden av invasjonen i CRC, noe som tyder på at tap av funksjon av
NDST4
gen kan svekke modifikasjon av HS-kjeder av spesifikke HSPGs, fører til mer invasive tumorceller gjennom remodellering av interaksjonen av celle adhesjon reseptorer og ligander.
Fire forskjellige isoformer av NDSTs er identifisert i virveldyr. I motsetning til den universelle genuttrykk av
NDST1 Hotell og
NDST2
,
NDST3 Hotell og
NDST4
transkripsjoner er hovedsakelig uttrykt under embryonal utvikling [30], [31 ]. Men uttrykket mønstre
NDSTs
har aldri blitt illustrert i den humane kolon. Ved hjelp av RT-PCR, fant vi at transkripsjoner av fire
NDSTs
var lett synlig i normal colonic slimhinnen, mens bare
NDST4
uttrykk ble nedregulert i de fleste av de testede CRC svulster (data ikke vist ). I henhold til den forutsagte struktur av sulfotransferase domenet av NDSTs, kan de fire forskjellige isoformer oppvise varierende substratspesifisiteter [30]. Sheng
et al.
Nylig vist at NDST1 utførte modifikasjon i en svært organisert måte å kontrollere N-sulfate domener i HS, noe som tyder på at igangsatt og fulgt N-sulfate kan bli utført ved bruk av forskjellige NDSTs [32]. Med relativt dårlig deacetyleringen aktiviteten NDST4 på umodifiserte HS-kjeder, kanskje NDST4 foretrekker de med en første modifikasjon av andre isoformer [30]. I tillegg NDSTs spille en sentral rolle i HS biosyntesen fordi NDSTs er de første deltakerne i sekvensiell modifikasjon prosessen [33]. Det er interessant fordi NDST4 er den eneste isoform som hadde blitt markert nedregulert i de testede CRC-tumorer (våre upubliserte data), de tre andre NDST isoformer ikke synes å kompensere for mangel NDST4 i en kolon-spesifikk tilstand. HS kjeder av HSPGs i kolon mukosa kan ha unike mønstre modifikasjon mediert, i det minste delvis, ved NDST4 aktivitet. Endrede HSPGs som følge av tap av funksjon av NDST4 kan variere celler og vev ordning, og deretter fremme CRC patogenesen. Imidlertid kan endringer i ekspresjonen av HS-biosyntetiske enzymer være forholdsvis forskjellig i en kreft-type-spesifikk måte [34]. Fernandez-Vega
et al.
Rapportert ganske nylig at
NDST4
transkripsjon økt i 50% av 23 infiltrere duktale adenokarsinomer studert, da det var fraværende i normale bryst vev [35]. Til sammen blir videre studier garantert å få innsikt i hvilken rolle NDST4 i tumor utvikling og progresjon av kreft hos mennesker.
I konklusjonen, ved opptegning en minimal sletting region på kromosom 4q26, er den første til å identifisere denne studien
NDST4
genet som en roman kandidat TSG i CRC. I tillegg er den genetiske tap av
NDST4
kan tjene som en biomarkør for uønskede prognosen for pasienter med CRC. Den LOH assay utviklet for å bestemme tapet av alleliske
NDST4
gen i studien kan bli brukt som en molekylær diagnostisk verktøy for risiko lagdelingen i de enkelte terapeutiske intervensjoner.
