Abstract
Proteinkinase CK2 ofte forhøyet i en rekke humane krefttyper. The Hedgehog (Hh) signalveien har vært innblandet i stamcelle vedlikehold, og det avvikende aktivering har vært indikert i flere typer kreft, inkludert lungekreft. I denne studien, viser vi at CK2 er positivt involvert i Hh /Gli signalisering i lungekreft cellelinjer A549 og H1299. Først fant vi en sammenheng mellom CK2α og Gli1 mRNA nivåer i 100 primær lungekreft vev. Nedregulering av Gli1 uttrykk og transkripsjonen aktivitet ble demonstrert etter stanse av CK2α i lungekreftceller. I tillegg CK2α siRNA nedregulert uttrykket av Hh målgener. Videre er to små-molekyl-inhibitorer CK2α førte til en doseavhengig inhibering av Gli1 ekspresjon og transkripsjonen aktivitet i lungekreftceller. Omvendt, tvunget over-uttrykk for CK2α resulterte i en økning både i Gli1 uttrykk og transkripsjonen aktivitet i A549 celler. Til slutt, inhibering av Hh /Gli ved CK2α siRNA førte til en reduksjon av en kreft stamcelle-lignende side populasjon som viser høyere ABCG2 ekspresjonsnivå. Dermed rapporterer vi at hemming av CK2α nedregulerer Hh /Gli signalering og deretter reduserer stilk-lignende side befolkningen i humane lungekreftceller
Citation. Zhang S, Wang Y, Mao JH, Hsieh D, Kim IJ, Hu LM, et al. (2012) Hemming av CK2α nedregulerer Hedgehog /Gli Signa fører til en reduksjon av en stamme-Like Side Befolkning i Human lungekreft celler. PLoS ONE 7 (6): e38996. doi: 10,1371 /journal.pone.0038996
Redaktør: Alan P. Fields, Mayo Clinic College of Medicine, USA
mottatt: 16 januar 2012; Godkjent: 14 mai 2012; Publisert: 29 juni 2012
Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend R01 CA140654-01A1 (LY) og Science Foundation i Guangdong-provinsen, PRC Natural 2009 (9451008901003072). Vi er også takknemlige for støtte fra Kazan, McClain, Abrams, Fernandez, Lyons, Greenwood, Harley Oberman Foundation, Inc; Estate av Robert Griffiths; Jeffrey og Karen Peterson Family Foundation; Paul og Michelle Zygielbaum; Estate av Norman Mancini; og Barbara Isackson Lung Cancer Research Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Protein kinase CK2 (tidligere kjent som kasein kinase II) er en svært konservert serin /treonin kinase som fosforylerer mer enn 300 proteiner [1]. CK2 har en heterotetrameric struktur bestående av to katalytiske subenheter (42-kDa-a- eller 38-kDa α «) og den regulatoriske subenhet (28 kDa-β), som danner konfigurasjoner α2β2, αα’β2 og α’2β2. CK2 er et multifunksjonelt protein kinase [2], som har vist seg å være involvert i nesten alle aspekter av celle proliferasjon og overlevelse [3], [4], [5]. Nivået av CK2α ekspresjon er strengt regulert i normale celler [6], og økt CK2α nivå og aktivitet har vært konsekvent observert i en rekke humane cancere [7], [8], [9]. For eksempel er det høye nivå og /eller nukleær lokalisering av CK2α er en markør for dårlig prognose for pasienter med akutt myelogen leukemi, kronisk lymfatisk leukemi, prostatacancer og magecancer [10], [11], [12], [13] . CK2 påvirker også flere cellesignalveier, inkludert PI3K, NFkB og Wnt [6], [14], [15].
The Hedgehog (Hh) familie av utskilte proteiner, som består av Sonic, indisk og Desert Hedgehog, spiller viktige roller i pattedyr utvikling og i stamcelle vedlikehold [16], [17]. Aktivering av Hh reaksjonsveien er initiert på celleoverflaten av Hh ligand-binding til dets reseptor Patched (PTC), noe som resulterer i derepresjon av effektoren protein, et G-protein-koblet reseptor, glattes (Smo) [18]. Til syvende og sist, aktiverer Smo Gli familien av transkripsjonsfaktorer og målgener. Det er tre Gli proteiner i mennesker: Gli1 tjener til å aktivere Hh målgener, Gli2 fungerer både som aktivator og undertrykker av Hh målgener, mens Gli3 fungerer som en repressor av Hh målgener [19], [20]. Deregulering av Hh /Gli signale innblandet som en initierende eller opprettholde faktor i utviklingen av ulike kreftformer, inkludert basalcellekreft, Medulloblastomas, leukemi, lunge, mage, lunge, eggstokkreft, brystkreft og prostatakreft [19], [21]. For eksempel er det Gli1 genet amplifisert i human glioma og aktivert i basalcellekreft [22], [23], [24]. Transgen overekspresjon av Gli1 i mus fører til utvikling av basalcellekreft [25]. Gli1 aktivering er påvist i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler og vev [26].
Direkte bevis for at Hh /Gli signale spiller en viktig rolle i kreft stamceller (cscs) stammer fra en serie av studier i forskjellige tumortyper [21]. Nylige studier har indikert at ATP-bindende kassett transportør medlem to av G-protein familien (ABCG2) er et direkte mål transkripsjonen av Hh /Gli signalering [27]. En undergruppe, kalt side populasjon (SP) med høyere ABCG2 ekspresjonsnivået i humane kreftceller, inkludert lungekreft A549-celler, viste serie av cscs enes egenskaper [28], [29], [30]. Flere linjer med nyere bevis tyder på at pinnsvin signale regulerer stilk-lignende side befolkningen i humane lungekreftceller. For eksempel, siden populasjon av lungekreft cellelinjen H460 fortrinnsvis uttrykker ABCG2 og SMO, en kritisk mediator av pinnsvin signalering. Cyclopamine, en naturlig pinnsvin reaksjonsvei-inhibitor, inhiberer i stor grad cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon av H460-cellelinjen [30]. Cyclopamine også redusert siden befolkningen i humane kreftceller [31]. Videre Hedgehog pathway inhibitor GDC-0449, godkjent en FDA legemiddel for behandling av metastatisk basalcellekarsinom, effektivt redusert cellevekst i humane lungekreftcellelinjer. Effekten er mediert av hemming av stilk-lignende side befolkningen [32].
Til dags dato er det ingen bevis for forholdet mellom CK2 og Hh /Gli signalering i pattedyrceller. For å undersøke om CK2 er involvert i Hh sti i humane lungekreftceller, testet vi aktiviteten til Gli1 etter CK2 hemming.
Resultater
CK2α og Gli1 Gener er aktivert og korrelert i Menneskelig NSCLC
Både CK2α og Gli1 gener har vist seg å være overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert lungekreft [26], [33]. Gjennom bruk av semi-kvantitativ RT-PCR (figur 1A) og Western blot-analyse (figur 1B), undersøkte vi CK2α genet og proteinet i åtte av NSCLC-cellelinjer. Dataene viste at CK2α blir uttrykt i alle disse kreftceller. Blant dem, i det minste fem cellelinjer (A549, A427, H1299, H358 og H838) viste relativt høyere ekspresjon av CK2α både på mRNA og proteinnivå. CK2α ekspresjon ble tidligere vist å være minimal i normale lungeceller [34]. Gli1 gen- og proteinuttrykk ble grovt påvist i alle cellelinjene unntatt H358. Interessant, det syntes å være en sammenheng mellom uttrykk for CK2α og Gli1 i disse cellelinjene. Vi utførte real-time RT-PCR av CK2α og Gli1 i 100 primær NSCLC prøvene. En mild sammenheng mellom CK2α og Gli1 mRNA nivåer ble funnet i disse vev (r = 0,37,
P
0,05) (figur 1C). For etterfølgende eksperimentelle studier ble valgt på grunn A549 status for kreft-relaterte baner i A549-celler har blitt godt karakterisert. H1299 ble også valgt på grunn av sin relativt høyere uttrykk av CK2α og Gli1 gener.
(A) RT-PCR. (B) Western blot. Den CK2α genet ble aktivert i de åtte NSCLC-cellelinjer som ble undersøkt (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 og H322), og den Gli1-genet ble uttrykt i alle cellelinjer med unntak av H358. (C) lineær korrelasjon kurve av CK2α og Gli1 mRNA-nivåer. En mild korrelasjon (r = 0,37,
P
0,05) ble vist i lineær korrelasjonsanalyse av SPSS. Primær NCSCL vev fra pasienter som gjennomgår reseksjon ble samlet opp ved tidspunktet for kirurgi og umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen. Disse vevsprøver ble holdt ved -170 ° C i flytende nitrogen fryser før bruk.
CK2α knockdown hemmer Hh /Gli Signa Gjennom å nedregulere Gli1
For å undersøke om CK2 undertrykkelse ha en effekt på Hh vei, forstummet vi CK2 uttrykk ved hjelp CK2 subenheten spesifikke sirnas. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble effektiviteten av RNA-interferens overvåket ved semi-kvantitativ RT-PCR (figur S1). De tilsvarende mRNA-nivåene av de tre underenheter redusert, og den knockdown av α og α «ble bekreftet ved ko-transfeksjon av deres siRNAs. Ekspresjonen av de angitte Hh pathway komponenter ble også bestemt (figur S2). Totalt sett er RT-PCR resultater viste at PTC1 og Gli1 mRNA nivåer i A549 og H1299 celler var konsekvent nedregulert etter CK2α eller CK2β knockdown, mens ble observert minimale endringer i andre Hh sti komponenter. Ved real-time RT-PCR, bekreftet vi at ved å stanse all CK2α betydelig hemmet Gli1 uttrykk både i A549 og H1299 cellelinjer (figur 2A). Stanse av CK2β også resulterte i en betydelig reduksjon av Gli1 i begge cellelinjer (figur 2A). I tillegg Gli1 ekspresjon var minimal i den normale lunge kontroll. På proteinnivå, stanse av CK2α førte til en 71% (A549) og en 73% (H1299) nedgang på Gli1, mens tie av CK2β førte til en 67% (A549) og en 35% (H1299) nedgang på Gli1. Behandling med CK2α»-måls siRNA produserte ingen åpenbar forskjell, snarere enn reduksjon av Gli1 i A549, og ga en 60% økning i H1299, både på mRNA og proteinnivåer (figur 2B). Videre utførte vi immunofluorescens farging med et monoklonalt anti-Gli1-antistoff, ettersom nukleære lokaliserings av Gli1 gjenspeiler aktiviteten av Hh veien [35]. Nuclear Gli1 proteiner ble dramatisk redusert i nærvær av CK2α siRNA (figur 2C). Videre stanse av CK2α resulterte i en signifikant reduksjon (45% ved 25 uM og 60% ved 50 uM, P 0,01) i den Gli1-økte Gli reporter-aktivitet, sammenlignet med det ikke-målsøkende siRNA (kontroll) (figur 2D) .
(A) Kvantitativ Gli1 mRNA nivåer etter behandling med CK2 subenhet-spesifikke siRNA oppdaget av real-time RT-PCR. Stanse av CK2α betydelig redusert Gli1 mRNA-nivåer i både A549 og H1299 cellelinjer (med 50% og 45%, henholdsvis). Stanse av CK2β også resulterte i en betydelig reduksjon av Gli1 i begge cellelinjer. Minimal Gli1 mRNA-nivået ble bemerket i den normale lunge (NL). *
P
0,05, **
P
0,01, t-test. (B) Protein nivåer oppdaget av Western blot. Stanse av CK2α førte til 71% (A549) og 73% (H1299) reduksjon av Gli1, mens tie av CK2β førte til 67% (A549) og 35% (H1299) nedgang på Gli1. Behandling av CK2α»-måls siRNA produserte ingen åpenbar forskjell, snarere enn reduksjon av Gli1 i A549, og ga en 60% økning i H1299, både på mRNA og proteinnivå. (C) Lokalisering av Gli1 oppdaget av grønn fluorescens. Den Gli1 protein lokaliserer hovedsakelig i kjernefysiske avdeling av cellene, og viser en stor reduksjon etter CK2α knockdown. Scale bar = 30 mikrometer. (D) Den transkripsjonelle aktivitet av Hh bane i A549 detektert ved Gli reporter-analyse. Stanse av CK2α resulterte i en signifikant reduksjon (mer enn 40% ved 25 uM og 60% ved 50 uM) av den transkripsjonelle aktivitet, sammenlignet med kontrollen siRNA. *
P
0,05, **
P
0,01, t-test. (E) Kvantitativ Gli1 mRNA nivåer etter behandling med TBB og CX-4945 ved real-time RT-PCR. Gli1 ekspresjon i A549 redusert merkbart ved de doseringsnivåer på 1 uM CX-4945 og 10 uM TBB, signifikant ved 10 uM CX-4945 og 50 uM TBB (50% og 60%). *
P
0,05, **
P
0,01, t-test. (F) Protein nivåer som detekteres ved Western blot. På proteinnivået, disse reduksjonene steg til 76% (10 pM CX-4945) og 89% (50 uM TBB) i A549, og 81% (10 pM CX-4945) og 93% (50 uM TBB) i H1299, respektivt . (G) Protein ekspresjon av Gli1 detekteres av grønn fluorescens. Cellene ble behandler med 30 uM TBB eller kjøretøy DMSO, immunoflorescence farging med anti-Gli1 mAb på dyrkede celler viste en utpreget lavere grønn florescence i nærvær av 30 uM TBB. (Scale bar = 30 mikrometer). (H) Den transkripsjonelle aktivitet av Hh bane i A549 detektert ved Gli reporter-analyse. En 50% reduksjon ble detektert i nærvær av 10 pM CX-4945 eller 10 uM TBB. *
P
0,05, **
P
. 0,01, t-test
Small-Molecule CK2α hemmere nedregulerer Gli1 Expression og transkripsjonen aktivitet
for ytterligere å validere den rollen CK2α i Hh vei, brukte vi to små-molekyl CK2α hemmere: TBB (4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole), en kjent hemmer av CK2α [36], og CX-4945 (5- (3-klorfenylamino) benzo [c] [2], [6] naphthyridine-8-karboksylsyre), en første i sin klasse, selektiv, muntlig hemmer av CK2α under etterforskning i fase 1 kliniske forsøk [37].
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TBB (10, 30, 50 uM) eller CX-4945 (1, 3, 10 uM), eller med kjøretøyet for DMSO 48 timer. Behandlinger med TBB eller CX-4945 førte til en doseavhengig reduksjon av Gli1 mRNA og proteinnivåene både i A549 og H1299 cellelinjer (figur 2E, 2F og S3). De kvantitative mRNA-nivåer ble påvist ved sanntids RT-PCR. Som vist i figur 2E, Gli1 ekspresjon i A549 redusert merkbart ved de doseringsnivåer på 1 uM CX-4945 og 10 uM TBB, og betydelig redusert ved 10 uM CX-4945 og 50 uM TBB (50% og 60%,
P
0,05). På proteinnivået, disse reduksjonene nådde til 76% (10 pM CX-4945) og 89% (50 uM TBB) i A549, og 81% (10 pM CX-4945) og 93% (50 uM TBB) i H1299, henholdsvis (figur 2F). Immunofluorescens farging med et monoklonalt anti-Gli1 antistoff på dyrkede celler viste en dramatisk lavere grønn florescence i nærvær av 30 uM TBB (figur 2G). Vi demonstrerte at de små molekylene hemmet Gli rapportøraktivitet i A549-cellelinjen, hvor en signifikant reduksjon (55%, P 0,01) ble påvist i nærvær av 10 pM CX-4945 eller 10 uM TBB (figur 2 H). Disse resultatene er i samsvar med hva vi fant i siRNA studier.
Tvungen Over-Expression av CK2α Gene fører til Gli1 oppregulering og Transkripsjonell Activation
For å bekrefte om CK2 genet positivt påvirker transkripsjonen aktivitet av Gli1, transfiserte vi A549-celler med enten pcDNA3.1-CK2α eller kontroll pcDNA3.1-lacZ-plasmid. Som forventet, ble det over-ekspresjon av CK2α tilskrives aktiveringen av Gli1 i A549-cellelinjen. Den over-ekspresjon av CK2α ble påvist ved RT-PCR (figur 3A) og Western blot (Figur 3B). Den forhøyede Gli1 mRNA-nivået ble også påvist ved RT-PCR (figur 3A). Ved Western blot analyse viste vi forhøyet Gli1 proteinnivå (2,35 folder) i celler med ektopisk over-uttrykk for CK2α (figur 3B). Videre reporteren analysen viste også en signifikant ( 2 folder, P 0,01) økning av Gli1 transkripsjonen aktivitet (figur 3C). Disse funnene tyder på at overekspresjon av CK2α-genet fører til en oppregulering av Gli1 genekspresjon og transkripsjonen aktivitet.
(A) A549-celler ble transfektert med enten en pcDNA3.1-CK2α eller kontroll pcDNA3. 1-lacZ plasmid vektorer, over-uttrykt CK2α og oppregulert Gli1was oppdaget av real-time RT-PCR. *
P
0,05, **
P
0,01, t-test. (B) Western blot. Proteininnholdet av Gli1 ble oppregulert i dette systemet med en dobling. (C) dessuten reporteren analysen viste også en betydelig (mer enn to ganger) økning av Gli1 transkripsjonen aktivitet. *
P
0,05, **
P
0,01, t-test. (D) I et protein degradering analyse, viste A549 cellene reduseres Gli1 protein på tidspunktet for 2 timer etter behandling med CK2α siRNA.
ved å stanse all CK2α Fremmer Gli1 Nedbrytning
Vi videre gjennomført en tid-retters eksperiment for å undersøke Gli1 pause. A549-celler ble transfektert med CK2α eller kontroll siRNA, og Gli1 proteinnivåer ble påvist ved tidspunktene for 0, 1 og 2 timer etter behandling med proteinet inhibitor, cykloheksimid. I CK2α knockdown gruppe, Gli1 proteinnivået reduseres til minimumet på 2 timer etter behandling med cykloheksimid (når sammenlignet med det ved 0 time), noe som antydet at halveringstiden for Gli1 etter CK2α siRNA knockdown er mindre enn 2 timer. Disse data indikerer at CK2α knockdown resulterer i nedbrytning av Gli1 (figur 3D). Dette i sin tur tyder på at CK2α regulerer Gli1 aktivitet ved å hindre sin degradering.
CK2α knockdown nedregulerer Hh Nedstrøms Gener og Reduserer SP profil via ABCG2 i A549
Hh styrer velig spredning av flere celletyper gjennom ulike molekylære mekanismer og retter seg mot nedstrømsgener, inkludert Ptc, cyclin familiemedlemmer, og selv-induksjon av Gli1 [20], [38]. Vi analyserte mRNA nivåer av fire (Gli1, PTC1, PTC2 og Cyclin E1) av disse genene ved hjelp av real-time RT-PCR (figur 4A). Uttrykket av de fire Hh målgener sunket betraktelig (
P
0,05). Etter CK2α knockdown, noe som antyder en deprimert transkripsjonen aktivitet av Hh veien
(A) Hh nedstrømsgener uttrykk oppdaget av sanntids RT-PCR. MRNA nivå av de fire Hh målgener (Gli1, PTC1, PTC2 og Cyclin E1) ble redusert betydelig etter CK2α knockdown. *
P
0,05, **
P
0,01, t-test. (B) Uttrykket av ABCG2 redusert i CK2α-forstummet A549 celler. (C) Andelen av SP-celler falt fra 26,8% til 15,4%, og fra 9,4% til 3,4% i nærvær av 50 uM verapamil, respektivt. Celler ble merket med Hoechst 33342 og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. (Høyre) Resultater når cellene ble behandlet med 50 uM verapamil under merkingsprosedyren. SP er skissert og vist som en prosentandel av den totale cellepopulasjon. Disse eksperimentene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. (D) Søylediagram for (C). (E) Modell av Hh /Gli1 signale regulert av CK2. Detaljer er beskrevet i teksten.
Det har blitt demonstrert at ABCG2 er den primære bidragsyter til SP-fenotypen i flere kreftcellelinjer inkludert A549 [28]. SP-fenotypen er blitt karakterisert i en serie av studier av kreft stamceller avledet fra prostata, bryst, tykktarm, gliom, blære, ovarie, livmorhals, og melanom [29], [39], [40], [41], [ ,,,0],42]. Nyere studier viser at ABCG2 er et direkte mål på reaksjonsveien Hh som er involvert i stamcelle vedlikehold [27]. Vi først undersøkt ABCG2 uttrykk etter CK2α knockdown og fant at ABCG2 nivået sunket dramatisk i CK2α-forstummet A549 celler (figur 4B). I samsvar med andre funn, relativt høyere andel (26,8%) av A549 celler ble klassifisert som SP celler i vår studie. I nærvær av verapamil, en ABC-transportør-inhibitor, andelen av SP-celler falt til 9,4%. Etter behandling med CK2α siRNA, andelen falt til 15,4% (uten verapamil) eller 3,4% (med verapamil) (Figur 4C og 4D). Vi deretter sortert SP og ikke-SP-celler i dette systemet. I videre analyse av semi-kvantitativ RT-PCR, de sorterte SP cellene viste høyere uttrykk av ABCG2 enn gjorde ikke-SP celler, men ingen forskjell på ABCG2 uttrykk i SP eller ikke-SP celler ble vist mellom CK2α siRNA og kontroll (figur S4). I korte trekk, viste vi en 42,5% reduksjon av SP andel etter CK2α knockdown.
Diskusjoner
Våre resultater tyder på at CK2 er en positiv regulator i Hh /Gli1 signalering i menneskelig lungekreft. Dette støttes av flere linjer av bevis. Først av alt ble det korrelasjonen av CK2 og Gli1 uttrykk lagt merke til i flere lungekreft cellelinjer. Vi viste videre en lineær sammenheng i 100 primær NSCLC vev. For det andre, inhibering av CK2α ved siRNA eller små-molekylære inhibitorer resulterte i nedregulering av ekspresjon og Gli1 transkripsjonen aktivitet. For det tredje, tvunget over-uttrykk for CK2α resulterte i økt Gli1 uttrykk og transkripsjonen aktivitet. Endelig CK2α knockdown førte til en reduksjon av side befolkningen via nedregulere ABCG2, et direkte mål om Hh /Gli signale [27].
Til dags dato er det ingen bevis for sammenhengen mellom CK2 og Hh /Gli signalisering i humane kreftceller, selv om CK2 ble foreslått som en positiv regulator av Hh signaltransduksjonsbane og to serinresidua i Smo ble fosforylert av CK2 i
Drosophila product: [43]. Men denne mekanismen på Smo fosforylering av CK2 ikke ut til å gjelde for mennesker, som disse to SMO rester ikke er bevart i menneskets Smo når linje med Clustal W [44] (figur S5). Videre har flere studier antydet at pattedyr Smo og
Drosophila
Smo er regulert av fundamentalt forskjellige mekanismer [45], [46]. Nylig, Chen et al. vist at pattedyr Smo aktiveres gjennom multi-site fosforylering av CK1α og GRK2 og foreslått to-trinns mekanisme for Smo fosforylering i pattedyrceller [47].
For å undersøke potensialet mekanisme som CK2 positivt regulerer menneskets Gli1 uttrykk og transkripsjonen aktivitet, utførte vi protein degradering analysen av Gli1 etter behandling med CK2α siRNA. Våre resultater viste at CK2 stanse reduserer halveringstiden for human Gil1 protein i A549-celler. Videre har både CK2 siRNA og lavmolekylære inhibitorer nedregulert Gli1-økte transkripsjonen aktivitet. Videre tvunget over-uttrykk for CK2α resulterte i Gli1 transkripsjonen aktivitet. I tillegg fant vi to spådd CK2 fosforyleringsseter i menneskelig Gli1 ved hjelp Scansite med middels stringens [48] (figur S6). Våre data antyder at CK2 kan regulere Gli1 i humane kreftceller på en lignende måte med den i
Drosophila
. For eksempel, Jia et al. rapportert at CK2 direkte fosforylerer Ci i
Drosophila
, og deretter hindrer dens ubiquitinering og degradering [43]. På den annen side er det blitt foreslått at glykogen syntase kinase-3-beta negativt regulerer Gli1 transkripsjonsfaktorer som samvirker med andre kinaser så som PKA og CK1s i lungecancer A549-celler [49]. Således er to trinn sannsynligvis involvert i positiv regulering av Gli1 ved CK2. I det første trinnet, inhibering av CK2 fremmer Gli1 nedbrytning, etterfulgt av redusert akkumulering av Gli1 i kjernerommet. I det andre trinnet, som nøkkelen transkripsjonsfaktor av Hh vei, deretter undertrykker den reduserte Gli1 proteinet transkripsjon av Hh målgener. Dette i sin tur danner en tilbakekoblingssløyfe for å ytterligere redusere ekspresjonsnivået av Gli1, som opptrer som et målgen for veivalget (figur 4E). Selv om mekanismen for CK2 regulering i kreft hos mennesker er fortsatt i stor grad ukjent, det er dokumentert at CK2 er viktig for Wnt /beta-catenin signal [50], [51]. For eksempel ble det innblandet som CK2 kan binde og fosforylere β-catenin og fremmer sin degradering [52]. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at CK2α kan stabil av menneskelig Gli1 protein gjennom direkte fosforylering. Videre studier er nødvendig for å belyse de nøyaktige mekanismer.
Hh pathway transkripsjonsfaktor Gli1 regulerer ekspresjonen av ABC-transportør-proteinet ABCG2 ved direkte binding til ABCG2 promotoren [27], er ABCG2 en molekyl determinant av SP fenotype og uttrykt i høyere nivåer i SP-celler, sammenlignet med ikke-SP-celler [28], [31]. De SP cellene velig beriket med kreft stamceller, som de viser stamcelleegenskaper (høyt tumurigenic og chemo-resistent). Tidligere studier har påvist SP fenotype med høyere ABCG2 uttrykk nivå og innblandet ABCG2 som CSC markør i lungekreft A549 celler [28]. For eksempel, SP-celler i A549 viste mer tumurigenic potensiell [29]. I vår studie, målet genet av Hh /Gli signaliserer ABCG2 var nedregulert etter CK2α hemming, der ABCG2-drevet side befolkning ble redusert senere. Dermed rapporterer vi at CK2 deltar i cscs vedlikehold ved å regulere Hh /Gli signalering.
Hh sti kan spille viktige roller i vedlikehold av cscs, men de druggable målene i Hh veien er svært begrenset. CK2 tilveiebringe et ytterligere mål for inhibering av Hh /Gli signalering. CK2-inhibitorer er ikke blitt omfattende utviklet som terapeutiske midler, delvis på grunn av at det ATP-bindende lomme av CK2 er ikke så druggable som noen andre proteinkinaser [50], [53], [54]. Hittil har bare en liten-molekyl CK2 inhibitor er inngått til kliniske studier som en potensiell kreft narkotika. CX-4945, en meget selektiv CK2 lite molekyl hemmer, er en lovende første i klassen oral terapeutisk middel rettet mot flere kreft hos mennesker. CX-4945 viser en gunstig sikkerhetsprofil i fase I kliniske studier [55]. I tillegg har CIGB-300 (et syntetisk peptid-basert medikament rettet mot CK2 phosphoaceptor domene) viste seg å være trygg og klinisk nytte i fase I livmorhalskreft studier [56].
I sammendraget, vi rapportere at CK2 er en positiv regulator i Hh /Gli signalveien, og inhibering av CK2α nedregulerer Hh /Gli signalering i humane lungekreftceller. Gitt den voksende betydningen av Hh /Gli signalisering i startfasen og progresjon, våre funn gir et viktig bevis for de potensielle fordelene ved CK2 hemmere.
Materialer og metoder
Cell Kultur og lite molekyl Treatment
Menneskelig NSCLC cellelinjer (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 og H322) ble oppnådd fra American Type Culture samlinger (Manassas, VA). Celler ble rutinemessig opprettholdt i RPMI-1640 supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, penicillin (100 ug /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Alle celler ble rutinemessig dyrket ved 37 ° C i en fuktig inkubator med 5% CO2. Behandling med CX-4945 (Synkinase, San Diego, CA) og TBB (Sigma, St. Louis, MO) oppløst i DMSO ble administrert i flere doser (1, 3 og 10 uM av CX4945, 10, 30, 50 uM av TBB ). Cellene ble dyrket i medium i 48 timer etter behandling.
siRNA og plasmid DNA Transfeksjon
CK2α, CK2α «og CK2β-spesifikke sirnas (ON-TARGET
pluss
SMARTpool) og kontroll RNA ble kjøpt fra Thermo Scientific (Waltham, MA). I korte trekk ble celler sådd ut i en 6-brønns plate som 10
5-celler /brønn en dag før transfeksjon, med et mål på 30-50% konfluens på tidspunktet for transfeksjon. -Celler ble transfektert med 50 nmol /L av siRNA ved hjelp av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. Tilstrekkelig hemming av siRNA-mediert knockdown ble bekreftet ved RT-PCR. De pcDNA3.1-CK2α eller kontroll pcDNA3.1-lacZ plasmidvektorer ble deretter transfektert inn i A549 celler (0,5 ug /ml i 24-brønns plate) ved bruk av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Cellene ble høstet for RT-PCR og Western blot eller brukes i rapportør assays ved 48 timer etter transfeksjon.
RNA-isolering, cDNA-syntese og Semi-kvantitativ RT-PCR
Isolering av RNA utføres ved hjelp RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Menneskelig Lung Total RNA ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). Fem hundre ng av total RNA ble omgjort til 20 mL cDNA ved hjelp iScript cDNA Synthesis Kits (Bio-Rad, Hercules, CA,) i henhold til produsentens anbefalinger. PCR bånd ble visualisert under UV-lys og fotografert.
Real-Time RT-PCR
Totalt 2 ul av revers transkripsjon reaksjonen ble brukt som mal for sporing i sanntid av Gli1 uttrykk bruker TaqMan Technology på et Applied Biosystems 7000 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster City, California). Genuttrykk ble kvantifisert for de testede gener (Gli1, PTC1, PTC2 og Cyclin E1) og endogene kontroll genet b-glucuronidase (GUSB) ved hjelp av primer og probe sekvenser kommersielt (Applied Biosystems).
Western Blot analyse og immunfluorescens Farging
Hele protein ble hentet av M-PER pattedyr protein Extraction Reagent (Thermo) fra cellelinjer lagt med fosfatase Inhibitor Cocktail Set II (Calbiochem, San Diego, California) og Komplett proteasehemmer Cocktails (Roche, Lewes , UK) i henhold til produserer «protokoller. Proteinene ble separert på 4-15% gradient SDS-polyakryl-amidgeler og overført til Immobilon-P-membran (Millipore, Bellerica, MA). Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: anti-CK2α (Millipore), anti-Gli1 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-ABCG2 (Millipore), og anti-GAPDH (Trevigen, Gaithersburg, MD). Etter å ha blitt inkubert med passende sekundære antistoffer, ble antigen-antistoffkompleksene påvist ved hjelp av en ECL-blotting analysesystem (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Immunfluorescens farging ble utført. Eksamen ble gjort ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi (LSM510, Carl Zeiss, Oakland, CA). Digitale bilder av enkelt confocal skiver ble utarbeidet ved hjelp av Adobe Photoshop 6.0.
protein degradering analysen
CK2α- og kontroll siRNA-transtected A549 celler ble eksponert for 50 ug /ml cycloheximide og høstet på tidspunkter av 0 og 6 timer. Totalt cellulære proteiner ble hentet ut og ble analysert ved western blot analyse.
luciferaserapportørplasmid Analyser
For å måle Gli-mediert Hh transkripsjonen aktivitet, luciferase reporter konstruerer, 8 × villtype Gli bindingssete (8 × Gli
wt Luc) eller 8 × mutant Gli bindingssetet (8 × Gli
mut Luc) plasmider [57] og en menneskelig Gli1 uttrykk vektor (pcDNA3.1-Gli1) ble ko-transfektert inn i A549 celler i 24-brønns plate.
Renilla
luciferase PRL-TK plasmid (Promega, Madison, WI), hvis uttrykket er drevet av housekeeping tymidinkinase genet promoter, var kotransfektert å normalisere for transfeksjon effektivitet. Alle transfeksjon eksperimenter ble utført ved hjelp av Lipofectamine2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 24 timer ble cellene lysert og luciferase-analyser ble utført som tidligere beskrevet [58]. Resultatene uttrykkes som gangers induksjon, som er forholdet av luciferase-aktivitet indusert i Gli-transfekterte celler i forhold til basal luciferase-aktivitet i transfekterte kontroll A549-celler. Alle forsøk ble utført in triplo;
