Abstract
Kreft-relatert og primær lymfødem (LE) er forbundet med produksjonen av fettvev (AT). Ingenting er kjent, imidlertid, om lipid-baserte molekyler som omfatter LE AT. Vi analyserte derfor lipid molekyler i lipoaspirates og serum hentet fra LE pasienter, og sammenlignet dem med lipoaspirates fra kosmetisk kirurgi pasienter og friske kontrollgruppen serum. LE pasientserum analyse viste at triglyserider, HDL og LDL-kolesterol og lipid transportmolekyler forble innenfor normalområdet, med ingen endringer i de enkelte fettsyrer. Den lipidomiske Analysen identifiserte også 275 lipid-baserte molekyler, inkludert triacylglycerides, diacylglycerides, fettsyrer og fosfolipider i AT olje og fett. Selv om majoriteten av lipidmolekyler var tilstede i en lignende overflod i LE og ikke-LE prøver, var det flere små endringer: økt C20: 5 inneholdende triacylglycerides, redusert C10: 0 caprinic og C24: 1 nervonic syrer. LE AT olje inneholdt også en signatur av økte cyclopropane-type fettsyrer og inflammatoriske mediatorer arakidonsyre syre og ceramider. Interessant C20: 5 og C22: 6 omega-3-type lipider er økt i LE AT, korrelere med LE år. Derfor har LE AT en normal lipidprofil inneholder en signatur av betennelser og omega-3-fett. Det er fortsatt uklart, men om disse forskjellene gjenspeiler et småskala global metabolske forstyrrelser eller effekter i lokaliserte betennelses foci
Citation. Sedger LM, Tull DL, McConville MJ, De Souza DP, Rupasinghe TWT, Williams SJ , et al. (2016) lipidomiske Profilering av fettvev avslører en inflammatorisk signatur i kreft-relaterte fag Lymfødem. PLoS ONE 11 (5): e0154650. doi: 10,1371 /journal.pone.0154650
Redaktør: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, Fundação Oswaldo Cruz, BRASIL
mottatt: 26 februar 2016; Godkjent: 15 april 2016; Publisert: May 16, 2016
Copyright: © 2016 Sedger et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i papir og dets tilleggsinformasjon filer. Spesifikke detaljer om enkeltpersoner innen pasient- og normale giver kohorter lagres i samsvar med den australske National helse og medisinsk forskning retningslinjer for ansvarlig adferd for forskning og Institutional menneskelige forskningskomiteen retningslinjer
Finansiering:. Forskningen ble finansiert av Lymfødem Program, det medisinske fakultet Health Science, Macquarie University. Bevilget JB
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser:.. AT, fettvev; BMI, body mass index; Cer, ceramid; CE, kolesterol ester; DAG, diacylglyceride; GC, gasskromatografi; HexCer, heksa-ceramid; HDL, high density lipoprotein; LE, lymfødem; LC, væskekromatografi; LDL, low density lipoprotein; LPC, lyso-fosfatidylkolin; LPE, Lyso-fosfatidyletanolaminer; PBQC, samlet biologisk kvalitetskontroll; PC, phosphatidylcholine; PCA, prinsippet komponent analyse; PE, fosfatidyletanolamin; MS, massespektrometri; SM, sfingomyelin; TAG, triacylglyceride; VLDL, density lipoproteiner
svært lave
Innledning
Lymfødem (LE) er en tilstand der lymfe akkumuleres innenfor interstitiell vev forårsaker hevelse. I utviklede land LE oftest forekommer som en konsekvens av, eller «sekundært til» behandling for kreft. Kreftpasienter er mest utsatt for å utvikle kreft relatert LE omfatter pasienter med brystkreft som trenger lymfeknute iscenesettelse eller behandling (sentinel node biopsi pluss /minus disseksjon og /eller aksillær stråling, og ofte med kjemoterapi) på grunn av kreft metastase [1]. Faktisk konservative anslag tyder på at opptil 28% av slike pasienter i utviklede land vil utvikle arm LE etter at deres behandling av brystkreft [1]. På samme måte kan opptil 75% av hode- og nakkekreftpasienter utvikle hals, ansikt, nakke eller intern LE [2] og en tredjedel av bekkenkreftpasienter vil utvikle nedre lem LE innen 1 år etter operasjon [3]. Derfor er kreft-relaterte LE allment akseptert som en av de mest vanlige langvarige komplikasjoner av kreftbehandling. Primær LE kan også inntreffe spontant, vanligvis i form av første i barndommen, og ofte med en genetisk opprinnelse [4] eller som et resultat fra ikke-kreft-relaterte vev skader. Derfor LE oppstår på grunn av nedsatt lymfedrenasje som kan være direkte forårsaket av, eller bidratt til, ved skade eller genetiske endringer som fører til defekter i lymfekar biogenesis eller misdannelser i lymfe fartøy ventil dannelse og redusert lymfatiske funksjon [4]. Dessverre er det foreløpig ingen kur for enten primær eller sekundær (kreft-relatert) LE. Dermed er LE en kronisk tilstand som påvirker om en persons evne til å leve et normalt liv fordi tilstanden har en tendens til å forverres over tid og fysisk skjemmende og funksjonshemming innvirkning på livskvaliteten [5,6].
En av hovedproblemene forbundet med kronisk LE er at de berørte vev ofte blitt konsolidert med fettvev (aT) [7,8]. Når dette skjer samsvar med konvensjonelle behandlinger som omfatter komprimering, bandasjering og massasje avtar ofte som det blir tydelig at de ikke kan redusere LE-forbundet AT som da dominerer innenfor det berørte området. Heldigvis er det en kirurgisk behandling alternativ for folk som lever med avansert AT rik LE: fettsuging kirurgi [9-12] som fysisk fjerner AT som dominerer det berørte området [7,8]. Selv om denne behandlingen er svært gunstig for LE pasienter umiddelbart redusere LE berørte lem størrelse, er årsakene til produksjon av LE AT fortsatt voksende og LE patologi er ufullstendig forstått [13]. Således, selv om det er klart at adipogenese innebærer normalt cytokiner, hormoner, transkripsjonsfaktorer, og mirnas som temporært regulerer genekspresjon å drive modningen av pre-adipocytter til modne adipocytter lipid-inneholdende [14,15], men svært lite er for tiden kjent om adipogenesen innenfor LE aT selv. Ingenting er kjent, for eksempel, om hvilke lipid-baserte molekyler som produseres av LE vev adipocytter. Interessant er AT faktisk en vesentlig del av pattedyrimmunsystemet og i virkeligheten lymfeknuter som normalt eksisterer i nær fysisk forbindelse med AT, hvor lipolyse frigir frie fettsyrer og lipid-mediatorer som brensel immunsystemceller [16]. Videre, mens kolesterol blir vanligvis transporteres i blodet via lipoproteiner, enten som cholymicrons, med svært lav tetthet lipoproteiner (VLDL), middels eller høy tetthet lipoproteiner (HDL), transportering av lipider tilbake fra celler og vev til leveren skjer via HDL og lymfe-en prosess som kalles revers kolesteroltransport [16]. Her blir utstrømning av cellulær kolesterol frigjort i intracellulær plass skjønt de kombinerte virkninger av ABC-transportører, scavenger reseptor-B1, Cyp27A1, caveolin eller passiv diffusjon (hver mekanisme varierer avhengig delvis av celletype) [17], hvor det er til syvende og sist fjernet av HDL og trafikkert tilbake fra interstitium gjennom lymfesystemet (for en nylig oversikt se [18]). Således er lipidtransport nødvendigvis er integrert i LE fordi lymfedrenering endres når lymfeknutene er fjernet, eller når lymfekar og ventiler er skadet eller funksjonsfeil. Faktisk foreslår de siste dyrebaserte studier svekket revers kolesteroltransport skjer i eksperimentelt indusert murine LE [19]. Hvis det er feil i revers kolesteroltransport i humant LE deretter hvorvidt lipidmetabolisme er endret eller ubalanserte er uklare. Så, for lite kunnskap om konsekvensene av kronisk LE hevelse på serum lipid nivå og lipid-assosiert lipoproteiner i menneskelig LE. Derfor å begynne å bedre forstå patobiologi av AT produksjon i avansert LE vi undersøkte serumlipider og eksperimentelt generert den første AT lipidprofil avanserte kreftrelaterte LE pasienter og sammenlignet dem med normal serum, og til anatomisk matchet arm og ben normal , ikke-LE, aT.
Materialer og metoder
Menneske forskningsetikk Godkjenning
Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av Macquarie University menneskelige forskningsetiske komité (HREC) før til sin innvielse. Alle elementene i studien ble deretter gjennomført i henhold til HREC godkjente protokoller, slik at alle normale donorer vev, og pasienter med LE, donert blod og AT fettsuging prøver frivillig og med informert skriftlig samtykke.
Pasient og Sunn kontroll~~POS=TRUNC deltakerne studere inklusjonskriteriene
Alle pasienter med LE (n = 15, tabell 1) ble søker medisinsk utredning og behandling for avansert lem LE på Advanced Lymfødem Assessment Klinikken på Macquarie University Hospital. Disse pasientene vanligvis presentert med en lem volum forskjell på minst 20-25% og tilbys fettsuging kirurgi basert på tilstedeværelsen av LE-forbundet AT som hovedsakelig bestemt av en «non-pitting» LE presentasjon [8,20] og bekreftet av magnetic resonance imaging [9]. Dermed fettsuging kirurgi er et behandlingsalternativ for pasienter som har opplevd ubetydelige siste nytte av konvensjonelle LE behandlinger på grunn av den konsoliderte oppbygging av betydelige mengder AT. For sammenligning med normalt vev også erholdt vi sunt menneske arm og ben (lem) AT (n = 7, tabell 1). Dette vevet er innhentet fra kosmetisk kirurgi pasienter som hadde valgt for fettsuging kirurgi ved en privat Melbourne kosmetisk kirurgi klinikk for uanmeldte personlige grunner. Et eksempel bilde av lem LE pasienten og LE og ikke-LE lipoasparates er vist (fig 1). Alle LE pasienter og friske givere også gitt sin vekt og høyde målinger, som ble brukt til å beregne den enkeltes body mass index (BMI) og derved muliggjør identifisering og utelukkelse av deltagerne som kanskje ellers ikke ville bli klassifisert som å ha en «normal BMI «, vi ifølge Heart Foundation of Australia klassifikasjon skala (https://heartfoundation.org.au/). Dermed er alle deltagerne var innenfor normal BMI normalområdet (15 25), med unntak av to LE pasienter som hadde en pre-kirurgi body mass index (BMI) 30 kg /m
2. Imidlertid ble disse to LE pasientene ikke ansett for å være overvektige fordi BMI på en pasient tilbake til 30 kg /m
2 raskt etter lem fettsuging, og den andre har primære etappe LE påvirker både lemmer dvs. klart disse pasientene pre-kirurgisk data reflekterte deres lymphedematous lemmer snarere enn en tilstand av generalisert kroppen fedme. Det var også tydelig at flere enkeltpersoner i både LE og ikke-LE kohorter var «sunt, men overvektig» (BMI = 25-29) i tråd med mange av dagens vestlige lands demografi (enkelte data ikke vist). En statistisk analyse av kohorten egenskaper data, spesielt alder, kjønn og BMI, ble utført via en standard Students T-test med ingen forutsetning for data distribusjon normalitet gitt de relativt små utvalg (tabell 1).
(A ) Venstre arm LE, (B) Venstre ben LE, (C) LE AT fettsuging aspirer og (D) Normal ikke-LE (kosmetisk kirurgi) AT fettsuging aspirer, som viser tilstedeværelse av flytende olje (olje) og fast fett (fett). Også tydelig er det vandige sjiktet av saltvann vaske innen kosmetisk kirurgi aspirer.
Prøvetaking og behandling vev
Fettsuging kirurgi for kreft-relaterte LE ble utført under generell anestesi ved Macquarie University Hospital etter forfatter TL som var spesialtrent av professor Brorson og professor Munnoch, som har utviklet det som nå er en godt etablert prosedyre for avansert LE [10-12,21]. Operasjonen ble utført på LE-berørt armer og ben (Fig 1A og 1B) etter påføring av en tourniquet. I korthet, ble subkutant AT fjernet gjennom flere små snitt som ligger langs lengden av armen eller benet, via en spiralsnodd Tri Port III kanyle (vanligvis 22-30 cm lange og 4-5 mm brede) som er koblet til en vakuumpumpe [9]; den samme prosedyren har nå vært ansatt lykkes internasjonalt i mer enn et tiår [10-12]. Den ekstraherte arm eller ben LE AT lipoaspirate (fig 1C) ble umiddelbart fraktet til Det medisinske fakultet og Helse Research Laboratories, behandlet som beskrevet nedenfor og lagret ved -80 ° C i en AT Sample Bank generert av LMS. Sunt menneske lem (arm eller ben) AT ble samlet inn med donor informert samtykke, på en privat kosmetisk kirurgi klinikk, Dr Lanzer Clinic, Melbourne, fra kunder som velger å gjennomgå fettsuging kirurgi. Kort fortalt ble en sunn lipo-aspirer vev (fig 1D) oppnådd ved hjelp av standard plastisk kirurgi under generell anestesi. Etter små snitt ble gjort, ble det omliggende området fylt med Klein tumescent væske ved hjelp av 20 gauge nål, før du søker sug og påfølgende uttak av AT via en 14 gauge Klein mikrokanyleanordning av capastrano variasjon [22]. Kosmetisk fettsuging kirurgi pasienter deretter bære en komprimering bindemiddel kontinuerlig i ca 2 uker, deretter periodisk for to uker postoperativt, for å minimere risikoen for uønskede hendelser eller postoperative komplikasjoner [23].
LE og normal (kosmetisk) fettsuging kirurgi aT lipoaspirates (figur 1C og 1D) ble helt over i flere 50 ml Falcon-rør og sentrifugeres ved omtrent 350 g i 5 minutter for å separere den flytende «fat olje» fra de faste intakte aT dvs. intakte adipocytter ellers referert her som AT «fett». De resterende underliggende vandige vevskomponenter ble også oppsamlet, og det blod erytrocytt pellet ble kastet. Etter sentrifugering, ble oljen fjernet og lagret frosset ved -80 ° C. Deretter de intakte adipocytter, og vandige lagene ble forsiktig fjernet, hver for seg, og likeledes er lagt inn i separate rør og umiddelbart frosset også ved -80 ° C. Således ble de vevskomponenter lagret ved tidspunktet for deres kirurgiske samling over en 12-18 måneders periode gjennom til en enkelt tine for senere laboratorieanalyser.
Perifere blodprøver ble samlet fra LE pasienter som bruker både SST-II og K
2EDTA Vacutainer prøverør umiddelbart før anestesi for fettsuging kirurgi. Perifert blod ble også innhentet fra ikke-relaterte sunn alder og kjønn matchet givere (n = 13, tabell 1) ved standard venepunksjon av perifere vener, utført av kvalifisert phlebotomists. Alle LE pasienter og friske donorer de var «faste» og «hvile»; de forbrukes ingen mat og ikke trene for minst 8-10 timer før venepunksjon eller AT samling av fettsuging kirurgi. Perifere blodprøver ble sentrifugert i 10 minutter og serumet (og plasma) lagene fjernet, delt i porsjoner, deretter lagret i frosset tilstand inntil et enkelt tine for laboratorieanalyse.
Automatisert biokjemisk analyse for totalt serumlipider
Totalt serumlipider ble målt som følger: kolesterol ble målt med en kolesterol enzymatisk analyse (Abbott), triglycerider med en glycerol-fosfatase-oksidase-basert analyse (Abbott), og HDL-kolesterol med det ultra HDL akselerator selektiv detergent assay (Abbot) og analysert på en Abbott Architect c16000 instrument på Douglas Hanly Moir patologi, Macquarie Park, Sydney. Den LDL-kolesterolnivåer ble beregnet som følger: LDL-kolesterol = kolesterol-HDL- (0,45 x triglyserider), som i hovedsak er lik til begge de Friedewald og Amhadi formuli [24,25]. Apolipoprotein-A1 og -B serumnivåer ble bestemt av immunoturbidimetric analyser Tina-Quant Apolipoprotein A-1 Ver 2 og Apolipoproteiner B Ver 2 (Roche), ved hjelp av Roche Integra 800 analysator på Sullivan og Nicolaides Laboratory i Brisbane, Australia. Den generelt aksepterte normale området av disse molekylene i humant serum er angitt sammen med dataene.
gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) fettsyre-analyse
AT prøver av omtrent 50 mg var ekstrahert i 1 ml kloroform: metanol (2: 1 v /v) ved inkubasjon på en termomikser (Eppendorf) i 10 minutter ved 30 ° C, deretter sentrifugert ved 18000g i 5 minutter ved 4 ° C. En 50 ul delmengde av supernatanten fra hver prøve ble også kombinert for å skape en samlet biologisk kvalitetskontroll (PBQC). Individuelle prøver og PBQC (5 ul) ble overført til et glass inn som 40 ul av interne standarder ble lagt til: kloroform: metanol (2: 1 v /v) inneholder 62,5 uM hver av
13C
18-stearate og
13C
2-myristat. Rettkjedet fettsyre (Sigma) standarder (25 uM) og monometyl-forgrenede og cyklopropan-type fettsyre-standarder (25 uM) ble syntetisert på huset, som beskrevet tidligere [26,27] og fremstilt i kloroform: metanol (2: 1). Setter inn inneholder prøvene og PBQC ble forseglet i GC ampuller og omforestret å skape fettsyremetylestre. For dette prøvene ble blandet med 5 pl Methprep-II (Alltech) ved bruk av en automatisk prøvetaker Gerstel MPS2 robot, inkubert i 30 minutter ved 37 ° C med langsom risting i blanding. Fettsyre-analyse ble utført på et Agilent 7890 gasskromatograf koblet til en 5975 masseselektiv detektor. Prøver (2 ul) ble injisert i delt modus (10: 1) inn i et innløp innstilt på 250 ° C og kromatografisk separering ble oppnådd på en SGE BPX70 kolonne (60 m x 0,25 mm i.d. x 0,25 um filmtykkelse). Ovnen Betingelsene var 70 ° C i 1 min, deretter 40 ° C /minutt til 150 ° C, 4 ° C /minutt til 200 ° C, 3 ° C /minutt til 220 ° C, 4 ° C /min til 250 ° C og deretter holdt ved 250 ° C i 4 minutter. Helium bære gasstrøm var konstant ved 1,5 ml /min, og MS overføringslinjen ble etablert ved 280 ° C. Forbindelser ble ionisert ved hjelp av elektron innvirkning fragmentering (-70eV) og massespektra samlet over 50-450 m /z rekkevidde på 3,6 skanninger /sekund.
væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) lipid analyse
LC-MS lipid-analyse ble utført i det vesentlige i henhold til standardmetoder beskrevet tidligere for blodlipider [28]. I korthet, fett-olje (~ 50 mg «Oil») og faststoff-fett (~ 50 mg «fett») prøvene ble ekstrahert ved anvendelse av 1 ml kloroform: metanol (2: 1, v /v) inneholdende indre standard 5 uM C17 : 0 LPC i 1 time ved RT. Ekstraktene ble sentrifugert ved 18 000 g i 10 minutter ved 4 ° C (i en kjølemikrosentrifuge), og supernatantene ble overført til et nytt rør. Pelleten ble re-ekstrahert med 500 ul kloroform: metanol (2: 1, v /v), sentrifugert som beskrevet ovenfor, og supernatantene ble kombinert. De fett-olje og faststoff-fett-ekstraktene ble tørket under nitrogengass og deretter resuspendert i 100 ul butanol: metanol (1: 1) inneholdende 5 mM ammoniumformiat (Sigma). Lipider ble analysert ved å anvende en Agilent 1200 væskekromatografi (LC) system og trippel kvadrupol 6460 massespektrometer (MS). I korthet, lipider ble separert ved injeksjon av 5 ul av prøven på en 50 mm x 2,1 mm x 2,7 um Ascentis Express RP-amid-kolonne (Supelco) etterfulgt av eluering ved en strømningshastighet på 0,2 ml /min i løpet av en 5 min gradient av vann /metanol /tetrahydrofuran (50:20:30, v /v /v) til vann /metanol /tetrahydrofuran (5:20:75, v /v /v) med den endelige buffer holdt i 3 minutter. Lipider ble identifisert ved elektrospray ionisering-massespektrometri ved anvendelse av en metode som ble optimalisert ved bruk av et panel av autentiske standarder lipid. Lipid identifikasjon ble utført ved hjelp av to skannefunksjoner er tilgjengelige i trippel-firemannsrom masse spektrometer, en forløper skanning og nøytral tap scan. Begge skanninger profilerer identifikasjon av forløper-masser av lipid art basert på m /z av fragmentet av hodet gruppen. Fosfatidylcholiner (PC) og sfingomyeliner (SM) ble identifisert ved å søke etter forløpere på 184,1 m /z, mens ceramider (Cer), kolesterol estere (CE) og fosfatidylglyceroler (PG) ble identifisert ved å søke etter forløpere på 264,6, 369,4 og 189 m /z henholdsvis, alt i positiv MS-modus. Fosfatidyletanolaminer (PE) ble identifisert ved å søke etter nøytral tap 141 m /z i positiv MS-modus. Diacylglycerol (DAG) og triacylglyserol (TAG) ble identifisert ved hjelp av nøytrale tap skanninger av mulige fettsyreasyl deler. Således lipid identifikasjoner er antatt, og de fleste har ikke blitt bekreftet av andre midler. Lipider ble kvantifisert ved hjelp av flere reaksjon overvåking med kapillær spenning 4000V, fragmentor spenning 140-380 V, kollisjonsenergi 15-60 V og kollisjon gass (nitrogen) ved 7 l /min. Kvantitering var basert på relative endringer i topparealer
databehandling og statistisk analyse
Straight-kjeden lipid artene er jevnt henvist til via Cx. Y nomenklatur som refererer til det totale antall karbonatomer (x) og antall dobbeltbindinger (y) i lipid. For eksempel, kolesterolester CE (14: 1) har 14 karbonatomer og en dobbeltbinding-oppmerksom på at posisjonen av dobbeltbindingen ikke er definert. Forgrenede fettsyrer studier inkluderer iso-fettsyre acidsm inneholdende en metyl-gruppe i den nest siste karbon. Således, iso-C15: 0 refererer til 13-methylmyristic syre. Cyclopropane fettsyrer studert inkluderer cis-9,10-methylenehexadecanoic syre (MHA), dihyrosterculic syre (DHS) og lactobacillic syre (LBA). Den lipid nomenklatur og klassifisering i samsvar med at i LIPD MAPS https://www.lipids.org. Både GC og LC-MS-data ble behandlet ved hjelp av Agilent Mass Hunter Kvantitativ programvare (B.06.00). Rådata indikerer relative overflod (arealet under kurven) ble analysert i Microsoft Excel (versjon 14.5.9 for Mac OS), beregning av gjennomsnitt, standardavvik (SD) og median for LE eller normale kohort data. Rådata ble først log transformert, så justert ved median normalisering (x /median) [29] hvor medianverdien som bestemmes individuelt for hver klasse av lipid inkludert i studien (f.eks fettsyrer, DAG, TAG, CE, PE /LPE , SM, Cer, etc), for å ta hensyn til heteroscedastic natur metabolomics data. Hvor en lipid ble uoppdaget en nullverdi ble erstattet med «0» eller «1» for å tillate nedstrøms analyse (rådata, eske celler i tilleggsdata). Midler og SD ble igjen regnet denne gang fra log transformert median-normalisert data, og betydelige forskjeller mellom LE versus normal AT prøver, vurderes hver for lipid arter, identifisert ved hjelp av en to-tailed uparet t-test; statistisk signifikans p 0,05, med ingen forutsetninger for datadistribusjon (normalitet). Global-mediannormaliserte data ble også uavhengig analysert for å tillate et prinsipp komponent analyse (PCA) som vurderte de globale forskjellene mellom alle metabolitter innenfor hver av prøve kohorter samtidig; de PCAs ble utført ved hjelp av R-programvare og resultatene kan bli funnet i S1 fig. Dataene ble også undersøkt for å identifisere potensielle falske funn ved hjelp av Benjamini-Hochberg korreksjon metoden [30]. Til slutt ble data analysert for korrelasjon til LE år ved Pearson korrelasjonsmetode med Graphpad PRISM (versjon 60f for Mac OS X), med tilsvarende R
2 tabellverdiene sammen med
p
0,05 som en indikator av betydning. Dataene ble fremstilt grafisk med PRISM og multikomponent data tallene ble bygget i Canvas Draw 2 (versjon 1.01) for Mac OS.
Resultater
Totalt serumlipider i avansert LE
Å bestemme hvorvidt det var noen systemisk lipidbasert metabolsk ubalanse er tilknyttet lem AT deponering i kronisk fremskreden kreft-relaterte LE, 15 LE pasientserum (tabell 1), ble analysert for totalt sirkulerende kolesterol og triglyserider nivåer, og sammenlignet 13 normal sunn sex-matchet serum fra friske donorer. Serumnivåene av disse molekylene var svært lik i LE pasienter som var til stede i friske, ikke-LE, blodgivere, og begge kohorter inneholdt flere hyperkolesterolemi personer dvs. personer med kolesterol nivåer over de anbefalte nivåer for friske individer, dvs. over «normal range «(fig 2A). Til tross for disse likhetene ble serum HDL-kolesterol nivåer funnet å være lavere (statistisk signifikant, p = 0,0340) i LE pasienter sammenlignet med friske donor kohort prøver, om enn disse prøvene fortsatt var innenfor normalområdet (Fig 2A). De beregnede LDL-kolesterol nivåer var også lik mellom LE og normal kohort prøver (figur 2A), som var serum lipid transportmolekyler, apolipoprotein A1 og apolipoprotein B (Fig 2B). Dermed blir overflod av totale serumlipider og lipid-transportmolekyler er i stor grad uendret i avanserte kreftrelaterte LE i forhold til normale donorer, og innenfor normalområdet for friske voksne.
(A) Box og whisker plott av totalt serumkolesterol, triglyserider, HDL-kolesterol og beregnet LDL-kolesterol, og (B) Total serumlipoprotein apoprotein A1 og apolipoprotein B, fra LE pasient (n = 15) og normale kohort (n = 11) perifere blodprøver. Linjen innenfor hver boks angir den globale medianverdien beregnet ut fra kullet. Den generelt aksepterte populasjonen normalområdet (NR) er vist i hver graf (vertikal linje, høyre side). Statistisk signifikans (
p
verdi) mellom LE og Normal (ikke-LE) er også vist, som bestemmes av tosidige t-test, ikke forutsatt lik varians.
Serum lipidomiske analyse av LE Pasienter
Fordi disse rask diagnostiske rutinemessige laboratorieanalyser ikke gir informasjon om type eller overflod av enkelte lipider arter, 7 tilfeldig valgte LE pasientprøver og 3 «normale» (sunne) donor serumprøver ble analysert ytterligere ved hjelp av gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS). Dette tillater den spesifikke molekylære identifisering av noen 31 fettsyrer i human serum, inkludert 4 forgrenede fettsyrer, den sistnevnte ikke ofte analysert i andre publikasjoner som undersøker serumlipider. Ikke desto mindre, og i overensstemmelse med de totale serum lipid nivåer, finnes det ikke noen individuell serum fettsyrer ble funnet å være til stede i LE pasientserum med en endret overflod enn det som var til stede hos friske «kontroll» (ikke-LE) kohort serum (data vises nå; S1 datafil; Sheet «Serum»). Et prinsipp komponentanalyse (PCA) ble også utført, men som ventet ingen signifikante globale forskjellene var tydelig mellom LE og normale serumprøver, som alle LE og normale kohort datapunkter var stort sett inter-spredt (data ikke vist). Tatt sammen med det totale lipid serumanalysen som er beskrevet ovenfor, er disse data indikerer at nærværet av store mengder AT innenfor LE-påvirket lemmer av avansert kreft-relaterte lem LE pasienter som ikke resulterer i påvisbare forskjeller i profiler eller nivåer av sirkulerende blod -born lipider, som vurderes av disse metodene. Videre justerer dette resultatet tett med normal overflod av serumtransportproteiner apolipoprotein A1 og B i LE serum (referert til ovenfor, fig 2).
Lymfødem fettvev (AT) lipidomiske analyse
til tross for mangel på forskjell i total serumlipider, forble det ukjent om LE aT selve besto av uvanlig lipid molekyl profil, eller en endret relativ overflod i forhold til normal menneskelig lem aT. Vi har derfor molekylært analyseres både den faste AT ( «fett») omfattende intakte adipocytt rikt vev, så vel som de som allerede er frigjort adipocytt olje (dvs. fett olje, referert til heretter som «olje») som er tilstede i lipoaspirates erholdt fra LE pasienter som gjennomgår fettsuging kirurgi, og sammenlignet denne med fett og fett olje til stede i de lipoaspirates erholdt fra friske individer som gjennomgår liposurgery av kosmetiske grunner. Av notatet, ble alle lipoaspirate prøvene anatomisk matchet, dvs. alle var arm eller ben AT og både solid AT fett, og fett olje, ble analysert separat ved GC-MS og LC-MS. Dette tillater den samtidige identifisering og relativ kvantifisering (log transformert median-normalisert i forhold overflod) av noen 275 lipid-baserte molekyler, inkludert: 25 diacylglycerides, 66 triacylglycerides, 34 fettsyrer, og 150 fosfolipider av forskjellige klasser, i fett og fett olje i menneskelige lipoaspirate vevsprøver.
Først brukte vi LC-MS for å identifisere diacylglycerides (DAG) og triacylglyceride (Tags) lipider i både LE og vanlig lem AT. Selv om de fleste av Dags og koder som ble identifisert i olje og fett av menneskelig LE AT var til stede i samme overflod som det påvises i vanlig lem AT (dvs. mellom -0,1 til 0,1 redusert eller økt sammenlikne LE til normal), var det flere lipid artene som ble individuelt statistisk signifikant økt eller redusert i LE forhold til friskt vev (fig 3A og 3B, og S2 datafil). Selv om disse endringene var hvert ganske liten, det viste seg at de fleste av økningen var i koder med flerumettede fettsyrer, og spesielt de som inneholder 3 eller flere umettede karbonatomer (hvite søyler), spesielt eikosapentaensyre C20: 5 (grå søyler), både i LE AT fett og olje (figur 3A og 3B). Dessuten, når disse data ble kombinert sammen det viste seg at det kan være en global økning i poly-umettede fettsyreinneholdende TAG og en samtidig reduksjon i mindre mettet fett, som for eksempel di-, mono-, eller helt umettet fett, i LE AT (fig 3C). Imidlertid, i pattedyr, C20 poly-umettede fettsyrer er generelt syntetisert fra kosten hentet linolsyre (C18: 2) og a-linenic syre (C18: 3) ved virkningen av fettsyre-desaturaser og elongases, og den proksimale enzym som gir både arakidonsyre C20: 4 og eicosapentaensyre C20: 5, fra deres respektive forløpere C18: 2 og C18: 3, henholdsvis, er delta-5-desaturase. Omvendt, mono-mettede fettsyrer er avhengige av stearoyl-CoA-desaturaser. Dermed er det fortsatt uklart om disse små individuelle endringer i spesifikke DAG og kodene er biologisk betydnings dvs. om (i) de gjenspeiler reelle endringer i lipidmetabolismen som en økning i Delta-5-desaturaser og /eller redusert stearoyl-CoA desaturase aktivitet, som senere eller samtidig resulterer i økt produksjon av den antiinflammatoriske omega-3-baserte eicosapentaensyre C20: 5, eller alternativt (ii) om disse små effekter er alle bare innenfor områdene av bakgrunnsvariant spesielt på grunn av deres lille størrelse og generell mangel av statistisk signifikans etter BH korreksjon analyse. Ikke desto mindre er et rimelig utgangs konklusjon at den LE AT ser ut til å ha en bemerkelsesverdig lik lipidomiske profilen til ikke-LE AT (med unntak av det høyere innhold av C20: 5 inneholdende TAG), og at den LE olje som er frigjort fra ødelagte adipocytter ligner oljen som er til stede i intakte aT-adipocyter (fett) -at det minste med hensyn til DAG og TAG-innhold.
