Abstract
Bakgrunn
Nye publikasjoner tyder på at neoplastisk initiering og vekst er avhengig av en liten undergruppe av celler, kalt kreft stamceller (cscs). Anaplastisk thyroideakarsinom (ATC) er en svært aggressiv solid tumor med dårlig prognose, preget av høy dedifferentiation. Eksistensen av cscs kan forklare heterogenitet av ATC lesjoner. CD133 har blitt identifisert som en stamcelle markør for normale og kreft vev, selv om dens biologiske funksjon er ukjent.
metodikk /hovedfunnene
ATC cellelinjer ARO, KAT-4, KAT-18 og FRO ble analysert for ekspresjon CD133. Flowcytometri viste CD133
pos celler bare i ARO og KAT-4 (64 ± 9% og 57 ± 12%, henholdsvis). Disse dataene ble bekreftet ved QRT-PCR og immunocytochemistry. ARO og KAT-4 var også positivt for foster markør onkoføtal fibronektin og negative for thyrocyte spesifikke differensieringsmarkører tyreoglobulin, thyroperoxidase og natrium /jodid symporter. Sortert ARO /CD133
pos celler viste høyere spredning, selvfornyelse, kolonidannende evne sammenlignet med ARO /CD133
neg. Videre ARO /CD133
pos viste nivåer av skjoldbrusktranskripsjonsfaktor TTF-en ligner på fosterets skjoldbruskcellelinje TAD-2, mens uttrykket i ARO /CD133
neg var ubetydelig. Uttrykket av stamcelleforskningen markør oktober-4 oppdages ved RT-PCR og flowcytometri var markert høyere i ARO /CD133
pos i forhold til ARO /CD133
neg celler. Den stamcellemarkører c-KIT og THY-1 var negative. Følsomhet for kjemoterapi agenter ble undersøkt, viser bemerkelsesverdig motstand mot kjemoterapi-indusert apoptose i ARO /CD133
pos sammenlignet med ARO /CD133
neg celler.
Konklusjon /Betydning
Vi beskriver CD133
pos celler i ATC cellelinjer. ARO /CD133
pos celler utviser stamcelleliknende funksjoner – for eksempel høy spredning, selvfornyelse evne, uttrykk for oktober-4 – og er preget av høyere motstand mot cellegift. Den samtidige positivitet for thyroid bestemt faktor TTF-en og onfFN foreslår at de kan representere mulige tyroideacancer stilk-lignende celler. Våre
in vitro
funn kan gi ny innsikt for nye terapeutiske tilnærminger
Citation. Zito G, Richiusa P, Bommarito A, Carissimi E, Russo L, Coppola A, et al. (2008)
In Vitro
Identifisering og karakterisering av CD133
pos Kreft Stilk-lignende celler i Anaplastisk thyroideakarsinom cellelinjer. PLoS ONE 3 (10): e3544. doi: 10,1371 /journal.pone.0003544
Redaktør: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center og Beckman Research Institute, USA
mottatt: 07.04.2008; Godkjent: 06.10.2008; Publisert: 28 oktober 2008
Copyright: © 2008 Zito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Minis dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) 60% (CG)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Anaplastisk thyroideakarsinom (ATC) er en av de mest aggressive endokrine svulster med morfologiske trekk ved udifferensiert svulst. Pasienter med ATC har en dårlig prognose med en midlere overlevelsestid på 2-6 måneder. Kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi ikke bedres overlevelse [1].
Nylig ble voksne stamceller identifisert i menneskelige skjoldbruskkjertelen [2]. Disse cellene uttrykker flere spesifikke markører, slik som atomtranskripsjonsfaktor OKT-4 (også kjent som OKT-3, OKT-3/4) og de endodermal markører Gata-4 og HNF4α [2] -. [4]
En forbindelse mellom stammen og kreftceller har blitt foreslått i forskjellige vev hvor kreftcellene er ment å utlede fra umodne forløpere eller stamceller [5]. Cancer stamceller (cscs) er blitt funnet i leukemi [6], glioblastom [7], bryst [8], prostata [9], gastrisk [10], lunge [11], og tykktarm [12] kreft. Disse celler, som bare representerer en liten populasjon innenfor hoveddelen av tumoren, har den samtidig evnen til å fornye seg selv og differensiere til andre cytotypes [13]. Stammen-lignende fenotype har vist seg å være i stand til å motstå konvensjonell terapi, og dermed fører til sykdom tilbakefall, selv når den primære lesjonen er utryddet [14], [15]. Hittil har imidlertid ingen studier har definitivt indikert at stamceller er ansvarlig for skjoldbrusk kreftutvikling. Men sjeldenhet og rask vekst mønster av ATC ligner natur stamceller. Bare én studie har beskrevet en svært liten befolkning, kalt side befolkning, beriket for stamceller blant skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer [16]. I tillegg har hypotesen om fostercelle karsinogenese, hvori kreftceller er avledet fra restene av føtale skjoldbruskkjertelceller i stedet for voksne thyrocytes, blitt foreslått [17].
En rekke markører er blitt identifisert for karakterisering av cscs. Menneskelig CD133, en høyt konservert antigen homolog av mus Prominin-1, ble opprinnelig identifisert i en subpopulasjon av CD34
+ hematopoetiske celler avledet fra human fetal lever og benmarg [18] – [19]. CD133 har vært brukt for identifikasjon og isolering av en antatt CSC populasjon fra flere humane cancere [20], [21]. I tillegg ble et uttrykk for CD133
pos cscs i leverkreft (HCC) vist seg å gi chemoresistance
in vitro product: [14]. Imidlertid må det biologiske funksjon er ukjent. Transkripsjonsfaktor oktober-4 er ansett som en hoved regulator av humane embryonale stamceller pluripotency og selvfornyelse kapasitet [22]. Interessant, er disse stamcelleegenskaper tilskrives oktober-4A, et spleise variant av oktober-4 genet ligger i kjernen [23], [24].
Formålet med denne studien var å undersøke uttrykk for antatte stamcellemarkører i etablerte menneske ATC cellelinjer, slik som ARO, KAT-4, KAT-18 og FRO. Vi identifiserte CD133
pos celler i ARO og KAT-4 cellelinjer. Dette undergruppe var preget av høyere
in vitro
spredning, selvfornyelse og kolonidannende evne. ARO /CD133
pos var mer motstandsdyktig enn ARO /CD133
neg celler til kjemoterapi-indusert apoptose. I tillegg ARO /CD133
pos cellene uttrykte thyroblast spesifikke transkripsjonsfaktor TTF-en og stamcelle markør oktober-4, mens de var negative for stamcellemarkører c-Kit og THY-en.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur vilkår
Menneskelig ATC cellelinjer ARO, KAT-4, KAT-18 og FRO ble vennlig levert av professor A. Fusco, Universitetet i Napoli , Italia. Under ekspansjonen var fase og for selvfornyelse assay-celler dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% varmeinaktivert bovint serum (FBS) føtalt. Ved alle andre eksperimenter ble cellene dyrket i RPMI1640 serumfritt medium (SFM) supplementert med basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, 20 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og epidermal vekstfaktor (EGF, 20 ng /ml,. Sigma-Aldrich) [25]
flowcytometrisystemer
uttrykk for stamcellemarkører CD133, OCT-4, c-Kit og Thy-1 ble evaluert av flyt cytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). For CD133-analyse ble celler først behandlet med FcR blokkerende reagens (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) og deretter inkubert i mørke ved 4 ° C i 10 minutter med fykoerytrin (PE) -konjugert mus IgG2b antihuman CD133 /2 (klon 293C3, Miltenyi Biotec). For co-farging med c-Kit og THY-1, celler ble deretter inkubert med monoklonalt mus IgG1 anti-human c-KIT og mus IgG1 anti-human Thy-1 antistoffer (Chemicon International, Temecula, CA, USA) ved 4 ° C i 30 minutter. Cellene ble vasket to ganger med PBS og deretter inkubert med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert polyklonalt geit anti-mus ved 4 ° C i 30 minutter. For farging med oktober-4 ble cellene fiksert og permeabilized med Cytofix-Cytoperm kit (BD Pharmingen, San Diego, Ca, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble deretter inkubert med monoklonalt mus IgG2b anti-human okt-3/4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ved 4 ° C i 30 minutter, vasket to ganger med PBS og inkubert med fykoerytrin (PE) -konjugert polyklonalt geit-anti-mus ved 4 ° C i 30 minutter. Det primære antistoffet gjenkjenner den OKT-4A isoform av proteinet (aa 1-134).
Apoptose ble evaluert ved kaspase 3 assay. Cellene ble først løst og permeabilized med Cytofix-Cytoperm kit (BD Pharmingen, San Diego, Ca, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble deretter inkubert med monoklonalt IgG kanin anti-Active Caspase 3 (BD Pharmingen) ved romtemperatur i 20 minutter, vasket to ganger med PBS og deretter inkubert med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert polyklonalt geit-anti-kanin-IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved romtemperatur i 20 minutter.
data ble analysert med Cellquest Pro-programvare (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Gating ble gjennomført basert på negativ kontroll fargeprofiler.
Immunocytochemistry
ARO og KAT-4 cellelinjer ble sådd i kammer lysbilder (Lab-Tek, Nunc, Inc. Naperville, USA), lov til å feste i 48 timer og deretter brukt for immunocytokjemi. Celler ble fiksert i 3% H
2o
2 i metanol i 10 minutter ved romtemperatur, deretter vasket to ganger i PBS, blokkert med 3% BSA og permeabilisert med PBS inneholdende 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur. Celler ble inkubert med muse-anti-human CD133 (IgG1, klon AC133, Miltenyi Biotec) i blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur, deretter skylt med PBS. Expression ble oppdaget ved hjelp av sekundære biotinylerte antistoffer og streptavidin /pepperrotperoksidase. Kromogen 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) substrat ble brukt og lysbilder ble kontra med hematoksylin.
Sortering av ARO /CD133
pos celler
ARO celler ble trypsinert og merket med primære CD133-Biotin og Biotin-mikroperler (Indirekte CD133 celle Isolation Kit, Miltenyi Biotec), i henhold til produsentens instruksjoner. Etter magnetisk sortering, ble celle renhet bedømt ved hjelp av strømningscytometri fykoerytrin (PE) -konjugert anti-human CD133 /2 (klon 293C3, Miltenyi Biotec).
Isolering av total RNA, RT-PCR og QRT-PCR
Total RNA ble ekstrahert og renset fra dyrket KAT-4, KAT-18, FRO og ARO (usortert, sortert CD133
neg og CD133
pos) cellelinjer ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milano, Italia), inkludert en fordøyelse takt med DNase jeg satt. RNA kvantitet og kvalitet ble vurdert av UV spektrofotometri. 2 ug total RNA ble revers transkribert i et volum på 20 ul med Oligo dT primere (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) og Stratascript RT (Stratagene, Amsterdam, Nederland), i henhold til produsentens protokoll. Tyroglobulin (Tg), thyroperoxidase (TPO), natrium /jodid symporter (NIS), onkoføtal-fibronektin (onfFN) og OKT-4-ekspresjon ble analysert ved hjelp av polymerase kjedereaksjon (PCR) [26] – [27]. 1 pl komplementære DNA ble tilsatt til 50 pl reaksjon inneholdende 5 ul 10 x reaksjonsbuffer, 50 mmol /l MgCl
2, 1 pl dNTPs, 50 pmol sense- og antisense-primere og 0,5 U Taq-gull-DNA-polymerase. Reaksjoner ble utført ved 95 ° C i 10 minutter; 35 sykluser ved 95 ° C i 45 sekunder, 55 ° C i 45 sekunder (primer spesifikk) og 72 ° C i 45 sekunder, etterfulgt av en forlengelse ved 72 ° C i 7 minutter og avslutning ved 4 ° C. Primer-par sekvenser, cDNA-fragmentstørrelser og annealing temperaturer var som følger: Tg (762 bp): 5′-CTTCGAGTACCAGGTTGATGCC-3 «og 5′-GGTGGTTTCAGTGAAGGTGGAA-3′ (55 ° C), TPO (593 bp): 5»- TGTGTCCAACGTGTTCTCCACAG-3 «og 5′-AAGACGTGGCTGTTCTCCCAC-3′ (55 ° C), NIS (179 bp): 5»-CTATGGCCTCAAGTTCCTCT-3 «og 5′-TCGTGGCTACAATGTACTGC-3′ (57 ° C), onfFN (215 bp) : 5»-TCTTCATGGACCAGAGATCT-3 «og 5′-TATGGTCTTGGCTATGCCT-3′ (55 ° C), OKT-4 (456 bp): 5»-AGCCCTCATTTCACCAGGCC-3 «og 5′-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3′ (63 ° C) , β-aktin (439 bp): 5»-GATGACCCAGATGACCCAGATCATGTTTG-3 «og 5′-AGGCTGGAAGAGTGCCTCA-3′ (55 ° C). For oktober-4 analyse ble nTERA2 cDNA (positiv kontroll) vennlig levert av Dr. S. Liedtke, Universitetet i Düsseldorf, Tyskland. For onfFN og TTF-en, ble TAD-2 cDNA brukt som positiv kontroll. CD133 og TTF-1 uttrykk ble analysert ved real-time kvantitativ PCR (QRT-PCR) i enkeltprøver. Totalt 2 ug ble anvendt for å måle mRNA-nivåer i forhold til p-aktin mRNA-ekspresjon. PCR primere og prober ble kjøpt fra Qiagen (Quantitect Primer Prominin1 og TTF1). Alle reaksjoner ble utført i et sluttvolum på 20 ul med 2 ul cDNA som templat ved hjelp av en LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). Dataanalyse ble utført med qBASE Browser som anvender en Δ-Ct relativ kvantifisering modell med PCR effektivitet korreksjon og enkelt referanse gen normalisering (β-actin: 5»-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3 «, og 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3») [28] .
In vitro
Kultur og celleproliferasjonsanalyse av ARO /CD133
pos celler
Etter isolering ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg-celler ble dyrket umiddelbart i SFM supplementert med bFGF og EGF i en atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C.
Celleproliferasjon ble målt ved kolorimetrisk analyse ved anvendelse av 3- (4,5 -Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) og BrdU (kolorimetrisk) sett (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). For MTT-analysen, sortert ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg-celler ble sådd i en 96-brønners plate i 100 ul SFM /brønn og dyrket opp til 72 timer. Cellene ble inkubert i 4 timer ved 37 ° C med MTT; Etter inkubasjonen ble mediet fjernet og cellene behandlet med DMSO i 5 minutter. Levedyktighet ble evaluert ved UV absorpsjon spekteret ved 550 nm med mikroplateleser Modell 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).
For BrdU analysen, sortert ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg ble sådd i en 96-brønners plate i 100 ul SFM /brønn og dyrket opp til 144 timer. Levedyktighet ble evaluert ved UV absorpsjon spekteret ved 450 nm med mikroplateleser Modell 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).
selvfornyelse analysen av ARO /CD133
pos celler
Ordnet ARO /CD133
pos-celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS. CD133 uttrykk ble oppdaget av flowcytometri på dag 0, 4, 8 og 11. På samme tidspunkt apoptose ble vurdert av Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, Ca, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Colony dannelsen analysen av ARO /CD133
pos celler
Ordnet ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg celler ble dyrket i 6-brønners plater i metylcellulose SFM (HSC-CFU grunnleggende medium, Miltenyi Biotec). Platene ble holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator i 2 uker. Antallet kolonier ble bedømt ved mikroskopisk telling.
kjemoterapeutika
ARO /CD133
pos og CD133
neg-celler ble dyrket i SFM supplementert med bFGF (20 ng /ml ) og EGF (20 ng /ml) med eller uten cisplatin (5, 10, 15 og 20 uM; Pharma, Østerrike), doxorubicin (0,5, 1, 1,5 og 2 uM; Ebewe Pharma, Østerrike), etoposid (10, 30 100 mikrometer, Teva Pharma, Netherland). Prosentandelen av levedyktig ARO /CD133
pos og CD133
neg celler ble evaluert ved 24, 48 og 72 timer med MTT-analyse og ved 48, 96 og 120 timer med BrdU analysen.
For apoptose evaluering, ARO /CD133
pos og CD133
neg-celler ble dyrket i 6-brønners plater og behandlet med den høyeste konsentrasjon av hvert legemiddel (20 uM cisplatin, 2 uM doksorubicin og 100 uM etoposid) opp til 120 timer. Apoptose evaluering (kaspase 3-assay) ble bestemt ved flow citometry som beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med SPSS v. 11 programvare for Windows. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistiske sammenligninger var basert på metriske tester og statistisk signifikans ble definert ved p 0,05. For eksperimenter med chemoterapics, ble forskjeller i levedyktigheten til ATC cellelinjer beregnes med Mann-Whitney test; p for trend med ulike medikamentkonsentrasjoner ble beregnet med W av Kendall test.
Resultater
Identifikasjon av CD133
pos celler i ATC cellelinjer
For å identifisere cscs i ATC cellelinjer, analyserte vi uttrykk for CD133 ved flowcytometri i ARO, KAT-4, KAT-18 og FRO (fig 1A). ARO og KAT-4 viste en gjennomsnittlig positivitet på 64 ± 9% og 57 ± 12%, henholdsvis; KAT-18 og FRO var negative. Resultatene ble bekreftet ved QRT-PCR (fig. 1B). CD133
pos celler i ARO cellelinjer ble karakterisert ved cytoplasmatic og polarisert lokalisering av antigenet på den apikale overflate av cellene (Fig. 1C). Den udifferensiert status for ATC cellelinjer ble bekreftet i PCR ved nærvær av onfFN [26] og fraværet av thyrocyte-spesifikke markører differensierende Tg, TPO og NIS [27] (fig. 2A og B).
(A) Flowcytometri analyse av CD133 i ARO, KAT-4, KAT-18, og FRO cellelinjer. Svarte linjer representerer positiv farging for CD133, grå linjer viser negativ kontroll med matchet isotype antistoff. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Analyse av CD133 uttrykk i ATC cellelinjer ved QRT-PCR. Data er representert som fold endring (relativ skala), vurderer KAT-18 = 1. (C) Immunocytochemistry av CD133 i ARO cellelinje. Pilene viser apikale og polarisert lokalisering av CD133 (20 × forstørrelse).
Uttrykk av skjoldbrusk spesifikke gener (Tg, TPO, NIS) (A) og foster markør onfFN (B) i ARO, KAT- 4 og normal thyroid ved RT-PCR. TAD-2-cellelinjen ble brukt som positiv kontroll for onfFN mRNA. β-aktin ble benyttet som intern kontroll i begge forsøk. bp = basepar.
C
ell kultur sorterte ARO /CD133
pos celler
Cluster dannende effektivitet av sortert ARO /CD133
pos celler ble bedømt ved FACS-analyse, som viser 90% CD133 positivitet (fig. 3A). Etter isolering ARO /CD133
pos celler dyrket i SFM supplert med bFGF og EGF, vokste som singel, ikke-heftende, sfæriske celler. Etter noen dager, ARO /CD133
pos celler begynt å danne klynger som gradvis økte i antall og størrelse, selv om de ikke danner follikler. Tvert imot, ARO /CD133
neg celler neppe aggregert i klynger (Fig. 3B).
(A) Renhet av ARO /CD133
pos celler etter magnetisk cellesortering bestemt ved strømningscytometri. (B) Kjennetegn på sortert ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg på dag 0, 3 og 10 av kultur. ARO /CD133
pos celler dannes klynger som økte i størrelse overtid.
In vitro
celleproliferasjon analysen selvfornyelse og kolonidannende kapasitet på ARO /CD133
pos celler
sprednings ble evaluert av MTT og BrdU analysen. ARO /CD133
pos celler viste
in vitro
økt spredning i forhold til ARO /CD133
neg celler med både MTT på 48-72 timer og BrdU på 72-144 timer (p = 0,028 og p≤0.001, henholdsvis) (fig. 4A og B). Når det gjelder caspase 3, flowcytometri viste spontan apoptose i SFM, som varierte etter 144 timer 0,5 til 2% for ARO /CD133
pos celler og 3,4 til 8,8% for ARO /CD133
neg celler (data ikke vist). Selv fornyelsen ble også vurdert (fig. 4C). CD133 uttrykk på ARO /CD133
pos celler opprinnelig ble redusert fra 90% på dag 0-46% på dag 8, og opprettholdt en stabil tilstand før dag 11. Nedgangen i CD133 uttrykk overtid ble ikke forårsaket av celledød ( 2%, data ikke vist). I stedet fortsatte celleproliferasjon for hele kulturen perioden, noe som tyder på at ARO /CD133
pos celler er preget av asymmetrisk divisjon evne (dvs. produksjon av to dattercellene, en CD133
pos og en CD133
neg). Kolonidannende analyse bekreftet den høye selvfornyelse evne ARO /CD133
pos, i forhold til ARO /CD133
neg celler. Faktisk, ARO /CD133
pos celler var i stand til å danne et høyere antall tumorkolonier (p = 0,028) (Fig. 4D og 4E).
(A) Celle proliferasjonsanalyse (MTT). Stiplet linje representerer ARO /CD133
neg celler, representerer kontinuerlig linje ARO /CD133
pos celler. Data er uttrykt som middelverdier ± SD og er representative for fire uavhengige eksperimenter. p 0,03. (B) celleproliferasjonsanalyse (BrdU). Stiplet linje representerer ARO /CD133
neg celler, representerer kontinuerlig linje ARO /CD133
pos celler. Data er uttrykt som middelverdier ± SD og er representative for fire uavhengige eksperimenter. p≤0.001. (C) selvfornyelse evne ARO /CD133
pos celler. Svart linje representerer antall ARO /CD133
pos celler vurderes av flowcytometri. Stiplede linje representerer cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analyse. (D) Colony-analysen i metylcellulose medium av sortert ARO /CD133
pos og CD133
neg celler (40 × forstørrelse) (E) Antall kolonier av ARO /CD133
pos og CD133
neg celler etter 15 dagers inkubasjon (p 0,03).
Behandling av ARO /CD133
pos og CD133
neg celler med kjemoterapi narkotika
Drug følsomhet ble evaluert av MTT og BrdU analysen. ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg celler ble inkubert med ulike konsentrasjoner av doksorubicin, cisplatin og etoposid. ARO /CD133
pos celler viste en bemerkelsesverdig narkotika motstand mot de tre agentene sammenlignet med ARO /CD133
neg celler under hele kulturen perioden (p≤0.05 for MTT og p≤0.001 for BrdU, henholdsvis). Ett representativt eksperiment etter 48 timer etter hver behandling er vist i fig. 5A-F. Konsekvent med disse funnene, apoptose vurdert av caspase 3-aktivitet viste en dramatisk aktivering i ARO /CD133
neg i forhold til ARO /CD133
pos celler ved alle tidspunkter analysert (figur 6A, representative for tre uavhengige eksperimenter med doksorubicin ). Histogrammer på tidspunkt 72 timer er vist i figur 6B. Lignende resultater ble oppnådd med de andre stoffer som brukes (data ikke vist).
(A) MTT-analyse etter 48 timers dyrkning i nærvær av 0,5, 1, 1,5 og 2 uM doxorubicin (B) etter 48 timer i nærvær av 5, 10, 15 og 20 pM cisplatin (C) etter 48 timer i nærvær av 10, 30 og 100 uM etoposid. Data er uttrykt som middelverdier ± SD og er representative for tre uavhengige eksperimenter (p≤0.05). (D) (E) (F) representerer BrdU-analyse under de samme betingelser av A, B, C (p≤0.001). Stiplet linje representerer ARO /CD133
neg celler og kontinuerlig linje representerer ARO /CD133
pos celler i alle grafer.
(A) Caspase 3 aktivitet etter behandling med doksorubicin. Stiplet linje representerer ARO /CD133
neg celler, representerer kontinuerlig linje ARO /CD133
pos celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (p≤0.001). (B) Caspase 3-aktivitet på tidspunkt 72 timer med doksorubicin. Svart linje representerer positiv farging for caspase 3, viser grå linje negativ kontroll med matchet isotype antistoff. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
In vitro
karakterisering av ARO /CD133
pos celler
For ytterligere å karakterisere ARO /CD133
pos befolkningen, vurderte vi co-uttrykk for andre stamcellemarkører. MRNA uttrykk for thyroid transkripsjonsfaktor-1 (TTF-1) i ARO /CD133
pos var betydelig høyere enn i ARO /CD133
neg celler, ligner til TAD-to fosterskjoldbruskcellelinje (positiv kontroll) ( fig. 7A). Oktober-4 uttrykk var 91 ± 3% i ARO /CD133
pos celler
vs
5 ± 1,5% i ARO /CD133
neg, noe som tyder på pluripotente stamceller funksjoner i ARO /CD133
pos celler (figur 7B). Disse data ble bekreftet ved semikvantitativ PCR, ved bruk av nTERA2 cellelinje som positiv kontroll (figur 7C). Kvantifisering, uttrykt som relativ til nTERA2 tetthet, viste oktober-4 mRNA nivåer i ARO /CD133
neg celler nesten to ganger lavere enn i ARO /CD133
pos (35%
vs
henholdsvis 62% med nTERA2 = 100%)
(A) QRT-PCR av TTF-1 mRNA uttrykk i ARO /CD133
pos og CD133
neg celler.; TAD-2-cellelinjen ble brukt som positiv kontroll. (B) Flowcytometri analyse av oktober-4A i ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg celler. Svart linje representerer positiv farging for oktober-4A viser grå linje negativ kontroll med matchet isotype antistoff. (C) semikvantitativ RT-PCR av oktober-4 mRNA i ARO /CD133
pos og ARO /CD133
neg celler. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. nTERA2 cellelinjen ble brukt som positiv kontroll. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter
Membranen stamcellemarkører c-Kit -. Uttrykt i ESCs (embryonale stamceller) – og THY-1 – typisk for mesenchymale og blodkreft stamceller – var negative (data ikke vist).
Diskusjoner
i de siste årene har flere studier har blitt publisert som støtter hypotesen om at svulster oppstår fra heterogene cellepopulasjoner med ulike biologiske egenskaper. Nylig har det blitt foreslått at stamceller, karakterisert ved at selvfornyelse og differensiering evne, kan spille en rolle i utviklingen av kreft [29], [30]. Siden flere mutasjoner som oppstår over mange år er nødvendig før en celle blir cancerous, stamceller med lang levetid kan være de beste kandidatene for akkumulere slike kreftfremkallende heterogene celler [5], [31]. Det er imidlertid ikke klart ennå om hvorvidt disse cscs stammer fra dedifferentiation av modne celler i organer eller fra fastboende stamceller som gradvis tilegne seg en ondartet fenotype [32].
ATC er en av de mest aggressive endokrine svulster preget av høy grad av dedifferentiation [1]. Eksistensen av fastboende thyroid stamceller kan forklare både vedvarende spredning og heterogenitet av ATC lesjoner [4]. Takano et al. hypotese om at et nært forhold mellom stamceller og kreftutvikling kan eksistere i ATC [17], [26], [33]. ATC-genekspresjon foreslått profil minst tre typer av udifferensierte celler som sin opprinnelse: thyroid stamceller, som uttrykker onfFN mRNA, men ikke Tg, med høy differensiering potensial, selvfornyelse og evne til å generere anaplastiske karsinomer; thyroblasts, uttrykker både Tg og onfFN mRNA og ikke danner follikler; prothyrocytes, som er mer differensiert enn thyroblasts, uttrykker Tg men ikke onfFN mRNA, med evnen til å danne follikler. Mitsutake et al. har identifisert en svært liten side befolkningen (SP), høyanriket for stamceller, i flere menneskelige skjoldbrusk kreft cellelinjer. Men både SP
pos og SP
neg bestander dannet svulster når transplantert i nakne mus, viser at kreft stamceller lignende celler er ikke eksklusiv eller identisk med SP celler [16].
I studien, vi selv hevder at ATC kan stamme fra skjoldbruskkjertelen stamceller. Vi beskriver CD133
pos celler med fenotypiske egenskapene til stamceller, som vokser uten å danne follikler. Men blant de fire cellelinjer analysert, bare ARO og KAT-4 viste høy andel av CD133
pos celler (64 ± 9% og 57 ± 12%, henholdsvis Fig. 1a). Våre resultater er konsistente med nylige observasjoner om svært aggressiv hepatoma cellelinjer, også preget av svært høy andel av CD133
pos celler [34]. Høy CD133 uttrykk i ATC kan derfor forbundet med tumor aggressivitet. Men fraværet av denne markøren i KAT-18 og FRO cellelinjer, tyder på at tilstedeværelsen av CD133 er ikke tilstrekkelig og andre markører fortsatt trenger å bli identifisert. I tillegg, som rapportert av Takano et al. [17], fant vi at ARO og KAT-4 cellelinjer uttrykte onfFN men ikke Tg, TPO og NIS, bekrefter deres udifferensiert status.
For å bedre karakterisere de funksjonelle og fenotypiske funksjoner av disse antatte cscs i ATC, vi studerte sorterte ARO /CD133
pos celler. ARO /CD133
pos celler viste høyere celleformeringshastigheten i forhold til CD133
neg-celler (fig. 4A og B). Videre ble det selvfornyelse evne ARO /CD133
pos celler bekreftet av nedgang i CD133 uttrykk parallelt med økning i cellevekst, og dermed tyder asymmetrisk divisjon, dvs. produksjon av CD133
pos og CD133
neg datter celler. Imidlertid kan andre enn asymmetrisk divisjon (f.eks CD133 post-transcriptional nedregulering) mekanismer ikke utelukkes. Minimal celledød prosenter utelukke at nedgangen i CD133 uttrykk skyldes apoptose (mindre enn 2%).
Videre bekreftelse på at de fleste av de ARO /CD133
pos celler kan være stamceller /progenitorceller kommer fra uttrykk analyse av andre gener relatert til «stemness». Selv om stamcellemarkører c-Kit og THY-en var negativ, ble en sterk positivitet funnet for oktober-4. Oktober-4 tilhører POU (Pit-Oct-Unc) familie av transkripsjonsfaktorer som formidler pluripotency i ESCs gjennom hemming av vev-spesifikke og markedsføring av stamcelle gener [22], [23]. ARO /CD133
pos sortert celler var sterkt positiv for oktober-4A i forhold til ARO /CD133
neg celler, og deres uttrykk var lik som nTERA2 embryonale teratom cellelinje. Primerne og det monoklonale antistoff som brukes i våre eksperimenter for den kjernefysiske spleisevariant OKT-4A utelukke enhver pseudogen forurensning eller gjenstander [24].
atom thyroid spesifikk transkripsjonsfaktor TTF-1 er et homeodomain-inneholdende protein som tilhører til den Nkx-2 klasse av homeobox gener, som er nødvendig for riktig thyroid utvikling og blir brukt som en markør av skjoldbruskkjertelen og lungekarsinom [35]. TTF-1 uttrykk ble funnet signifikant høyere i ARO /CD133
pos enn i ARO /CD133
neg celler, med mRNA nivåer sammenlignbare med TAD-to fosterskjoldbruskcellelinje (positiv kontroll). Dette innebærer at selv om alle ATC cellelinjer er dedifferensierte (fraværende uttrykk for skjoldbrusk-spesifikke gener som Tg, TPO og NIS og positivitet for onfFN), i ARO /CD133
poscells en markør for thyroid organogenesen er fortsatt opprettholdt.
Videre, for å karakterisere disse funksjonelt antatte kreft stilk-lignende celler, testet vi følsomhet overfor de mest vanlige cytostatika som brukes i ATC, dvs. cisplatin, doksorubicin og etoposid. Cisplatin kryssbinder DNA på flere forskjellige måter interfererer med celledeling ved mitose, samvirker med doxorubicin-DNA ved interkalering og inhibering av makromolekylær biosyntese og etoposid hemmer enzymet topoisomerase II [36] – [38]. ARO /CD133
POS-celler viste en betydelig motstand mot alle legemidler som brukes på hvert tidspunkt i forhold til ARO /CD133
neg celler, som demonstrert av markert lavere apoptose nivåer oppdaget via caspase 3 (Fig. 6). Potensialet induksjon av antiapoptotic snarere enn apoptotiske molekyler, eller blokkering av thyrocyte fysiologiske celle-omsetning regulatoriske mekanismer, demonstrert i andre skjoldbrusk sykdommer, slik som autoimmun thyroiditis [39], kan forklare den ervervede evnen til thyroid stilk-lignende celler for å bli motstandsdyktig til kjemoterapi.
