Abstract
Serum microRNAs holde store løftet som er lett tilgjengelig og målbare biomarkører av sykdom. I prostata cancer, har serum miRNA signaturer vært forbundet med nærværet av sykdommen, så vel som korrelerte med tidligere validerte risikomodeller. Det er imidlertid uklart om mirnas kan gi uavhengig prognostisk informasjon utover dagens risikomodeller. Her fokuserer vi på en gruppe av lav-risiko pasienter med prostatakreft som var kvalifisert for aktiv overvåking, men valgte kirurgi. A viktige kriterier for den lave risikoen kategorien er en Gleason score på 6 eller lavere basert på pre-kirurgisk biopsi. Imidlertid er en tredjedel av disse pasientene oppgradert til Gleason 7 på innlegget kirurgiske patologisk analyse. Både i et funn og en validering kohort, finner vi at pre-kirurgiske serumnivåer av MIR-19, MIR-345 og MIR-519c-5p kan bidra til å identifisere disse pasientene uavhengig av deres pre-kirurgisk alder, Ptil, scene, og prosent biopsi engasjement. En kombinasjon av de tre mirnas økte arealet under en mottaker operatør karakteristikk 0,77 til 0,94 (
p
0,01). Også, når kombinert med den risiko modellen CAPRA miRNA signaturen betydelig forbedret forutsigelse av pasienter med Gleason 7 sykdom. In-situ hybridiseringer av matchende svulster viste MIR-19 oppregulering i transformert versus normal-vises svulst epitel, men uavhengig av svulst klasse foreslå en alternativ kilde til økningen i serum MIR-19a /b nivåer eller utgivelsen av pre-eksisterende intracellulær MIR -19a /b på progresjon. Sammen utgjør disse dataene viser at serum mirnas kan forutsi relativt små skritt i tumorprogresjon bedre kapasitet til å forutsi sykdomsrisiko, og derfor potensielt kjøre kliniske avgjørelser i prostatakreftpasienter. Det vil være viktig å validere disse funnene i en større multi-institusjonelle studie samt med uavhengige metoder
Citation. Wang SY, Shiboski S, Belair CD, Cooperberg MR, Simko JP, Stoppler H et al . (2014) MIR-19, MIR-345, MIR-519c-5p serumnivåer Tippe Adverse Pathology i prostatakreftpasienter Kvalifisert for aktiv overvåking. PLoS ONE 9 (6): e98597. doi: 10,1371 /journal.pone.0098597
Redaktør: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Italia
mottatt: 12. august 2013, Godkjent: 05.05.2014; Publisert: 03.06.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av National Institutes of Health R21 CA161615 og en privat donasjon av John og Donna Shoemaker. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mens prostataspesifikt antigen (PSA) maskerings har sunket PCA dødelighet i USA, det har gjort det på bekostning av å oppdage tidlig stadium /klasse PCa som kanskje ikke påvirke pasientens liv hvis ubehandlet (diagnostikk) [1] – [4]. Behandling av de med lav risiko sykdom resultater i unødvendige tilleggslidelser forbundet med radikale tiltak som kirurgi eller stråling (overbehandling) [5].
Aktiv overvåking (AS) er en strategi utviklet for å redusere behandling av pasienter med lav risiko PCa. Slike pasienter overvåkes med fysiske eksamener, selektiv bildebehandling, serie PSA vurderinger, og gjenta biopsier. Behandlingen deretter tilbudt til de som har tegn på progresjon. Kandidater for aktiv overvåking protokoller inkluderer de med en biopsi Gleason grad av seks eller mindre (ingen mønster 4 eller 5), PSA 10 ng /ml eller mindre, og scenen T1 eller T2 sykdom [6]. Selv om bevis fra flere institusjoner tyder på at AS er et levedyktig alternativ for menn med lav risiko PCA er det betydelige feilklassifisering priser når identifisere kandidater til AS [6], [7]. I en studie av pasienter som oppfyller kriteriene for AS, men gjennomgikk umiddelbar radikal prostatektomi 28% ble funnet å ha en høyere Gleason grad og 21% ble funnet å ha T3 sykdom på kirurgisk patologi [8].
Flere risikomodeller beregnet å forutsi post-kirurgisk patologi i lav-risiko pasienter som bruker kliniske kjennetegn som alder, Ptil, scene, omfang av tumor engasjement innen biopsier har blitt utviklet. Men de viser en nøyaktighet på bare 61-79% kompliserer beslutnings [9]. På grunn av begrensninger i PSA som et surrogat for sykdomsutvikling og betydelige legitime bekymringer om biopsiutvalgsfeil, både pasienter og leger er bekymret for at forsinket behandling kompromitterer evnen til å helbrede sykdom [10]. Nye markører som pålitelig skille mellom lav-risiko versus middels /høy-risiko sykdom ville være en løsning for å optimalisere AS protokoller.
Økende bevis tyder microRNAs (mirnas) som potensielt lovende markører for ulike kreftformer [11]. Disse små, enkeltkjedet, ikke-kodende RNA-molekyler er involvert i post-transkripsjonell genregulering og ha en endret ekspresjonsprofilen i PCa vev [12] – [14]. I tillegg har mirnas detektert i serum blitt brukt til å identifisere pasienter med PCa, noe som tyder deres potensial som en del av et panel av serum-baserte markører [15], [16]. Tidligere brukte vi et mikrofluidbaserte multiplex kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaction (QRT-PCR) metode for å identifisere serum miRNA signaturer i menn med PCa som forbinder med den validerte Kreft i prostata Risk Assessment (CAPRA) score for risikovurdering [17 ]. Men denne tidligere studie ikke avgjøre om noen av disse miRNAs kan gi selvstendig prognostisk verdi. Derfor, her ønsket vi å identifisere et serum miRNA signatur som kan subcategorize pre-kirurgiske pasienter med lav risiko vurdering score til de med større eller mindre risiko for progresjon. På grunn av den lange oppfølgings nødvendig for å identifisere pasienter som klinisk fremgang og relativt kort tidsrom hvor AS har vært i praksis, vi evaluert post-kirurgisk patologi som surrogatmarkør. Vi fant en tre miRNA signatur som kunne forutsi verre patologisk sykdom enn antatt basert på pre-kirurgisk biopsi. Vi foreslår at en slik signatur har potensial til å identifisere et stort antall pasienter som er lite sannsynlig å dra nytte av umiddelbar kirurgi (dvs. lav klinisk poengsum kombinert med et fravær av en positiv miRNA signatur), selv om en slik konklusjon venter et større tverrinstitusjonelt studie med langsiktig oppfølging.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Serum og vevsprøver samt kliniske data ble samlet inn mellom 2002 og 2012. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke til å ha sine prøver og koblede kliniske data banked for kliniske og grunnleggende forskningsformål. UCSF Committee on Human Forskning godkjent samtykkeprosessen. For denne studien ble alle prøver og data avidentifisert, og derfor ikke krever noen ekstra IRB godkjennelse.
Studiedesign
Undersøkelsen utformingen fulgt prinsippet om potensielle prøveinnsamling og retrospektiv blindet evaluering (probe) utforming [18] og rapporteres å følge retningslinjene REMARK [19]. Alle serumprøver ble oppsamlet rutinemessig ved tidspunktet for kirurgi etter induksjon av anestesi, men før eventuelle prosessuelle intervensjon og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) radikal prostatektomi vevsblokker ble arkivert og tilgjengelig for analyse.
Pasientene inkludert i studien var de velger for umiddelbar radikal prostatektomi som møtte UCSF lav-risikokriterier for AS inkludert biopsi Gleason 2-6 (ingen mønster 4 eller 5), PSA mindre enn 10 ng /ml, mindre enn 34% av biopsi kjerner som er involvert, mindre enn 50% innblanding i en enkelt kjerne, og klinisk T1-T2 stadium sykdommen. En patologisk Gleason score på 7 med høyere er forbundet med en økt risiko for PCa dødelighet [20], og derfor ble anvendt for å definere uønskede patologi. Oppdagelsen kohorten besto av 48 pasienter med post-kirurgisk patologisk Gleason score på 7 eller høyere (case-gruppen) og 48 pasienter med patologisk Gleason score på 6 (kontrollgruppen). En validerings kohorten besto av 25 tilfeller og 35 kontroller. Pasientene ble valgt ut fra tilgjengelige prøvene opprettholdt i en UCSF vev bank. Pasienter montering kriteriene ovenfor ble valgt ut fra det tilgjengelige området basert på et tilfeldig heltall generator. En skjematisk av studiedesign er avbildet i figur 1.
Microfluidics basert multipleks QRT-PCR profilering av miRNAs
En microfluidic baserte multiplex QRT-PCR-metoden ble brukt til å oppdage mirnas som tidligere beskrevet [17]. Biblioteker for 672 stilk-løkke primere, termin primere, og TaqMan prober som representerer mest kjente menneskerettighets mirnas sekvenser (sekvenser på https://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols/miRNAqPCRsequences.txt) ble brukt. Hver microfluidic rekke evaluert uttrykket av 96 mirnas for 96 prøver. Totalt 7 arrays ble utført på oppdagelsen kohort (672 miRNA analyser). En matrise ble utført på validerings kullet fokusere bare på de detekterte mirnas (se nedenfor) i oppdagelsen kullet.
Amplification plott og terskelsyklus (Ct) verdier, er et mål på det antall PCR-sykluser for å oppnå en terskelen linjen ligger innenfor den eksponentielle fasen av forsterkning, ble hentet fra proprietær programvare på BioMark system (Fluidigm). En høyere Ct reflekterer lavere inngang av målt miRNA. Ct-verdier ble bekreftet gjennom kvalitet analyse av forsterkning plott. Mirnas med høy Ct-verdi (Ct 30) i 70% av prøvene ble ansett uoppdaget og ekskludert fra analysen. Normalisering ble utført for å median Ct-verdien av alle detekterte mirnas innenfor en tabell for hver enkelt pasient, noe som resulterer i en ΔCT verdi (tabellene S1-2). Normalisering ble utført på kontoen for systematiske variasjoner i miRNA uttrykk nivåer på tvers av enkeltpersoner og matriser, slik at biologiske forskjeller kan være mer lett skilles [21]. Men analyse av un-normaliserte data, kontrollert for mengde innspill serum førte til analoge funn. Identiteten av prøvene var maskert til ΔCT verdier ble innhentet.
Statistical Analysis
Innledende analyser i forhold distribusjoner av normalisert ΔCt verdier fra mirnas mellom saker og kontroller i oppdagelsen prøven ved hjelp av grafiske oversikter og Wilcoxon rank sum test for å vurdere betydning. Logistikk regresjonsmodeller ble deretter montert på kandidat mirnas enkeltvis, justert for alder, PSA, scene, og graden av biopsi engasjement blant prosent kjerner svulst positive og prosent av total lengde på kjerner involvert. Kandidat mirnas ble inkludert i modellene både som kontinuerlige tiltak, og som binære kategoriske variabler. Cut-off verdier for sistnevnte ble bestemt ved bruk av separate klassifisering tre modeller eller ved median for hver miRNA. Begge cut-offs ga lignende resultater.
Tippe ytelsen modeller ble preget ved hjelp av mottakeren opererer karakteristikk (ROC) arealet under kurven (AUC) verdier. En egen analyse basert på et tilfeldig skog klassifiseringsmodell [22] Det ble også gjennomført blant alle påvisbare mirnas samt alder, PSA, scene, og graden av biopsi engasjement som prediktorer. Resultatene av denne analysen ble brukt for å gi en uavhengig vurdering av variabel betydning, og for bekreftelse av resultatene fra de enklere logistiske modeller
For validering årsklasse, bare de mirnas som ble oppdaget i . 30% av prøvene i oppdagelsen kullet ble målt. Normalisering til alle oppdagede mirnas kjører på en enkelt rekke endret bredden ofΔCt verdier for en gitt miRNA, ofte bedre forskjeller mellom saker og kontroller. Analytiske tilnærminger beskrevet ovenfor for oppdagelsen ble likeledes brukt i valideringen kohort. Endelige analyser fokusert på mirnas oppdaget som viktige prediktorer i oppdagelsen kohort som også var viktig i valideringssettet. Bare markører med justerte
p
-verdier (basert på falske funnrate metoder) på maksimalt 0,1 i funn analyser ble vurdert. Disse ble modellert enkeltvis og i fellesskap i logis regresjonsmodeller også kontrollerer for de samme egenskapene vurderes i analysene for oppdagelsen kohort. I tillegg undersøkte vi bruken av utvalgte mirnas å supplere godt validert CAPRA scorer [23] som en indeks for sykdomsrisiko som beskrevet i mer detalj i resultater.
Ytterligere deskriptive analysene ble utført for å sammenligne valgte pasient egenskaper mellom funn og validering kohorter. Formell testing var basert på Fishers Exact test (for kategoriske egenskaper) og Wilcoxon rank-sum test (for kvantitative egenskaper).
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av R (versjon 3.02) og Stata (versjon 13.1).
in-situ hybridiser
Lysbilder med seksjoner (5 mikrometer) av FFPE- tumorprøver fra pasienten kohorten ble deparaffinized i Xylen og hydrert gjennom å redusere etanolkonsentrasjonen i PBS. Glassene ble deretter behandlet med 300 ul proteinase-K (15 pg /ml i PK-buffer, 5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl) ved 37 ° C i en hybridizer (Dako) i 10 minutter . Etter to PBS-vaskinger, Snittene ble dehydrert ved å øke etanolkonsentrasjoner og lufttørket i 15 minutter. Dobbelt DIG-merkede bundne nukleinsyre (LNA) prober (Exiqon) for individuelle mirnas ble denaturert ved oppvarming ved 90 ° C i 4 minutter og deretter fortynnet til 40 nM ved hjelp av in situ hybridisering buffer (Enzo Life Sciences). Snittene ble hybridisert med 50 ul fortynnet sonde ved 54 ° C over natten og deretter vasket i nedad SSC-konsentrasjonen ved hybridiseringstemperaturen. Etter en 5 minutters inkubasjon i 0.2xSSC ved romtemperatur, ble platene vasket i PBS og blokkert med 2% blokkeringsløsning (Roche) i 15 minutter. Snittene ble så behandlet med alkalisk fosfatase (AP) -konjugert anti-DIG (Roche) fortynnet 1:800 i blokkeringsløsning inneholdende 2% saueserum i 60 minutter. Etter to vaskinger i AP-buffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20, 2 mM levamisol), ble seksjonene inkubert i BM Blue AP substrat (Roche) i mørke ved 4 ° C natten over. Objektglassene ble deretter vasket to ganger i PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og vasket to ganger i vann. Etter en 30 andre behandling med Nuclear-Fast Red (Vector), lysbildene var dehydrert om økende etanolkonsentrasjoner deretter montert. De fargede objektglass ble vurdert og gradert blindt.
Resultater
miRNA profilering i Discovery Cohort
Vi forsøkte å finne ut om mirnas fra pre-kirurgisk serumprøver kunne forutsi post-kirurgisk patologisk oppgradering. Kliniske kjennetegn ved pasientene i vår oppdagelse kohort er oppsummert i tabell 1. sak (post-kirurgisk Gleason 7) og kontroll (post-kirurgiske Gleason 6) grupper hadde lignende distribusjoner av rase og kliniske kjennetegn. Tilfellene var betydelig eldre enn kontrollene (
p
= 0,005). PSA nivåer også var noe høyere i tilfeller (
p
= 0,07). Av de 672 mirnas testet, 36 hadde Ct 30 i minst 30% av pasientene, som vi etablerte som en cutoff for påvisning (tabell 2). Mange mirnas eksistere som klynger, hvor to eller flere mirnas er produsert fra en enkelt karakterutskrift. Ni av de 36 miRNAs er medlemmer av en enkelt klynge, det miR17-92 klyngen. Mirnas er også gruppert i familier basert på en felles sekvens på deres 5 «enden kalles frøet sekvens, som i stor grad definerer sine nedstrøms mål [24]. MIR-17, MIR-20a, MIR-92a, og MIR-106a, for eksempel, er alle en del av en familie. Derfor, på tvers av alle disse PCA pasientene var det en tilsynelatende berikelse for spesifikke klynger og familier i mirnas.
neste forhold serumnivåene av 36 oppdaget mirnas mellom sak og kontrollgruppene av funnet kohort. Fire av de oppdagede mirnas viste forskjeller i serumnivåer mellom sakene og kontroller. MiR-19a og Mir-19b vises lavere ΔCt verdier i tilfelle gruppen sammenlignet med kontroller (figur 2a,
p
= 0,06 og
p
= 0,07 henholdsvis), i samsvar med høyere serumnivåer i saker. Omvendt, MIR-345 og MIR-519c-5p hadde betydelig høyere ΔCt verdier i tilfelle gruppen sammenlignet med kontrollene (figur 2a,
p
= 0,04 og
p
= 0,02 henholdsvis) , i samsvar med lavere serumnivåer i tilfelle gruppen. Logistisk regresjon modeller for å forutsi sak /kontroll status basert på enkelt mirnas representert som binære indikatorer (med cut-off verdier som er valgt ved hjelp av klassifiserings trær) viste alle fire mirnas som svært signifikant prediktor for utfallet status (odds ratio) selv når man kontrollerer for alder, PSA , klinisk stadium og grad av involvering biopsi (tabell 3). Resultatene ikke var følsomme for om mirnas ble inkludert i prediksjonsmodeller som kontinuerlige variabler eller som binære indikatorer basert på median påvisbare nivåer (data ikke vist). En nonparametric tilfeldig skogen klassifikator inkludert alle påvisbare mirnas (representert som kontinuerlig måler) samt alder, PSA, scene, og biopsi engasjement rangert følgende Predictor variablene som de seks viktigste (i synkende rekkefølge): alder, MIR-519c-5p , miR_19b, MIR-345, Ptil og miR_19a (figur 3). Ingen av de andre målte mirnas var signifikant assosiert med utfall status.
Delta Ct representerer forskjellen mellom Ct av individuelle miRNA og median Ct verdi blant oppdaget mirnas innenfor hver pasient. Horisontale barer representerer gjennomsnittet +/- SEM.
variabler Inkludert er oppført på den vertikale aksen, med tilsvarende variabel betydning for hver enkelt på den horisontale aksen, er betydningen bestemmes ved hjelp av «betinget permutasjon nøyaktighet», beregnet som en gjennomsnittlig forskjell i modellnøyaktighet mellom tilpassede modellen og alternative versjoner som oppnås via tilfeldige permutasjoner av de variable verdier. Variablene regnes signifikant prediktor i tilfeldig skogen hvis deres variable betydning verdi er over den absolutte verdien av den laveste negativ-scoring variabel [43].
Validering av miRNA signatur i uavhengig kohort
for å bekrefte våre miRNA foreninger, utførte vi en valideringsstudie med fokus bare på de mirnas som var tiltaket i minst 30% av pasientserumprøver (tabell 2). Pasienten egenskaper for validering kohorten er oppsummert i tabell 1. I likhet med oppdagelsen årsklasse, var det ingen statistisk signifikante forskjeller i rase, eller klinisk stadium mellom saker og kontroller, mens forskjeller i alder og PSA var signifikant (
p
= 0,002 og 0,04 henholdsvis). Som det sees i oppdagelsen kohort, MIR-19b og MIR-19a viste signifikant lavere ΔCt verdier i tilfellet gruppen sammenlignet med kontrollene (figur 2B). Ja, forskjellene var enda mer slående i valideringen kohort (
p
0,001 for begge), sannsynligvis på grunn av normalisering basert på alle oppdagede mirnas på en enkelt array (versus spredt over flere arrays i oppdagelsen kohort) . I motsetning til Mir-19b og MIR-19a, forskjellene i ΔCt verdier for MIR-345 og MIR-519c-5p mellom sakene og kontrollene var ikke statistisk signifikant (figur 2b,
p
= 0,333 og
p
= 0,154, henholdsvis). Men i modeller justere for alder og PSA, MIR-345 og MIR-519c-5p forble signifikant når inkludert som binære prediktorer (se nedenfor). Resultatene for analysene inkludert MIR-519c-5p var basert på 55 pasienter (24 saker og 31 kontroller) på grunn av manglende verdier for denne variabelen som følge av mislykkede PCR reaksjoner hos 5 pasienter.
prognostisk verdi av tre-miRNA signatur
for å vurdere muligheten av de bekreftede mirnas å diskriminere pasienter med negativ patologi i valideringssettet, ble de inkludert i logis regresjonsmodeller også justert for alder, stadium, PSA, og omfanget av biopsi engasjement. Når vurderes individuelt, alle fire mirnas viste sterke assosiasjoner med saksstatus, med odds ratio på 9,22, 12,67, 0,03 og 0,06 (
p
verdier 0,01) (Tabell 3), men på grunn av den relativt lite utvalg størrelse, konfidensintervall for estimerte odds ratio viste lav presisjon. Disse mirnas individuelt også viste bedre diskriminerende evne med AUC for 0,85, 0,86, 0,84, og 0,83 i forhold til en AUC på 0,77 for en modell med bare alder, PSA, scene, og biopsi involvering (tabell 3). Disse forbedringene oppnådde ikke betydning på 5% nivå (selv om resultater for Mir-19b og MIR-345 var signifikante på 10% nivå). Neste vi evaluert modeller ved hjelp av ulike kombinasjoner av de mirnas (tabell 4). Spesielt, MIR-19a og Mir-19b syntes å være co-avhengige, i samsvar med det faktum at de er uttrykt fra en felles avskrift, MIR-17-92. Modeller som består av en kombinasjon enten MIR-19a eller Mir-19b sammen med MIR-345 og MIR-519c-5p viste en AUC på 0,94, og nådde høy betydning (
p
= 0,02 og 0,017 henholdsvis) (tabell 4 og figur 4a).
A) ROC kurver for alder, PSA, og scenen pluss /minus individuelle mirnas eller kombinasjon av alle 3 miRNAs. B) Prosent av pasienter med Gleason 6 (lys grå) eller Gleason 7 (mørk grå) etter operasjonen i forhold til pre-kirurgi CAPRA poengsum. C) Samme som B, men med tillegg av miRNAs. En verdi på 1 er gitt for hver positiv miRNA og lagt til CAPRA poengsum. CAPRA nomogram kombinerer følgende variabler: alder ved diagnose, PSA ved diagnose, Gleason score på pre-kirurgisk biopsi, klinisk stadium, og Prosent av involverte biopsier
For å identifisere en scoring. mekanisme tilgjengelig for leger og deres pasienter, vi evaluert nytten av å legge miRNA verdier til en etablert risikomodellen, scorer CAPRA [23]. Spesielt vår kohort hadde lave CAPRA score (alt 0-2 av 10) som forventet for AS-kvalifiserte pasienter. Ved å legge til ett poeng til poengsummen for hver av de tre mirnas (MIR-19a eller 19b, MIR-345, og MIR-519c-5p) som ble observert å overskride den binære verdien cutoff, kan pasientene deles inn i de som sannsynligvis vil ha Gleason 7-og dermed middels risiko-sykdom versus de som ikke gjorde det (Tall 4b-c). Den lineære trenden var svært signifikant (
p
0,001). Faktisk 100% av pasienter med en score på 4 eller 5 hadde Gleason 7 sykdom etter kirurgisk versus 7 av 24 pasienter med score til 1 eller 2.
Hvor stammer
serum mirnas
de udekkede serum~~POS=TRUNC mirnas kan oppstå direkte fra tumoren eller fra kroppens respons på svulsten. For å avgjøre om de prediktive mirnas er til stede i prostatakreft, vi utført i situ hybridiseringer med prober for Mir-19b på FFPE- tumorprøver fra pasienter i vår kohort (
n
= 10). Vi fokuserte på Mir-19b som den nådde betydning i både oppdagelse og valideringssett. Merk at Mir-19b probe er usannsynlig å diskriminere mellom MIR-19a og Mir-19b på grunn av deres høyt lignende sekvenser. Farging for MIR-19b var sterk i områder med høy grad av PIN, Gleason mønster tre, og Gleason mønster 4, men fraværende i normal vises epitel (figur 5). Men det var ingen åpenbare forskjellen i intensitet av farging med økende grad fra PIN til Gleason mønster 4. Derfor, mens MIR-19 cellulære nivåer klart økt med transformasjon, det var uklart om det var noen ytterligere økning i cellene med patologisk progresjon.
Bildene viser in situ hybridisering farging for Mir-19b (venstre og midtfelt) og negativ kontroll, MIR-295 (høyre panel). Mest panelene viser område av prostata intraepitelial neoplasi (PIN). Midt panelene viser området Gleason 3. Bottom panelene viser området Gleason 4. Områder i PIN, Gleason 3, og Gleason 4 all flekk på det sterkeste for Mir-19b probe (blå flekker). Legg merke til hvert panel har areal av normal-vises epitel, mest tydelig ses på venstre side av hver midtseksjon. Disse områdene viser mye lavere farging. Høyre og venstre paneler, 100 × forstørrelse. Midtfelt, 400 × forstørrelse. Midtfelt representerer eske områder i venstre panel.
Diskusjoner
Som post-transcriptional regulering av genuttrykk, mirnas fungere som både onkogener og tumor dempere [25], [26]. Avvikende miRNA signaturer er påvist i prostata tumorprøver og er påvist i serum hos menn med PCa [12] – [16], [27], [28]. Vi har tidligere identifisert en miRNA signatur i forbindelse med pasientens risiko som beregnes ved CAPRA score, som forutmetastaser, PCA dødelighet, og totaldødelighet [17]. Men ingen av disse tidligere studier adressert om mirnas kunne gi ytterligere informasjon utover det som kan bli spådd av aktuelle parametere inkludert PSA, bildebehandling, og biopsi. Her har vi oppdaget og validert fire serum mirnas, MIR-19a, MIR-19b, MIR-345, og MIR-519c-5p som i kombinasjon, og når til gjeldende parametere, betydelig forbedret prediksjon av uønskede patologi i prostata. Individuelt, bare MIR-19a /b nådd betydning i både oppdagelse og valideringssett.
En prognosemodell blant annet alder, Ptil, scene, og biopsi engasjement viste en AUC-verdien på 0,77 i å identifisere uønskede patologi i post- kirurgiske prøver, tillegg av 3 mirnas (MIR-19a eller Mir-19b pluss MIR-345 og MIR-519c-5p) viste en AUC-verdien på 0,94. Videre inkludering av miRNA signatur i en dag brukes risiko score (CAPRA) forbedret prediksjon av post-kirurgiske oppgraderingen støtter sin kliniske nytte. Disse forbedringene er den første demonstrasjonen til vår kunnskap om den uavhengige prediktiv verdi for serum mirnas over tilgjengelige clinicopathological tiltak i en svært relevant scenario. Mens nesten 50% av nydiagnostiserte pasienter nå møtes de med lav risiko kriteriene for AS protokoller, bare 10% av disse pasientene gjennomgå AS [29], [30]. Å ha flere markører som kan videre skille pasienter vil være avgjørende for å forbedre disse tallene.
Serum-baserte markører er en fordel ettersom slike tester er relativt ikke-invasiv og kan enkelt brukes til å overvåke pasienter. Markører som oppnås fra serum unngå bekymringer for biopsi prøvetaking feil, noe som er en betydelig begrensning av vev-baserte assays [31], [32]. Opprinnelsen til mirnas i humant serum fortsatt i stor grad uklart. In situ hybridisering på prostata prøver fra pasienter i vår kohort viste tilstedeværelse av MIR-19b i alle områder av forvandlet epitel høyverdig PIN til Gleason 4 mønster. I motsetning liten eller ingen farging ble observert i stroma eller normal vises epitel. Nærværet av MIR-19b innenfor den lave grad av tumorvevet, men forminskede nivåer i serum svarende reiser spørsmålet om kilden til miRNA i serum fra pasienter med høyere grad av tumorer. En spennende mulighet er at MIR-19b er bare utskilles ved progresjon selv om det blir uttrykt innenfor de transformerte celler i tidlig tumorutvikling. Alternativt kan cellene trenger for å bryte strukturelle elementer innenfor vevet for MIR-19b for å nå blodet. Til slutt kan de mirnas stammer fra kroppens respons på svulsten (f.eks immunrespons). I sammendraget, de cellulære opprinnelse for endringene i miRNA nivåer i serum med patologisk progresjon gjenstår å fastslå.
MIR-19 er en del av gruppen av miRNAs bearbeidet fra en enkelt avskrift, MIR-17-92 klynge [9]. Denne klyngen gir seks modne mirnas (MIR-17, MIR-18a, MIR-19a, MIR-20a, MIR-19b, MIR-92) og ligger på 13q31.3, en region forsterkes i flere blodkreft og solide tumor malignitet [ ,,,0],33] – [35]. I en B-celle lymfom modell, over-ekspresjon av
MIR-17-92
med
c-myc
fremmer tumordannelse, noe som viser den onkogene aktiviteten av klyngen [35]. MIR-19 ser ut til å være en viktig onkogen del av
MIR-17-92
ved å målrette den tumor suppressor,
PTEN
, noe som resulterer i aktivering av Akt-mTOR vei [36], [ ,,,0],37]. Gitt veldokumentert rollen
PTEN
i prostatakreft, og at endring er funnet i 30-70% av pasientene ved diagnosetidspunktet, virker det svært sannsynlig at heving av MIR-19a MIR-19b sett i vevet er funksjonelt forbundet med tumorutvikling [38] – [40]
Andre serum mirnas som er forskjellige fra de som er avdekket her har blitt funnet å være forhøyet i prostatakreftpasienter.. En spesielt praktisk eksempel er Mir-141, som er blitt vist å være forhøyet i prostata kreftpasienter med langt fremskreden sykdom, slik som i de med lymfeknute eller benmetastase [15], [27], [28]. I vår studie ble MIR-141 ikke påvist hos pasienter som oppfyller lav-risikokriterier for AS. Derfor, selv om MIR-141 kan være en potensiell markør for pasienter med mer avansert PCA er det usannsynlig å ha verdi for kandidater AS beslutter å gjennomgå radikal behandling. I tillegg til sykdomstilstand, kan motstridende resultater blant studier også være på grunn av variasjoner mellom fremgangsmåter for serum miRNA profilering. Individuelle QRT-PCR-baserte protokoller og microarray analyser kan gi ulike miRNA signaturer. Selv om det foreløpig ingen gullstandard for serum miRNA deteksjon, har vi tidligere vist at vår multiplex QRT-PCR-metoden er nøyaktig ved å måle miRNA nivåer i knockout-systemer mangler kanoniske eller begge kanoniske og ikke-kanoniske mirnas [17].
i denne studien ble negativ patologi definert som en Gleason score på 7 på post-kirurgiske prøven. En Gleason score på 7 er forbundet med økt risiko for sykdom spesifikk dødelighet og er fortsatt den beste enkelt prediktor for atferd sykdom [20]. Men en Gleason score på 7 er ikke en garanti for fremtidig klinisk progresjon. Nyere studier tyder på at selv middels risiko pasienter med Gleason score på 7 demonstrere utmerket overlevelse på AS med kort til middels oppfølging [41]. Ettersom flere pasienter melde deg på AS og data fra pågående studier modne, vil studier må utføres for å fastslå om mirnas forutsi fremtiden metastaser eller sykdomsspesifikke dødelighet. I tillegg vil potensielle studier være nødvendig for å avgjøre om de er verdifulle verktøy for å overvåke pasienter mens gjennomgår AS.
I konklusjonen, denne studien identifiserer et serum miRNA signatur som kan fungere som en uavhengig prognostisk markør ved PCA. Videre viser det hvordan serum mirnas kan brukes for å identifisere forholdsvis små skritt i tumorprogresjon slik at økende klinisk forbedring av sykdomsstatus. Fremtidige studier vil være nødvendig for å validere disse markørene i en stor kohort på tvers av institusjoner, så vel som å assosiere med langsiktige resultater, spesielt pasient sykelighet og dødelighet.
