Abstract
Transitional karsinom (TCC) i urinblæren er den vanligste kreft i urinveiene. De fleste av TCC tilfellene er av den overfladiske typen og behandles med transurethral reseksjon (TUR). Imidlertid er det tilbakefall høy og nåværende behandlinger har den ulempen av å indusere sterk systemisk toksisitet eller forårsake smertefull cystitt. Det ville derfor være av terapeutisk verdi for å utvikle nye konsepter og identifisere nye medikamenter for behandling av blærekreft. Ki-67 er en stor nukleolært fosfoprotein som uttrykk er tett knyttet til celleproliferasjon, og curcumin, en phytochemical avledet fra rhizome
har vist Curcuma longa, etter å ha kraftige kreft egenskaper. I denne studien evaluerte vi den kombinerte effekt av curcumin og et siRNA mot Ki-67 mRNA (Ki-67-7) i rotte (AY-27) og humane (T-24) blærekreftceller. Anticancer effekter ble vurdert ved bestemmelse av cellenes levedyktighet, apoptose og cellesyklusanalyse. Ki-67-7 (10 nM) og curcumin (10 mm), når de ble behandlet uavhengig av hverandre, var moderat effektiv. Imidlertid, i deres kombinerte tilstedeværelse, spredning av blærecancerceller ble dypt (mer enn 85%) inhiberes; hastigheten av apoptose i den kombinerte tilstedeværelse av curcumin og Ki-67-7 (36%) var større enn den på grunn av Ki-67-7 (14%) eller curcumin (13%) alene. En lignende synergi mellom curcumin og Ki-67-7 i indusere cellesyklus arrest ble også observert. Western blot analyse antydet at forbehandling med Ki-67-7 sensibiliserte blære kreft celler til curcumin-mediert apoptose og cellesyklus arrest av p53- og p21-uavhengige mekanismer. Disse dataene antyder at en kombinasjon av anti-Ki-67 siRNA og curcumin kan være en levedyktig behandling mot spredning av blære kreft celler
Citation. Pichu S, Krishnamoorthy S, Shishkov A, Zhang B, McCue P , Ponnappa BC (2012) knockdown av Ki-67 ved dicer-substrat Liten interfering RNA sensitizes blærekreft celler til Curcumin-Induced Tumor Hemming. PLoS ONE 7 (11): e48567. doi: 10,1371 /journal.pone.0048567
Redaktør: Bharat B. Aggarwal, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 23 august 2012; Godkjent: 28 september 2012; Publisert: 12.11.2012
Copyright: © 2012 Pichu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health stipend AA016551. Midlene etaten hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den vanligste urologisk kreft i. sørøst-Asia og den nest hyppigste urologisk kreft i Nord-Amerika [1]. Transitional karsinom (TCC) står for mer enn 90% av pasienter diagnostisert med blærekreft [2]. Større enn 70% av TCC svulster er overfladiske svulster begrenset til blæren slimhinner og lamina propria -ta eller T1 iscenesatt svulster og de resterende er av invasiv type. Forekomsten av kreft i urinblæren har økt kontinuerlig i løpet av de siste to tiårene [3]. En foretrukket behandling for overfladiske svulster er transurethral reseksjon (TUR), men risikoen for tilbakefall (60-70%) på grunn av reattachment av frigitte tumorceller og død av sykdommen (10-30%) er høy [4]. Den primære tilnærmingen for å hindre tilbakefall av svulsten, etter TUR, har vært intravesikal instillasjon terapi (IVI) ved hjelp av cellegifter [5], [6] men de cytotoksiske effektene av narkotika er av interesse. På grunn av sin høyere effekt, intravesikal immunterapi ved hjelp av
Bacillus Calmette Guerin plakater (BCG) har blitt behandling av valg i løpet av de siste tre tiårene. Imidlertid induksjon av cystitt og systemisk toksisitet er noen av de alvorlige bivirkninger [2]. Til tross for den aggressive behandlinger, pasienter med blærekreft har en 5-års overlevelse på bare ca 50% [7]. Videre kan et betydelig antall pasienter med blærekreft er resistente mot konvensjonell terapi intravesikal, og derfor er det nødvendig å utvikle nyere og fortrinnsvis mindre toksiske tilnærminger for å bekjempe sykdommen.
En av de nyere fremgangsmåter for å undertrykke tumorprogresjon er etter ved hjelp av gen-spesifikke medikamenter så som, antisense oligonukleotider (AsODNs) eller små interfererende RNA (sirnas) mot mRNAer av tumor-spesifikke proteiner. Etter oppdagelsen av RNA interferens (RNAi) i en rekke arter [8] – [10], har det vært en stor interesse for å utnytte det terapeutiske potensialet av siRNAs i behandling av ulike sykdommer, [11], inkludert kreft [12] og inflammatoriske sykdommer [13]. Ki-67 er et stort nukleolært fosfoprotein hvis ekspresjon er tett forbundet med cellesyklusen, og det er strengt forbundet med celleproliferasjon [14]. Det er et DNA-bindende protein med en primær rolle i å opprettholde høyere ordens struktur for DNA under prosessen av mitose. Detaljert cellesyklusanalyse viste at den Ki-67-antigenet er til stede i kjernen av prolifererende (G1, S-, G2- fase og mitose), men ikke i kjernen av hvilende eller hvilende celler (G0- fase) [15]. Dette tyder på at Ki-67 hemmere kan ha relativ spesifisitet for ondartede celler. Yoa et al., [16] rapporterte at blant mange av de kreft-relaterte gener som ble testet, som i Ki-67 ekspresjon var en av de høyeste i rotte blæretumorer, nå nesten 20-ganger høyere sammenlignet med normalt vev. Således har Ki-67 vært en av de gener som er av interesse for å målrette, ved hjelp av AsODNs [17], [18] eller sirnas [19], [20]. I nyere rapport ble AsODN mot Ki-67 anvendt i fase-I kliniske forsøk for behandling av human blærekreft [21]. Selv om effekten av AsODNs demonstrere bevis for prinsippet, er det kjent at sirnas er minst en størrelsesorden mer følsom enn AsODNs [22], [23] og dermed mye lavere mengde av legemidlet må brukes for lignende effekt. Videre har det vist seg at jo lengre (27 bp) dicer-substrat sirnas (DsiRNAs) er mer følsom enn de vanlige 19-21 bp sirnas [24]. Dermed sirnas /DsiRNAs gi et bedre verktøy enn AsDONs å målrette tumor-spesifikke gener.
I tillegg til de antisensmolekyler, de siste årene, narkotika av vegetabilsk opprinnelse har også fått mye oppmerksomhet på grunn av sitt enorme potensial i forebyggelse og behandling av kreft [25]. Curcumin er et polyfenoliske phytochemical avledet fra rhizome,
Curcuma longa
. På grunn av sin kraftige antiproliferative og anti-inflammatorisk effekt, det har trukket mye oppmerksomhet fra forskere i kreft-feltet. Til dags dato er det mer enn 70 kliniske studier på ulike stadier av ferdigstillelse, testing effekten av curcumin mot mange sykdommer (www.clinicaltrials.gov). Rollen curcumin i moderne medisin har nylig blitt anmeldt [26] – [28]. Anticancerpotensialet av curcumin er avledet fra dens evne til å undertrykke proliferasjon av et bredt spekter av tumorceller, ved å nedregulere ekspresjonen av prolifererende gener som COX2, MMP-9, chemokiner, cyklin D1 og den nukleære faktor kB (NF-kB kB) [29]. Tharakan et al., [30] med en ortotopisk musemodell av blærekreft, rapporterte at curcumin avskaffet konstitutiv aktivering av NF-kB i tumorvevet, apoptose og redusert COX-2 ekspresjon. Imidlertid, i nærvær av det kjemoterapeutiske legemiddel, gemcitabin, lave konsentrasjoner av curcumin potenserer effekten av medikamentet gjennom modulering av NF-kB signalveien [31]. Disse observasjonene viser tydelig det terapeutiske potensialet av curcumin i behandling av kreft.
Siden curcumin hemmer spredning av kreftceller ved å målrette flere nettsteder i apoptotiske og spredning trasé, vi hypotese at superimposition av multi-målrettet curcumin følgende molekylære inhibering av Ki-67, ville ha en større hemmende virkning på tumorvekst. Faktisk våre data viser for første gang, at forbehandling av blærekreftceller med DsiRNA mot Ki-67 mRNA fremmer cellesyklus-stans og sensitizes cellene til curcumin-indusert apoptose. Den antatte molekylære mål av curcumin og Ki-67 DsiRNA blir diskutert.
Materialer og Metoder
siRNA Design
En totalt tre DsiRNA tomannsboliger rettet mot rotte Ki-67 mRNA ble utformet (Integrated DNA-teknologi, Coralville, IA, USA). Sekvensene til de tre DsiRNAs er som følger; 1) Ki-67 -2; Sense sekvens 5 «- CGA ACA AAG UCA UCA GAC ACA GUG A-3»; antisens sekvensen 5’UCA CUG Ugu CUG august ACU UUG UUC Guu-3 «; 2) Ki-67-7; Sense sekvens 5 «- CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3»; antisens sekvensen 5 «- CUU CAA AGG CAC UCC CUC ACU CUU Guu -3» og 3) Ki-67-9; Sense sekvensen 5’CCA CCA GAG CCA AUA GAU ACU UCA G-3 «og antisens sekvensen 5’CUG AAG UAU CUA UUG GCU CUG GUG GUG-3». En irrelevant DsiRNA, heretter omtalt som «kontroll» DsiRNA designet og har følgende rekkefølge; Sense sekvensen 5’CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3 «; antisens sekvensen 5 «- CUU CAA AGG CAC CGG AUC ACU CUU Guu-3». Selv om forkortelsen «DsiRNA» er opprinnelig brukt for å understreke det faktum at jo lenger sirnas ble brukt i denne studien, er den generelle termen «siRNA» brukt om hverandre gjennom hele teksten.
Cell Culture
transplant rotte-avledet TCC celler (AY-27 celler) ble vennlig levert av Dr. Ronal Moore (University of Alberta, Canada). Karakterisering av en blæretumormodell ved hjelp av denne transplantcellelinjen er blitt rapportert [32]. Cellene ble holdt i monolag, i et kulturmedium bestående av RPMI-1640 (Gibco-BRL) supplert med 10% FBS, 30 mM HEPES (pH 7,3), 1 mM pyruvat, penicillin-streptomycin og 2,0 g /l NaHCO
3. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i 5% CO
2 og 95% luftatmosfære ved fremgangsmåten ifølge Xiao
et al product: [32]. AY-27 celler ble passert da konfluente av standard trypsinering og reculturing prosedyre. Der det er angitt, for sammenligningsformål, human-avledet T-24 blære cancercellelinjer (American Type Culture Collection) ble også brukt i denne studien, og opprettholdt i vevskultur som beskrevet for AY-27-celler.
siRNA Transfeksjon
dagen før transfeksjon ble cellene trypsinert, fortynnet med friskt medium og overført til 12-brønners plater (0,8-1,0 × 10
5cells /brønn). DsiRNAs ble transfektert ved hjelp av spesielt utviklet reagent for siRNA transfeksjon (Lipofectamine ™ RNAiMax) i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, USA). Rutinemessig, transfeksjon ble utført ved 8-10% konfluens celle.
Curcumin Behandling
Når indikert, ble tumorceller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av curcumin (Sigma-Aldrich, USA), enten alene eller i kombinasjon med DsiRNA. Curcumin ble oppløst i DMSO, og i et gitt eksperiment, den endelige konsentrasjonen av DMSO var alltid mindre enn 0,1 volum-%.
Cellular Growth Kurve
For å evaluere tumor proliferasjon, tumor vekst ble bedømt ved å måle det totale antall celler på ulike stadier. På hvert trinn, ble cellene løsnet ved trypsinering, vasket med PBS, farget med trypanblått, og de levende celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer. Hver eksperimentelle tilstand ble gjentatt tre til seks ganger.
MTT-analysen
Antiproliferative virkninger av siRNA mot Ki-67 i nærvær eller fravær av curcumin ble bestemt ved MTT-analyse. Analysen er basert på evnen til mitokondriene til å redusere 3- (4, 5 dimethylthiaol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) fargestoff i rotte (AY-27) og humane (T-24) blærekreft celler som beskrevet av Plumb [33]. I korthet, etter eksponering av cellene til forskjellige behandlingsbetingelser, ble mediet fjernet, skyllet med PBS, og MTT-løsning (5 mg /ml i RPMI-medium) ble tilsatt og inkubert i 37 ° C i 3 timer. Deretter ble mediet fjernet og erstattet med et syre-isopropanol oppløsningsmiddel for å oppløse bunnfallet. Innholdet ble plassert på en shaker for 5 minutter og absorbans målt ved 570 nm.
kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Etter transfeksjon med sirnas og /eller behandling med curcumin, ble cellene høstes ved passende intervall og total RNA ble fremstilt ved PureLink RNA mini kit (Invitrogen, USA). For cDNA-syntese, ble 1 pg av total RNA reverstranskribert til cDNA i 20 ul reaksjoner ved hjelp av Quantitect Revers transkripsjon-sett (Invitrogen, USA). qPCR ble utført med lys cycler® 480 deteksjonssystem (Roche, USA) bruker Brilliant® SYBR® Grønn QPCR Master mix-protokollen (Stratagene, USA). I korte trekk ble 2 pl av cDNA amplifisert ved PCR i 25 ul reaksjoner inneholdende 12,5 pl av 2 x SYBR grønn reagenser og 0,2 pM av hver av primerne. Den opprinnelige inkubering i 10 minutter ved 95 ° C ble etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer
Ki-67 Protein Expression. Immunfluorescens Farging
Cellene ble dyrket på 25 mm dekkglass i 6-brønners plater. Etter eksponering for siRNA og /eller curcumin under forskjellige betingelser, ble cellene vasket med kald PBS og fiksert med 4% formaldehyd. Etter vasking med PBS ble cellene inkubert med Ki-67 primært antistoff (M19, Santa Cruz Biotechnology Inc.,) (1:100) i 3 timer og vasket tre ganger med PBS. Objektglassene ble så inkubert med FITC-merket sekundært antistoff (1:400) i mørke i en time ved romtemperatur, vasket med PBS og farget i 10 minutter med propidiumjodid (PI) løsning. Objektglassene ble deretter vasket med PBS og montert på et lysbilde, i nærvær av monteringsmedium (Antifade løsning, Invitrogen, USA). Platene ble deretter sett under Bio Rad Radiance 2001 system koblet til en Olympus IX70 mikroskop med 60 × og 40 × olje nedsenking mål (UAp0340, NA 1,35). En dobbel linje Kr /Ar ion laserkilden ble brukt til bildebehandling med eksitasjon innstillinger av 488 nm for FITC og 588 nm for PI.
Påvisning av apoptose ved Annexin V analysen
Apoptose ble målt ved hjelp av PE Annexin V apoptose Detection Kit I (BD Biosciences, USA) som per produsentens protokoll. I korthet, etter eksponering for siRNA med eller uten curcumin ble cellene vasket med kald PBS og deretter resuspendert i bindingsbuffer, etterfulgt av tilsetning av PE Annexin V og 7-amino-Acitomycin (7-AAD) og analysert i Beckman Coulter s Epics XL-MCL ™ Flowcytometer, (USA). Rutinemessig, gjennomsnittlig fluorescens avledet fra 20.000 celler per prøve ble registrert.
Cell Cycle Analysis
For å bestemme effekten av anti Ki-67 DsiRNA og /eller curcumin på cellesyklus faser, AY-27-celler ble utsatt for forskjellige forsøksbetingelser, media fjernet og cellene ble løsnet ved trypsinering. Cellene ble deretter vasket med PBS og fiksert i iskald 70% etanol i 2 timer ved -20 ° C. Cellene ble deretter vasket en gang med PBS, resuspendert i 300 ul av en iskald modifisert PI-løsning (50 ug /ml PI-oppløsning, 0,1% Triton X-100 og 0,1% natrium-citrat, i PBS) og inkubert i 30 min før analysen. PI fluorescens ble målt ved Beckman Coulter er Epics XL-MCL ™ Flowcytometer, (USA). Rutinemessig ble gjennomsnittlig fluorescens avledet fra 20.000 celler per prøve registrert. Celler ble scoret som prosentandel av celler i hver av cellesyklus fasene (G
o /G
1, S og G2 /M).
Western Blot analyse
Blære kreftceller, etter eksponering for curcumin og DsiRNA under forskjellige betingelser, ble trypsinert, vasket med PBS og lysert med is-kald RIPA (Sigma- Cat # R0278) buffer. Lysatene ble holdt på is i 20 minutter, vortex-blandet i 3-4 ganger, og deretter sentrifugert i en mikrosentrifuge ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 0-4 ° C. Supernatantene ble fjernet og analysert for proteininnhold. Aliquoter (40 ug) av protein fra hver prøve ble oppløst i 4 x NuPage litium-dodecyl-sulfat (LDS) og underkastet SDS-PAGE under reduserende betingelser. De separerte proteiner ble overført på en nitrocellulosemembran og blokkert i enten 5% bovint serumalbumin (BSA) eller 5% ikke-fett tørrmelk i en Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 (TBST) ved standardprosedyrer. Membranene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer mot følgende antigener: β-actin, syklin E, og p53 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Andre antistoffer som ble brukt var mot kløyvde Caspase3, fosforylert-RB (pRb-P) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), cyclin D1, (BD Bioscience, San Jose, CA), Ki-67, NF-kB (p65 subenhet), p27 /Kip og p21 (Abcam, Cambridge, MA). Blottene ble deretter vasket grundig med TBS-T og inkubert med passende pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin (Pierce Bioteknologi /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) sekundære antistoffer ved fortynninger 1:15,000 og 1:20,000 henholdsvis for 2 timer ved RT før den endelige vask med TBST. Proteinbåndene ble oppdaget av forbedret chemiluminescence systemet med SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). KODAK Bilde Station 440CF (Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) ble brukt til å visualisere og kvantifisere signalnettet intensiteten av båndene. Alle forsøkene ble utført in triplo. Representative blottene er vist.
Protein Assay
Proteininnhold i cellelysatene ble målt ved hjelp av Micro BCA ™ proteinanalysesett (Pierce Bioteknologi /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) ved anvendelse av bovint serumalbumin som intern standard.
Statistical Analysis
Hvor indikerte verdier er presentert som gjennomsnitt ± SE av (n) bestemmelser. Data var gjenstand for statistisk analyse av paret t-test ved hjelp av Microsoft Excel-programmet og de verdier med P . 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Hemming av Ki-67 Gene uttrykk og Cell Proliferation av DsiRNA
in vitro
efficacies av tre DsiRNA konstruerer målrettet for å rotte Ki-67 mRNA ble testet som beskrevet ovenfor i AY-27 celler. Som vist i figur 1A, av de tre DsiRNAs (Ki-67-2, -7, -9), Ki-67-7 viste maksimum inhibering. MRNA-ekspresjon, analysert ved qPCR, viste en 39%, 50% og 28% reduksjon av ekspresjonen av Ki-67 mRNA ved hjelp av Ki-67-2, 67-7 og Ki-Ki-67-9 henholdsvis i forhold til cellene behandlet med transfeksjon reagens alene. Tilsvarende celleviabilitet analyse av MTT viste at Ki-67-7-behandling var den mest effektive av de tre (fig. 1B). Således ble Ki-67-7 valgt som den mest effektive DsiRNA mot Ki-67 mRNA for påfølgende studier. Videre dose-responsstudier viste at Ki-67-7 var mest effektive ved 10 nM konsentrasjon (1c). Under våre eksperimentelle forhold, gjorde en ytterligere økning i Ki-67-7-konsentrasjonen ikke styrke anti-proliferativ effekt av siRNA.
× 10
5 celler /brønn) som beskrevet i materialer og metoder. Etter 24 timer ble de tilført med hver av siRNA konstruksjoner (Ki-67-2, Ki-67-7 og Ki-67-9) rettet mot Ki-67 mRNA. Etter 48 timer ble RNA ekstrahert og nivåene av mRNA ble bestemt ved kvantitativ PCR, som beskrevet i Metoder. Celler behandlet med transfeksjon reagens alene ble anvendt som kontroll. Hastigheten kan uttrykkes i Ki-67 mRNA ble normalisert til ekspresjonen av β-aktin. Verdier representerer data fra en (to) eksperiment ved hjelp av gjennomsnittet av tre bestemmelser. b) AY-27-celler ble dyrket i 12-brønn (0,8 x 10
5 celler /brønn) plater for 24 timer og transfektert med forskjellige konstruksjoner siRNA som beskrevet i metodene. Celleviabilitet ble bestemt 48 timer etter transfeksjon av MTT-analyse. Celler behandlet med transfeksjon reagens alene tjente som kontrollgruppe (= 100%). Linjene indikerer verdier som er gjennomsnitt ± bred singlett av tre bestemmelser. (
* P 0,05). c) AY-27-celler ble dyrket i 12-brønns plater (0,8 x 10
5-celler /brønn), som beskrevet i Metoder. Førtiåtte timer etter siRNA transfeksjon, ble effekten av forskjellige konsentrasjoner av Ki-67-7 på cellelevedyktigheten bestemmes ved MTT-assay. Celler behandlet med transfeksjon reagens alene tjente som kontroll. Celleviabilitet verdier er uttrykt som prosent kontroll og er gjennomsnitt ± SE av 3-8 bestemmelser (
* P 0,05,
*** P 0,005).
Effekt av curcumin på Tumor spredning: Synergy med Ki-67-7
virkningene av curcumin og Ki-67-7 ble testet i både menneskelig-avledet (T-24) og rotte-avledet (AY-27) blære kreftceller. Sekvens sammenligninger viste at det var 80% homologi i targetsekvensen av Ki-67-7 mellom rotte og human Ki-67 mRNA. I dose-responsstudier, observerte vi at tumorcellevekst ble inhibert med curcumin i en doseavhengig måte (fig. 2A og 2B) i begge celletyper, men T-24 celler var mer følsomme overfor curcumin enn AY-27 celler ved 20 uM og ovenfor. Imidlertid, ved 10 μ M, graden av inhibering (25-30%) var lik i begge celletyper. I begge tilfeller ble det observert en drastisk reduksjon (60-85%) i celleviabilitet mellom 10 og 20 uM curcumin. Imidlertid, for det formål å sammenlikne virkningene av kombinatoriske DsiRNA og curcumin (CusiRNA), ble den lavere dose (10 uM) av curcumin brukes sammen med den optimale dose (10 nM) i DsiRNA (Ki-67-7). Dataene viste nesten fullstendig (85%) hemning av cellelevedyktighet under den kombinerte behandling av curcumin og DsiRNA (Fig. 3A og 3B). Kontroll siRNA hadde ubetydelig effekt på cellen levedyktighet tyder det spesielle ved Ki-67-7 mot sitt mål.
T-24 (2a) og AY-27 (2b) celler ble sådd ut i 12-brønners plater (0,8 x 10
5-celler /brønn) og dyrket i 48 timer (40-50% konfluens), som beskrevet i Metoder. Etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av curcumin i 24 timer ble cellene vasket med PBS og inkubert i ytterligere 24 timer i curcumin fritt medium. Celler inkubert med DMSO (0,1%) alene ble behandlet som kontroller. DMSO alene hadde liten innvirkning på tumorcellevekst (data ikke vist). Celleproliferasjon ble evaluert på grunnlag av cellenes levedyktighet, målt ved MTT-analyse. Cellelevedyktigheten ble uttrykt som prosent av levedyktighet ble observert i DMSO-behandlede kontrollceller. Verdiene er fra en representativ (to) (2a) eller 3-8 (gjennomsnitt ± bred singlett) bestemmelser (2b).
* P 0,05,
** P 0,01,
*** P. 0,005
Samme antall (0,8 × 10
5 celler /brønn) av blærecancerceller T-24 (3a) og AY-27 (3b) dyrket som beskrevet i Methods enten ble transfektert med Ki-67-7 eller kontroll DsiRNA (10 nM) eller behandlet med transfeksjon reagens alene i 24 timer. Deretter, der det er angitt, curcumin (10 uM) ble tilsatt til cellene og inkubert i 24 timer fulgt av en ytterligere 24 timers inkubering i fravær av curcumin. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse ved slutten av 72 timer fra transfeksjon. Celler behandlet med DMSO pluss transfeksjon reagens tjente som kontroll. Data presentert er gjennomsnitt ± bred singlett på 3-5 bestemmelser (
* P 0,05,
** P 0,01). 3c) AY-27-celler (0,8 x 10
5-celler /brønn) ble behandlet nøyaktig som beskrevet ovenfor i forklaringen til figur 3A og 3B, og ved slutten av 24, 48 og 72 timer etter curcumin behandling (som er lik 48, 72 og 96 timer etter siRNA transfeksjon), ble cellevekst vurdert basert på celle tall som beskrevet i metoder. Dataene er gjennomsnitt ± bred singlett av tre bestemmelser.
antiproliferative effekt ble også bestemt ved å overvåke cellevekstkurve. De vekstkurver basert på celleantall ble bestemt ved 24, 48 og 72 timer etter DsiRNA og curcumin behandling. Kombinert behandling (CusiRNA) resulterte i en markert hemming av celleproliferasjon og etterlignet den samme trend som for cellenes levedyktighet studier (fig. 3C). De cellulære proteinverdier også korrelert godt med vekstkurver (data ikke vist).
Effekter av Ki-67-7 og Curcumin på Ki-67 mRNA og protein uttrykk
For å avgjøre om reduksjon i tumorcellelevedyktighet under CusiRNA behandling var relatert til Ki-67 proteinnivåer, vi målte nivåene av både Ki-67 mRNA og protein ekspresjon. Data viser reduksjoner i nivået av Ki-67 mRNA med 17%, 37% og 57% når de utsettes for curcumin, Ki-67-7 og CusiRNA henholdsvis (fig. 4A). Tilsvarende bruker immunfluorescens farging teknikk, observerte vi at i motsetning til Ki-67-7, curcumin
per se
hadde minimal innvirkning på Ki-67 protein uttrykk (Fig. 4B).
a) AY -27-celler ble behandlet med Ki-67 siRNA i nærvær eller fravær av curcumin nøyaktig som beskrevet i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved slutten av behandlingen, ble RNA ekstrahert og Ki-67-mRNA-ekspresjon ble bestemt ved kvantitativ PCR ved anvendelse β-actin som indre standard, som beskrevet i Metoder. Ki-67 mRNA-nivåer er uttrykt som prosent av frekvensen av ekspresjon i kontrollceller som ble behandlet med reagens transfeksjon og DMSO. Linjene indikerer verdier som er gjennomsnitt ± bred singlett av tre bestemmelser. b) AY-27-celler ble dyrket på dekkglass plassert inne i 12-brønners plater og behandlet med siRNA (Ki-67-7), curcumin eller som en kombinasjon, som beskrevet i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved slutten av behandlingsperioden ble cellene eksponert for Ki67 primært antistoff (M19) og FITC-merket sekundært antistoff, etterfulgt av PI (propidium jodid), og observerte henhold konfokal mikroskopi som beskrevet i Metoder. Scale bar setter = 5 mikrometer. Økt nedregulering av Ki-67 protein på grunn av Ki-67-7 ble observert.
induksjon av apoptose av Ki-67-7 og Curcumin
tap av cellelevedyktighet er ofte et resultat av apoptose eller nekrose. Omfanget av apoptose, en tidlig indikator på celledød, ble kvantifisert ved strømningscytometrisk analyse ved hjelp av Annexin V for å påvise de forskjellige faser av apoptose (Fig. 5). Data tyder mild induksjon av apoptose når cellene ble hver for seg behandlet med curcumin eller Ki-67-7. Imidlertid ble graden av apoptose (de riktige to kvadranter i fig. 5) i nærvær av CusiRNA funnet å være synergistisk (36% mot 13% for curcumin og 14% for Ki-67-7) etter korrigering for baseline apoptose ( 11%) i kontrollceller (fig. 5). Figuren viser også (til venstre topp kvadrant i fig. 5) at graden av cellenekrose (Annexin V negativ, positiv 7AAD) var minimal under hele behandlingsbetingelsene.
AY-27 celler ble behandlet med anti -Ki-67 siRNA, curcumin eller i det kombinerte nærvær av både som beskrevet i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved slutten av behandlingsperioden ble cellene høstet, farget med fluorescens-konjugert Annexin V og 7AAD som beskrevet i Metoder. Etter flowcytometrisk analyse, ble andelen (nummer innstikk i figuren) av normale celler eller de som gjennomgår apoptose og nekrose beregnes ved hjelp av egnet programvare (Flow Jo v.9). Hastigheten av apoptose ble målt ved tilsetning av prosentandelene i de rette to kvadranter i hver av figurene. Dataene er fra en representant (av to identiske) eksperiment.
Ki-67-7 og Curcumin på cellesyklus faser
Effekten av Ki-67-7 på cellesyklus ble bestemt i nærvær eller fravær av curcumin. Data viser en generell dreining i retning av G0 /G1 fase i alle behandlingsbetingelsene, men effekten var maksimal i nærvær av CusiRNA (fig. 6). Det var ingen signifikant endring i G2 /M-fase ved separat utsatt for enten curcumin eller Ki-67-7, men en reduksjon 33% ble observert når cellene ble utsatt for CusiRNA. Interessant, med en økning i G0 /G1 og reduksjon i G2 /M-fasene, var det en to-gangers forskyvning (forholdet mellom G0 /G1 til G2 /M) mot vekstarrest i nærvær av CusiRNA sammenlignet med kontrollen (Fig. 6 ).
AY-27 celler ble behandlet med Ki-67-7, curcumin eller med begge deler, slik som beskrevet tidligere i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene behandlet med PI og fordelingen av cellene i forskjellige cellesyklusfaser ble bestemt ved strømningscytometri, som beskrevet i Metoder. Celler ble bedømt som prosentvis fordeling av celler i hvert av cellesyklusfaser (G
o /G
1, S og G2 /M). Linjene indikerer verdier som er gjennomsnitt ± SE av tre bestemmelser
Effekt av Ki-67-7 og Curcumin på flere signalerings. Molekylære mål i Cellesyklus og apoptose
Hemming av cellesyklusprogresjon, induksjon av apoptose eller en kombinasjon av begge, er de viktigste hendelser assosiert med tumor-inhibering. Data presentert ovenfor klart tyder på at en kombinasjon av curcumin og Ki-67-7 påvirke både hendelsene. For å forstå den rollen noen av molekylære mellomprodukter som er egnet til å påvirke disse hendelsene, vi fast bestemt på nivåene av noen av de regulatoriske proteiner assosiert med apoptose og cellesyklusprogresjon. Økte nivåer av spaltet-caspase3 av Western blot-analyse bekreftet induksjon av apoptose, som var mest uttalt i CusiRNA gruppen (Fig. 7). Det var imidlertid en markert reduksjon i nivåene av tumor suppressor protein, p53, i samme gruppe. Cykliner D1 og E, proteiner assosiert med G1-S-overgang i cellesyklusfaser, ble også dypt inhibert av CusiRNA. Som forventet, ble reduksjonen i cyklin D1 forbundet med en reduksjon i nivåene av pRb-P. Reduksjon i p53 var også assosiert med en reduksjon i p21, en inhibitor av cyclin E. Det var imidlertid økningen i p27 protein, en annen inhibitor av cyclin E som så ut til å samsvare godt med inhiberingen av Cyclin E i CusiRNA gruppe. Disse observasjonene var like i begge celletyper. På den annen side, inhibering av transkripsjonsfaktor NF-kB var mer tilskrives curcumin behandling i AY-27-celler, mens i T-24 celler, ble det hemmet i hovedsak av CusiRNA.
blære kreftceller (T -24 og AY-27) ble dyrket og utsatt for Ki-67-7 og curcumin som beskrevet ovenfor i forklaringen til figur 3A og 3B. Ved slutten av behandlingsperioden, ble totalt protein ekstrahert og underkastet Western blotting under anvendelse av passende antistoffer, som beskrevet i Metoder. For formålene med å assosiere proteiner med bestemte roller, ble de gruppert i separate kategorier, for eksempel gentranskripsjon (A), celle-syklusprogresjon (B) og apoptose (C). β-aktin ble benyttet som intern kontroll. Siden forskjellige proteiner (f.eks cyclin D1 og NF-kB) fra samme membranen ble identifisert i egne kategorier, er det samme β-aktin blot vises på mer enn én anledning. Data presentert er vestlige blotter fra et enkelt eksperiment, som er representativ for 2-3 identiske eksperimenter.
Diskusjoner
Transitional karsinom (TCC) i urinblæren er den vanligste kreft i urinveiene.
