Abstract
Bakgrunn
Det er omstridt hvorvidt mikroRNA-126 er en svulst undertrykkende eller onkogene miRNA. Flere forsøk er nødvendig for å fastslå om mikroRNA-126 er assosiert med ikke-småcellet lungekreft risiko og prognose.
Metoder
Over-uttrykk for mikroRNA-126 ble utført for å evaluere celle invasjon og tumorvekst i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer og naken mus xenograft modell. Gain-of-funksjon eksperimenter og luciferase-analyser ble utført for å vise forholdet mellom mikroRNA-126 og PI3K-Akt signalveien i A549-celler. Vi analyserte sammenslutninger av den mikroRNA-126 uttrykk mellom genetiske varianter innenfor mikroRNA-126 og kliniske opplysninger inkludert røykestatus, kjønn, alder og histologisk type og tumorstadium.
Resultater
Over ekspresjon av mikroRNA-126 i NSCLC-cellelinjer ble redusert celleproliferasjon in vitro og tumorvekst i nakne mus xenograft modell. Og mikroRNA-126 trykt aktiviteten av PI3K-Akt veien ved å målrette bindingsseter i 3′-utranslaterte område av PI3KR2 mRNA. Ekspresjonsnivået av mikroRNA-126 ble redusert i NSCLC-linjer og tumorvev. Pasientene med lav mikroRNA-126 uttrykk hadde signifikant dårligere overlevelse enn de med høy mikroRNA-126 uttrykk (middel for overlevelse (måned): 24,392 ± 1,055 vs. 29,282 ± 1,140,
P
= 0,005). Men det var ingen signifikant forskjell i genotype og allelfrekvenser av mikroRNA-126-varianten (G A, rs4636297) mellom saker og kontroller (
P
= 0,366). I tillegg var det ingen sammenheng mellom SNP rs4636297 og overlevelse i NSCLC pasienter (
P
= 0,992). Og mikroRNA-126 uttrykk hadde ingen signifikant forskjell mellom de tre genotypgruppene (
P
= 0.972).
Konklusjoner
Våre data tyder på at mikroRNA-126 er et tumor- suppressor genet i NSCLC og lav mikroRNA-126 uttrykk er et ugunstig prognostisk faktor i NSCLC pasienter. Imidlertid gjenstår reguleringsmekanisme av mikroRNA-126 som skal belyses i ulike normale og maligne vev. Derfor trengs det mer forskning for å utforske svulst undertrykkende funksjoner av mikroRNA-126 i NSCLC
Citation. Yang J, Lan H, Huang X, Liu B, Tong Y (2012) mikroRNA-126 Hemmer Tumor Cell vekst og dens uttrykk nivå korrelerer med dårlig overlevelse i ikke-småcellet lungekreft pasienter. PLoS ONE 7 (8): e42978. doi: 10,1371 /journal.pone.0042978
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 07.02.2012; Godkjent: 16 juli 2012; Publisert: 10 august 2012
Copyright: © Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (tilskudd nummer 30800633) og Sichuan-provinsen Science and Technology Foundation for Ungdom (tilskudd nummer 09ZQ026-034). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall i verden, så vel som i Kina [1]. Mange gener involvere i NSCLC tumorigenesis som
p53
,
Rb
, og
Ras product: [2]. En undersøkelse viser at 98 av 186 microRNAs er i kreft-assosiert genomiske regioner eller i sårbare områder [3]. For eksempel, MIR-99a, la-7, MIR-125b-2 ligger i homozygote sletting regioner uten kjente tumorsuppressorgener i lungekreft [3]. Flere microRNAs ligger i nærheten av stoppunkt regioner, inkludert MIR-142 50 nukleotider fra t (8, 17) pause involverer kromosom 17 og MYC [3]. Dette indikerer at microRNAs kan spille en avgjørende rolle i tumordannelse og kreft progresjon [3]. I tillegg avslører mikroRNA uttrykk profilering karakteristiske signaturer for mange krefttyper og er en biomarkør for svulst klassifisering, prognose og terapeutisk utfall [4] -. [8]
mikroRNA-126 er kartlagt til kromosom 9q34.3 i verten genet som koder for epidermal vekstfaktor som-7 (
EGFL-7
). MikroRNA-126 er høyt uttrykt i lunge og hjerte vev, men uttrykkes også på lavere nivåer i hjernen, lever og nyre [9]. Høye ekspresjonsnivåer av mikroRNA-126 uttrykk er identifisert på endotelceller, som har en viktig rolle i regulering av angiogenese og blodkar integritet ved inhibering av VEGF-reaksjonsveien. Knockdown av mikroRNA-126 resulterte i tap av vaskulær integritet og blødning under embryonal utvikling av sebrafisk [10] – [13]. Dessuten, noen studier viste at mikroRNA-126 trykt apoptose av akutt myeloid leukemi celler og forbedret kolonien dannende evne musebenmargsstamceller gjennom målretting Polo-lignende kinase 2 (
PLK2
) [14]. Tvert imot, andre studier viste at mikroRNA-126 blir ofte referert til tumorsuppressorgen i forskjellige cancere [15] – [21]. I magekreft, over-uttrykk for mikroRNA-126 betydelig forbedret forankringsavhengig og forankringsuavhengig cellevekst ved å målrette
SOX2 product: [16]. I tykktarmskreft, mikroRNA-126 undertrykker vekst av kreftceller ved å målrette phosphatidylinositol 3-kinase regulatorisk subenhet beta (p85β) [19]. Noen studier viser også at mikroRNA-126 kan hemme invasjon og spredning ved å regulere
Crk
,
VEGF
, og
EGFL7
i NSCLC [15], [21], [ ,,,0],22]. Dermed dagens bevisene synes å støtte en nær sammenheng mellom mikroRNA-126 og tumorvekst. Videre sammenlignet med pasienter som ikke responderer på førstelinjebehandling med kapecitabin og oksaliplatin, mikroRNA-126 uttrykk nivået var signifikant høyere hos pasienter som responderte på behandling med kapecitabin og oksaliplatin [23]. I tillegg er forholdet mellom mikroRNA-126 /mikroRNA-152 muliggjorde påvisning av urothelial blærekreft (BCA) fra urin ved en spesifisitet på 82% og en sensitivitet på 72% [24]. Basert på ovennevnte rapporter, kan mikroRNA-126 har mulig forutsigbar og diagnostisk verdi for kreft.
Det er omstridt hvorvidt mikroRNA-126 er en svulst undertrykkende eller onkogene miRNA. Og reguleringsmekanisme av mikroRNA-126 er ikke avklart i ulike normale og maligne vev [25]. Foreløpig er flere eksperimenter for å finne ut om mikroRNA-126 er assosiert med ikke-småcellet lungekreft risiko og prognose. I denne studien undersøker vi hvilken rolle mikroRNA-126 i NSCLC og viser at det er en tumor suppressor gen og dens uttrykk nivå korrelerer med dårlig overlevelse hos NSCLC pasienter.
Resultater
MicroRNA- 126 Hemmer Cell Invasion analysen og tumorvekst
Vi utførte en celle invasjon analysen i A549 og SK-MES-1 celler med PE-Mir126 vektor eller PE-CMV vektor transfeksjon. Sammenlignet med kontrollgruppen, over-ekspresjon av mikroRNA-126 svekket celle invasjon, som er besto med tidligere rapporter (figur 1A). Celleproliferasjon ble redusert med 47,91% (
P
= 0,0006) og 36,36% (
P
= 0,0018), da henholdsvis A549 og SK-MES-1 celler ble henholdsvis behandlet med mikroRNA-126 over-ekspresjon i 72 timer (figur 1B). For ytterligere å undersøke effekten av mikroRNA-126 på tumorvekst, undersøkte vi muligheten av mikroRNA-126 for å undertrykke tumorvekst
in vivo
ved intratumoral injeksjon av pE-Mir126 vektor inn i A549 og SK-MES-1 xenoimplantater modeller av nakne mus. Som vist på figur 1C, ble veksten av svulster observert fra 1 til 25 dager etter den siste injeksjonen. Den gjennomsnittlige tumorvekt i mus behandlet med PE-Mir126 vektor på dag 25 etter den siste injeksjonen ble bare omtrent en halvdel av tumorvekten i de mus som var behandlet med PBS alene eller pE-CMV-vektoren alene (figur 1D). Alle svulster vekst i mus behandlet med PE-Mir126 vektor ble undertrykte betydelig sammenlignet med de i PBS-behandlede og PE-Mir126 vektor behandlede mus.
(A) overe-Xpression av mikroRNA-126 hemmer celle invasjon i A549 og SK-MES-1 celler. Sammenlignet med kontrollgruppen, over-ekspresjon av mikroRNA-126 impaires celle invasjon. (B) mikroRNA-126 hemmer celleproliferasjon i A549 og SK-MES-1 celler. Celleformering ble dramatisk redusert etter at cellene ble behandlet med mikroRNA-126 over-ekspresjon i 72 timer. (C) Svulsten vekstkurve
in vivo
av intratumoral injeksjon med mikroRNA-126. Veksten av tumorer ble observert fra 1 til 25 dager etter den siste injeksjonen. (D) mikroRNA-126 hemmer vekst av A549 celle og SK-MES-1-celler in vivo. Den gjennomsnittlige tumor bare omtrent en halvparten av svulster vekt i mus behandlet med PBS eller PE-CMV vektor alene.
mikroRNA-126 Hemmer Tumor Cell Proliferation om PI3K-Akt Pathway i NSCLC
for å utforske den molekylære mekanismen for mikroRNA-126 anti-proliferativ effekt på NSCLC, brukte vi to open access programmer (TargetScan og miRBase) å forutsi mål av mikroRNA-126. De predikerte bindingssteder i 3’UTR av
PIK3R2
for mikroRNA-126 er vist i figur 2A. Luciferase reporter-analysen indikerte at aktiviteten av reporterinneholdende 3’UTR av
PIK3R2
gen ble redusert etter ko-transfeksjon med PE-Mir126 vektor (100,67 ± 4,51 ± 5,86 vs.31.33,
P
0,0001), mens aktiviteten av seterettet mutagenese av reporteren som inneholder 3’UTR av
PIK3R2
genet ble ikke åpenbart endret (104,00 ± 8,54 vs. 98,33 ± 10,12,
P
= 0,484) (figur 2B). I tillegg western blot-analyse avslørte at ekspresjonen av PIK3R2 ble nedsatt ved behandling med PE-Mir126 vektor i A549 (0,97 ± 0,14 vs.0.31 ± 0,07, p = 0,002) og SK-MES-1 celler (0,94 ± 0,13 vs. 0,45 ± 0,08,
P
= 0,005) (figur 2C). Videre transfeksjon av PE-Mir126 vektor snarere enn PE-CMV vektor betydelig undertrykt Akt fosforylering uten å endre uttrykket nivåer av total Akt protein (A549 celler, 0,89 ± 0,10 vs.0.41 ± 0,04, p = 0,002. SK-MES-1 celler 0,88 ± 0,08 vs.0.47 ± 0,05
P
= 0,002) (figur 2C).
(A) Antatte mikroRNA-126 rettet mot nettstedet i 3’UTR av PIK3R2. Mutasjonen ble generert i 3’UTR av PIK3R2 sekvens i komplementær stedet for frø regionen mikroRNA-126 som angitt. (B) mikroRNA-126 bindingsstedet i 3’UTR av PIK3R2 ble vurdert ved hjelp av luciferase reporter analysen. Luciferase-aktivitet ble påvist ved et luminometer etter ko-transfeksjon i 48 timer. Luciferase-aktivitet av hver prøve ble normalisert til den Renilla luciferaseaktivitet. (C) mikroRNA-126 undertrykker PIK3R2 uttrykk og Akt fosforylering i A549 og SK-MES-1 celler. Totalt protein ble isolert fra celler behandlet med PE-Mir126 vektor eller pE-CMV-vektoren i 48 timer. PIK3R2 ekspresjon og Akt-fosforylering ble analysert ved western blotting ved anvendelse av antistoff til P85β og fosfo-Akt (Ser473). (D) De PIK3R2 uttrykk nivåer og Akt fosforylering i NSCLC vev. Scale bar, 10 mikrometer. en. Immunhistokjemisk farging negativ kontroll over PIK3R2 i NSCLC vev. b. Immunhistokjemisk farging negativ kontroll p-Akt (Ser473) i NSCLC vev. c. Immunhistokjemisk farging av PIK3R2 i NSCLC vev med lav mikroRNA-126 uttrykk nivåer. d. Immunhistokjemisk farging av p-Akt (Ser473) i NSCLC vev med lav mikroRNA-126 uttrykk nivåer. e. Immunhistokjemisk farging av PIK3R2 i NSCLC vev med høy mikroRNA-126 uttrykk nivåer. f. Immunhistokjemisk farging av p-Akt (Ser473) i NSCLC vev med høy mikroRNA-126 uttrykk nivåer. (E) Uttrykket nivåer av PIK3R2 og Akt fosforylering i NSCLC vev omvendt korrelert med mikroRNA-126 uttrykk nivåer (PIK3R2, Spearman r = -0,276,
P
0,0001, Akt, Spearman r = -0,164,
P
= 0,0013). (F) Behandling med Akt-myr resulterte i en statistisk signifikant redning av A549 og SK-MES-1 celleproliferasjon ved transfeksjon med PE-Mir126 vektor. Totalt protein ble isolert fra celler behandlet med Akt-myr, PE-Mir126 vektor eller respektive kontroller i 48 timer. Akt fosforylering ble analysert ved western blotting ved anvendelse av antistoff mot fosfo-akt (Ser473). Etter celler ble transfektert med Akt-myr, PE-Mir126 vektor eller respektive kontroller i 72 timer i 96-brønners plate, ble celleproliferasjonsprosesser prisene bestemmes av MTT-analysen.
For å ytterligere evaluere forholdet mellom mikroRNA-126 og
PIK3R2
i NSCLC, vi har oppdaget uttrykket nivåer av mikroRNA-126, PIK3R2 og Akt fosforylering i 381 kliniske prøver av kvantitativ real time PCR (QRT-PCR) og henholdsvis immunocytochemistry (IHC). Uttrykket nivåer av PIK3R2 og Akt fosforylering i tumorvev omvendt korrelert med mikroRNA-126 uttrykk nivåer (PIK3R2, Spearman r = -0,276,
P
0,0001, Akt, Spearman r = -0,164,
P
= 0,0013, figur 2D E og tabell 1). Resultatene er vist i figur 2F viste at behandling med utvinning av Akt-aktivitet resulterte i signifikant inhibering av proliferasjon i A549-celler og SK-MES-1-celler ved transfeksjon med PE-Mir126 vektor (
P
0,0001) .
nivåer av mikroRNA-126 Expression korrelerer med dårlig overlevelse i ikke-småcellet lungekreft Pasienter
Sammenlignet med foreviget bronkial epitel NL20, mikroRNA-126 uttrykk nivåer var åpenbart redusert i NSCLC-cellelinjer, slik som A549, H358, H1703, H460 og SK-MES-1 (figur 3A). Uttrykket nivået av mikroRNA-126 ble også undersøkt i en kohort bestående av 168 par av NSCLC tumorvev og matchet tilstøtende noncancerous vev (Figur 3B). Dens uttrykk nivået var mye lavere i tumorvev enn i noncancerous vev (0,905 ± 0.171vs.0.683 ± 0,308,
P
0,0001).
(A) uttrykket nivåer av mikroRNA -126 er redusert hos NSCLC cellelinjer. Uttrykk av mikroRNA-126 ble undersøkt av kvantitativ real-time PCR i NL20 cellelinjer og NSCLC cellelinjer. (B) uttrykk nivåer av mikroRNA-126 er redusert i Human NSCLC prøver. Uttrykk av mikroRNA-126 ble bestemt av kvantitativ real-time PCR i tumorvev og pasient-matchet tilstøtende lunge vev. Sammenlignet med tilsvarende tilstøtende lunge vev, mikroRNA-126 uttrykk var markert nedregulert i tumorvev (
P
0,0001). (C) Lav mikroRNA-126 uttrykk korrelerer med dårlig overlevelse av NSCLC pasienter. Pasientene ble delt i to grupper basert på deres mikroRNA-126 uttrykk nivåer: de med mindre enn medianen av mikroRNA-126 uttrykk nivåer og de med mer enn eller lik medianen av mikroRNA-126 uttrykk nivåer (median: 0,654). Pasientene med lav mikroRNA-126 uttrykk hadde signifikant dårlig overlevelse sammenlignet med de med høy mikroRNA-126 uttrykk (betyr for overlevelse tid (måned): 24,392 ± 1,055 vs. 29,282 ± 1,140,
P
= 0,005) .
som vist i tabell 2, ble det funnet at uttrykket nivåer av mikroRNA-126 ikke forbundet med kjønn, alder, histologisk type eller stadium av tumor i kohort av 442 NSCLC tilfeller . Pasientene ble delt i to grupper basert på deres mikroRNA-126 uttrykk nivåer: de med mindre enn medianen av mikroRNA-126 uttrykk nivåer og de med mer enn eller lik medianen av mikroRNA-126 uttrykk nivåer (median: 0,654). Men Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at pasienter med lav mikroRNA-126 uttrykk nivå hadde signifikant dårlige overlevelses ganger sammenlignet med de med høy mikroRNA-126 uttrykk nivå (betyr for overlevelse tid (måned): 24,392 ± 1,055 vs. 29,282 ± 1,140
P
= 0,005) (Figur 3C). Multivariat Cox proporsjonal hazard regresjonsanalyse viste også at lave mikroRNA-126 uttrykk nivåer var en betydelig ugunstig prognostisk faktor (hazard ratio, 0,782; 95% CI, 0,647 0,945). (Tabell 3)
genetisk variant innenfor mikroRNA-126 ikke er forbundet med kreftrisiko og overlevelse hos NSCLC pasienter
Vi sekvensert de genomiske DNA-segmenter, inkludert pre-MIR-126 og dets respektive flankerer regioner (± 200 bp) i 442 NSCLC pasienter og 543 matchede kontroller. Tre SNPs, inkludert rs78242242, rs4636297and rs1140713, ble bekreftet i segmentene. I denne studien ble rs78242242 og rs1140713 ikke statistisk analysert på grunn av svært lav frekvens (data ikke vist). Genotypen fordelingen av SNP (G A, rs4636297) i kontrollene ble tilstås Det Hardy-Weinberg likevekt (
P
= 0,336), og det var ingen generell forskjell i genotypen fordeling mellom saker og kontroller (tabell 4). Kaplan-Meier overlevelses estimater viste at det ikke var noen sammenheng mellom rs4636297 og overlevelsestiden hos NSCLC pasienter (
P
= 0,992) (Figur 4A). Multivariat Cox proporsjonal hazard regresjonsanalyse viste også at rs4636297 ikke var assosiert med total overlevelse av NSCLC pasienter (hazard ratio, 0,995; 95% CI, 0,836 til 1,184) (tabell 3). Vi vurderte også om rs4636297 polymorfisme var assosiert med mikroRNA-126 uttrykk i NSCLC og resultatene viste at det var ingen signifikant forskjell mellom de tre genotypgruppene (
P
= 0,972) (figur 4B).
(A) Genetisk variant innenfor mikroRNA-126 er ikke forbundet med overlevelsestider. Kaplan-Meier overlevelses beregninger viser at det ikke er noen sammenheng mellom SNP rs4636297 og overlevelse i NSCLC pasienter (
P
= 0,992). (B). Expression nivåer av mikroRNA-126 i NSCLC vev av tre genotyper er like. MikroRNA-126 ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR. Det var ingen signifikant forskjell mellom de tre genotypgruppene (
P
= 0,972).
Diskusjoner
I de siste årene har det blitt identifisert som den avvikende uttrykk for microRNAs spiller en viktig rolle i tumordannelse og utvikling [26] – [28]. I tumorgenese, er uttrykket nivåer av visse microRNAs redusert i kreftvev. Disse typer microRNAs anses som tumorsuppressorgener. Tumor suppressor microRNAs vanligvis forhindre onkogenesen av negativ regulering av onkogener eller gener som kontrollerer cellevekst, differensiering, migrasjon og apoptose [29], [30]. Foreløpig mikroRNA-126 uttrykk nivå markert nedgang i ulike tumorvev, inkludert NSCLC, tykktarm kreft, brystkreft og magekreft [16] – [22], [31]. Derfor er mikroRNA-126 betraktet som tumorsuppressorgener.
Våre data viser at over-ekspresjon av mikroRNA-126 nedsatt NSCLC celleproliferasjon og tumorvekst i xenotransplantater modell av nakne mus. Det er generelt akseptert at mirnas utøve sin funksjon ved downregulating ekspresjonen av deres nedstrøms målgener. Aktivering av PI3K reaksjonsveien resulterer i cellevekst og overlevelse, noe som bidrar til reduksjon av tumorvekst, metastatisk og terapi motstand i NSCLC [32]. Flere studier har indikert at den PI3K-Akt reaksjonsvei spiller en sentral rolle i å indusere onkogen cellevekst og tumorutvikling [33], [34]. Denne reaksjonsvei er derfor et attraktivt mål for anticancermidler. Basert på bioinformatikk analyse for prediksjon mål av mikroRNA-126,
PIK3R2
genet ble valgt for potensielle mål av mikroRNA-126. I denne studien fant vi at
PIK3R2
genet var et direkte mål for mikroRNA-126. Videre mikroRNA-126 ekspresjon i begge NSCLC-cellelinjer og tumorvev markert redusert sammenlignet med noncancerous celler og vev. Våre data kveldsdestinasjon viste at over-uttrykk for mikroRNA-126 svekket NSCLC celleproliferasjon og tumorvekst i A549 xenografter modell av nakne mus om regulering av PI3K-Akt signalveien. Disse data antydet at tapet av mikroRNA-126 ekspresjon kan involvere utvikling og progresjon av NSCLC. I samsvar med de siste funnene [22], våre resultater viste også at uttrykket nivåer av mikroRNA-126 uttrykk korrelerer med dårlig overlevelse i ikke-småcellet lungekreft pasienter.
Genetiske varianter i forløper mikroRNA (pre-miRNA) eller miRNA målwebområder har vist seg å være assosiert med risiko for ulike kreftformer. Noen studier viser at SNPs i pre-mirnas spilt en viktig rolle i prediksjon av NSCLC overlevelse og mottakelighet [35], [36]. For eksempel, MIR-196a2 variant homozygote hadde en 1,76 ganger forhøyet hazard ratio (HR) for en ugunstig total overlevelse av NSCLC [36]. Men ingen polymorfismer ble funnet i den anslåtte bindingsseter i 3’UTR av PIK3R2 for mikroRNA-126. Så vi utførte den genetiske foreningen analyse for å studere potensialet sammenslutning av SNPs innen mikroRNA-126 med overlevelse og mottakelighet for NSCLC. I denne studien fant vi at genotypen og allelfrekvenser av mikroRNA-126 (G A, rs4636297) ble SNPs ikke forbundet med risiko og total overlevelse av NSCLC. I forrige rapport, har foreningen mellom rs4636297 og brystkreftrisiko ikke funnet [37]. Nylig studie viser at rs4636297GG genotypen vesentlig blokkerer behandling av pri-miRNA til pre-miRNA, noe som resulterer i betydelig redusert moden mikroRNA-126 uttrykk [38]. På tilsvarende måte, sammenlignet med villtype-allelet G, er en variant av rs4636297 har ingen innvirkning på den sekundære struktur av pre-MIR-126 i seg selv, men det påvirker den sekundære struktur av flankerende region. I mellomtiden er den fri energi ΔG økes i en allel variant [37]. Men mikroRNA-126 nivået hadde ingen signifikant forskjell mellom de tre genotypgruppene i vår kohort av 442 NSCLC tilfeller. Resultatene tyder på at Gremlins varianter i mikroRNA-126 ikke har noen innvirkning på mikroRNA nivået av tumorvev i NSCLC pasienter. Selv om en studie identifisert som Ets-en og Ets-2 kan regulere uttrykk av mikroRNA-126 ved å målrette en Ets bindende element i genomiske regioner oppstrøms for mikroRNA-126 og
EGFL7
genet i endotelceller [39] , videre studier er nødvendig for å avgjøre hvorvidt den ovennevnte mekanismen omfatter i nedregulering av mikroRNA-126 i NSCLC.
i sammendrag, våre data indikerer at mikroRNA-126 er et tumor-suppressor-gen i NSCLC og lavt mikroRNA-126 uttrykk er en betydelig ugunstig prognostisk faktor i NSCLC pasienter. Imidlertid er de genetiske varianter av mikroRNA-126 ikke er assosiert med NSCLC risiko og prognose. I tillegg gjenstår reguleringsmekanisme av mikroRNA-126 som skal belyses i ulike normale og maligne vev. Derfor trengs det mer forskning for å utforske svulst undertrykkende funksjoner av mikroRNA-126 i NSCLC.
Materialer og metoder
Cell Culture, Study Befolkning og kirurgiske prøver
A549, H358, H1703, H460 og SK-MES-1 humane NSCLC-linjer, en normal human bronkial epitelcellelinje (NL-20), ble erholdt fra American Type Culture Collection. Menneske NSCLC prøvene var fra 442 pasienter ved Chengdu Army General Hospital og Sichuan Provincial Folkets sykehus fra 2008 og til 2010. Av 442 eksemplarer, 76 ble oppnådd ved biopsi fra 43 tilfeller av stadium IV og 33 tilfeller av stadium III, og resten oppnådd ved kirurgi. Det er 168 tilstøtende noncancerous lunge vev i 442 eksemplarer. Den fasen av en NSCLC er basert på amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) TNM System. Kreftfrie kontrollene var fra en kohort av 543 personer som ikke hadde noen historie av kreft og ble tilpasset de tilfeller på alder og kjønn. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Sichuan Academy of Medical Sciences Sichuan Provincial Folkets sykehus, West Kina Second universitetssykehus, Sichuan University og Chengdu Army General Hospital. Den signerte informert samtykke ble innhentet fra alle deltakere eller fra pasientenes representanter om direkte samtykke ikke kan innhentes. Ingen av pasientene hadde fått noen behandling for lungekreft før operasjonen. Deltakerne i studien gjennomgikk et personlig intervju for å få informasjon om demografiske trekk og livsstilsfaktorer som bruk av tobakk.
RNA Utvinning og Kvantitativ Real Time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens. Total-RNA (100 ng) for hver prøve ble anvendt for cDNA-syntese ved anvendelse av revers transkripsjon primere for mikroRNA-126 og U6 små nukleær RNA. Kvantitativ real time PCR ble utført ved hjelp av SYBR® Premiks Ex Taq ™ (Takara Biotech Co.). qPCR Primer Set for mikroRNA-126 (Cat.no.MQP-0101) og U6 liten kjernefysiske RNA (Cat.no.MQP-0201) var fra Ribobio Co. mikroRNA-126 og U6 liten kjernefysiske RNA ble henholdsvis kvantifisert i henhold til standardkurve og utført in triplo. U6 small nuclear RNA ble anvendt for normalisering. Den relative uttrykket ble beregnet ved hjelp av ligningen. Kopier (MIR-126) /kopier (U6)
Cell Invasion analysen
En transwell cellekultur kammeret (Millipore, Bedford, MA, USA) ble belagt med Matrigel, tørket og rekonstituert med kulturmedium ved 37 ° C. Cellene ble delt i tre grupper: kontrollgruppen, PE-CMV gruppe og PE-Mir126 gruppe. Celler transfektert med PE-CMV eller Pe-Mir126 ble sultet i serumfritt medium og suspendert i 1 x 10
6 /ml i RMPI1640 medium i 24 timer før analysen. 300 ul av cellesuspensjonen ble anbragt i det øvre kammer og tillates å migrere i 24 timer ved 37 ° C. De suspenderte medier i det nedre kammer ble fjernet. Cellene som hadde invadert den nedre siden av filteret ble fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med Gimsa løsning. Antallet celler som passerte gjennom porene inn i det nedre kammer ble tellet under et fasekontrastmikroskop.
Cell proliferasjonsanalyser
Cellene ble sådd ut på 96-brønners plate i RMPI1640 med 10% FBS og 100 ug /ml penicillin /streptomycin i 72 timer. Celleproliferasjon Hastighetene ble bestemt ved 3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay.
vektorkonstruksjoner
fragment 398 bp i lengde inneholder 3’UTR av
PIK3R2
ble forsterket ved PCR og klonet inn PMD-18T vektor (Takara) ved hjelp av følgende primere: fremover, 5’ACTAGTTGCAGATTCAGGGCTTCTCT -3 «, og omvendt, 5»-AAGCTTCCTGTATGACCTTGGGCACT -3 «. Deretter ble fragmentet subklonet inn i Spe I og Hind III-seter nedstrøms av luciferasegenet i pMIR-RAPPORT plasmid (Ambion) for å generere pMIR- PIK3R2-RAPPORT WT plasmid. Bruke pMIR- PIK3R2-RAPPORT WT plasmid som en mal, pMIR- PIK3R2-RAPPORT MT plasmid, som bar det muterte
PIK3R2
3′-UTR sekvens i komplementær stedet for frø regionen mikroRNA-126, var generert av en KOD -Plus-mutagenese Kit (Toyobo, Japan) i henhold til produsentens protokoll. De følgende primere ble anvendt: forover, 5′-TGCCATGCTTGTTATTGATATGATATAAAACATC -3 «, revers, 5′-ACAAAACCTGCCTCCCAGCTCGTGGGGC -3». Alle konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensering.
luciferasereportergenet analysen
A549 celler ble dyrket i 96-brønners plater og kotransfektert med pMIR- PIK3R2-RAPPORT WT plasmid (eller pMIR- PIK3R2-RAPPORT MT plasmid) og PE-Mir126 vektor (GeneSil Biotechnology Co., Ltd, Kina) med lipofektamin 2000. Firefly og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble målt 48 timer etter transfeksjon med Dual luciferaserapportørplasmid Assay kit (Promega, USA) i henhold til produsentens protokoll. Analysene ble utført i duplikat og gjentatt tre ganger.
Western Blot
Cellene ble lysert ved hjelp av RIPA buffer. Totalt protein (20 ug) ble kjørt på 12% SDS-PAGE og deretter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Membranen ble blokkert i tris-bufret saltvann tween-20 (TBS-T) med 3% BSA i en time ved romtemperatur. Deretter ble de inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C og etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugerte sekundære antistoffer for en time ved romtemperatur. Immunoreaktive bånd ble identifisert ved hjelp av SuperSingal vest pico kjemiluminescerende substrat og utsatt for røntgenfilmer.
Immunocytochemistry
Immunhistokjemisk farging ble utført på 5 mm seksjoner av parafininnstøpte NSCLC-vev for å bestemme uttrykket av PIK3R2 og Akt fosforylering. I korthet, for blokkering av endogen peroksidase, ble platene inkubert i 10 minutter med 3% H
2o
2, vasket med PBS i 5 minutter, og deretter i 30 minutter med 3% geiteserum i PBS. Platene ble inkubert i PIK3R2 og fosfo-Akt (Ser473) antistoff (1:250, Cell signal teknologi) over natten ved 4 ° C. Påfølgende trinn ble utført ved hjelp av EnVision ™ Systems (DAKO). De fargeintensitet er scoret og representert som følger: Resultat 0: helt negative prøver; Resultat 1: prøver med opptil 10% av positive celler; Resultat 2: prøver med 11-50% av positive celler; Resultat 3:. Prøver med 50% av positive celler
Nude Mouse Xenotransplantat Modell
Kvinne BALB /c nu /nu mus (4-5 uker gamle) ble kjøpt fra Institute of forsøksdyr, Sichuan Provincial Academy of Medical Sciences (Chengdu, Kina). A549-celler (1 x 10
6) ble suspendert i 100 ul PBS og injisert subkutant i høyre flanke område på nakne mus. Etter 10 dager, tumorene nådde 5-10 mm i diameter, og mus ble tilfeldig delt i tre grupper (5 mus pr gruppe), Dyrene mottok intratumorale injeksjoner av pE-Mir126 vektor, pE-CMV-vektoren eller PBS, henholdsvis fire ganger så på dager med 1, 3, 5 og 7, med en total dose på 3 x 10
10 plaqueforming enheter (pfu) pr tumor. Tumor dimensjoner ble målt 2 ganger hver 5 dager etter en lineær caliper. Tumorvolumet (mm
3) ble beregnet i henhold til følgende formel: lengde x bredde
2/2. Alle mus ble avlivet humant den trettiende dagen etter behandling, og resected svulster ble veid.
Genotyping
Variant rs2297882 ble genotypet ved sekvensering. MikroRNA-126 inkludert pre-mirnas ble forsterket av PCR, ble følgende primere brukes til å forsterke produktet: fremover, 5’ATTGCCGTGTGGCTGTTAG-3 «; revers, 5’CATTGCACTGTCCACTCCTG -3 «. PCR produktene ble sekvensert i begge retninger på en ABI3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). De primere for PCR ble også anvendt som sekvenseringsprimere.
Statistisk analyse
Nivået av mikroRNA-126 i forskjellige grupper ble evaluert ved t-test. Assosiasjonene mellom NSCLC risiko og SNP genotyper ble anslått av multivariabel logistiske regresjonsanalyser. Overlevelse ble beregnet fra datoen for første diagnose til datoen for enten død eller siste oppfølging. Overlevelse ble analysert ved anvendelse av Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene i fordelingen ble evaluert ved hjelp av log-rank test.
