Abstract
Bakgrunn
kreft stamceller (CSC) er antatt å være ansvarlig for svulst vedlikehold og heterogenitet. Bona fide CSC renset fra tumor biopsier er begrenset i tilbud og dette vanskeliggjør studier av CSC biologi. Videre renset stilk-lignende CSC subpopulasjoner fra eksisterende kreft linjer er ustabile i kultur. Å finne et middel for å overvinne disse tekniske utfordringer ville være et nyttig mål. I en første innsats mot dette, undersøkte vi om en kjemisk sonde som fremmer overlevelse av murine embryonale stamceller uten tilsatt eksogene faktorer kan endre funksjonelle egenskaper i bevarte tumorlinjer på en måte i samsvar med CSC fenotype.
Metodikk /hovedfunnene
de sju kreft linjene i NCI60 kolon underpanelet ble utsatt for SC-1 (pluripotin), en dobbel kinase og GTPase inhibitor som fremmer selvfornyelse, og deretter undersøkt for tumorigenicity henhold begrensende fortynning forhold og klonogene aktivitet i myk agar. ble det observert en statistisk signifikant økning i tumordannelse etter SC-1-behandling (p 0,04). Kloningseffektivitet og ekspresjon av antatte CSC-overflateantigener (CD133 og CD44) ble også øket. SC-1 behandling førte til sfære dannelse i noen kolon kreft linjer. Til slutt, SC-1 hemmet in vitro kinase aktivitet RSK2, og en annen RSK2 inhibitor økt kolonidannelse impliserer en rolle for denne kinase i å få fram et CSC fenotype.
Konklusjon /Betydning
Disse funnene validere en proof of concept studie eksponering av bevarte tumorlinjer til et lite molekyl kan gi en medgjørlig in vitro modell for å forstå CSC biologi
Citation. Mertins SD, Scudiero DA, hollingshead MG, Divelbiss RD Jr, Alley MC, Monks A, et al. (2013) et lite molekyl (Pluripotin) som et verktøy for å studere Cancer Stem Cell Biology: Proof of Concept. PLoS ONE 8 (2): e57099. doi: 10,1371 /journal.pone.0057099
Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center, Kina
mottatt: 30 januar 2012; Godkjent: 22 januar 2013; Publisert: 21 februar 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Seksjon for kreftdiagnostikk og behandling og Senter for kreftforskning ved National Cancer Institute og delvis finansiert av NCI kontrakt HHSN261200800001E. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dominic A. Scudiero, Anne Monks, og Karen M. Hite er tilknyttet SAIC -Frederick, en NCI-Frederick regjeringen entreprenør. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling, eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
kreft stamceller (CSC) er en område av betydelig interesse til kreft biologer og antas å være ansvarlig for langsiktig vedlikehold og utvidelse av både faste og hematologiske tumorer [1], [2]. Under kreft stamcelle hypotese, kan CSC forklare den observerte svulst heterogeniteten som minner om normal organutvikling og motstanden av kreft til standardbehandling [3]. Signalveier, slik som de som moduleres av Wnt, pinnsvin, og hakk er implisert i den biokjemiske karakteriseringen av CSC, men er ikke alltid finnes i alle tumortyper. Videre rollene til svulsten mikromiljøet i regulering CSC fortsette å være et område med intens studie [4].
Flere funksjonelle analyser forstås å representere de selvfornyelse, spredning og differensiering kapasiteter som forventes av CSC. For det første begrensende fortynning tumorgenisitet assays representerer en standard metode for å identifisere CSC. Denne in vivo-modell benytter immunodefekte mus inokulert med tumorcellepopulasjoner som har blitt valgt for ekspresjon av normale vev stilk celleoverflateantigener [5] – [7]. Ved å bruke den samme modellen, kan sekundære xenotransplantater etableres og reexamined for overføring av opprinnelig tumorheterogeniteten, og dermed ytterligere bekrefter nærværet av CSC. En andre assay anvender sfære i formasjonen for å selektere for CSC uttrykke stamcelle markører og tumorgenisitet [8]. For det tredje har klonogene aktivitet i soft agar er brukt til å definere CSC [9]. Andre analyser tilgjengelig for å karakter CSC fenotyper fokusere på tiltak av legemiddelresistens, quiescence, og motstand mot apoptose [10].
I enkelte krefttyper, er CSC forventes å være en sjelden undergruppe og midler til å vedlikeholde dem i kultur eksisterer ikke i dag. En kompliserende faktor beskrevet av Gupta et al. viser at etter å anrike for og dyrke en CSC-lignende subpopulasjon i en brysttumorcellelinjer, en fenotypisk likevekt inneholdende blandede subpopulasjoner returnerer [11]. Uttrykte genotyper, men kan brukes til å forutsi de operative signaltransduksjonsveier som etablerer en CSC fenotype. Modulering av de relevante reaksjonsveier hos kjemiske sonder gir et middel til å bedre forstå CSC biologi. Basert på denne begrunnelsen, undersøkte vi om et lite molekyl, SC-1 (pluripotin), kan endre og /eller påvirke egenskaper i samsvar med CSC fenotype i de syv tykktarmskreft linjene i NCI60 Tumor Linje Panel.
SC-1 ble oppdaget i et cellebasert høy gjennomstrøming det vurdert om et lite molekyl kunne opprettholde selvfornyelse av normale muse-embryonale stamceller i fravær av eksogent tilsatt faktorer slik som leukemi-inhiberende faktor eller feeder-celler [12]. Den kjemiske struktur er basert på en 3,4-dihydropyrimido (4,5-d) pyrimidin stillaset og ble optimalisert ved struktur /aktivitetsstudier. Affinitetskromatografi etablert som molekylære mål for SC-1 omfatter RasGAP og ERK1 /2, og deres hemming er tenkt å fremme selvfornyelse og hemme differensiering.
I denne rapporten har vi et proof of concept studie for å fastslå enten SC-en behandles bulk celle populasjoner av NCI60 tykktarmskreft linjer har egenskaper i samsvar med en CSC fenotype. Våre funn gir grunnlag for å forfølge videre studier som kan bekrefte tilstedeværelse av CSC i en medgjørlig in vitro modell, fremme forståelse av biokjemiske mekanismer som ligger bak CSC fenotyper, og avgjør om SC-1 er et nyttig verktøy for å opprettholde svulst biopsi-avledet CSC i kultur.
Resultater
SC-1 Økt svulstdannelse
Vi forbehandlet bulk bestander av de syv tykktarmskreft linjene i NCI60 panel med 0,1 mikrometer SC-1 ( for kjemisk struktur se fig S1), et lite molekyl som tidligere vist å fremme selvfornyelse i murine stamceller [12]. Etter fem dager med behandling ble begrensende fortynning tumorgenisitet studier utført anvendelse av subkutane injeksjoner uten ethvert protein støtte (tabell 1). Vurderer alle kreft linjer fra en enkelt underpanelet av NCI60 vil hjelpe avgjøre om noen effekt på grunn av SC-1 er universell eller svulst line-avhengige. Fem av syv tykktarmskreft linjene utstilt en høyere svulst ta sats for SC-1 behandlet linjer sammenlignet med kontroll på 10.000 celle podestoff, med COLO 205 svulst linjen viser den største forskjellen i ta sats (kontroll: 1 av 5 vs SC-1 behandlet: 4 av 5) etterfulgt av HCT-116 og HT29-tumorlinjer. Det er også viktig å merke seg at med så få som 100 celler, tumorer dannet i to av fem mus injisert med SC-1-behandlede HT29-celler sammenlignet med 0 til 5 for kontroll behandlede celler. Det var en statistisk signifikant økning i tumordannelse ved 1000 celle inokulum for HT29-behandlede celler i tillegg (tabell 1). I motsetning til dette ingen tumorer utviklet med HCT-15 tumorlinjen når som helst fortynning (tabell 1), selv om tumorer dannet i 16 dager ved en rutinemessig inokulering størrelse (1,5 x 10
6 celler pr inokulum).
Fordi kombinere tumor ta hastighet (ved 10.000 celle inokulum) kan likne en klinisk studie med pasientens tumor heterogenitet, ble en statistisk analyse utføres for å evaluere effekten av SC-1 på tumor ta frekvensen av colon tumor linje underpanelet. En vesentlig forskjell ble funnet (n = 7, Cochran Mantel-Haenzel vanlige odds ratio, kontroll svulst ta sats: 10 av 35 mus, SC-en behandles ta sats 19 av 35 mus, p = 0,04). I tillegg er disse samme resultatene plottes på nytt i grafisk form i fig S2. Hyppigheten av tumor initiere celler ble også beregnet og presentert for alle kreft linjene og de fleste SC-1 sensitive cellelinjer i Figur S3.
De data som viser økt tumor ta sats ble supplert med akselerert utseendet målbare svulster for SC-1-behandlede kolon tumorlinjer når beregnet fra plotting av gjennomsnittlig tumorvekt (opp til 2000 mg) vs tid for hver behandlingsgruppe (spekter av r for utstyrt linjer: 0.73-0.90). Ekstrapolering ble anvendt for å bestemme den dag på hvilken en 1000 mg tumor ville være forventet (tabell 2). Resultatene og etterfølgende beregninger funnet at 1000 svulster mg, i gjennomsnitt, dannet etter forbehandling med SC-1 på mindre enn halvparten av tiden for kontroll behandlede gruppen (n = 5, paret Students t test, middelverdi ± sem, SC-1-behandlede : dag 83 ± 19 vs. kontroll behandles: dag 211 ± 79). Selv om denne forskjellen ikke var statistisk signifikant (p = 0,16), er det kjent, at det for disse 5 tumorlinjer, var trenden den samme:. Tidligere tidspunkt til 1000 mg tumor utseende for SC-1-behandlede celler sammenlignet med kontroller
det er ikke sannsynlig at den observerte SC-1 induserte akselerert
in vivo
tumorvekst kan forklare den økte svulst ta sats på SC-1 behandlede kreft linjer fordi en statistisk signifikant reduksjon i celle Tallet etter
in vitro
SC-1 behandling ble observert. (N = 6, paret Student t test, p = 0,02, Tabell S1). I tillegg, var gjennomsnittlig GI
50 for tykktarmscellelinjer, når de evalueres i NCI Anticancer Screen (2 dagers eksponering), var 0.091 ± 0,07 mikrometer (gjennomsnitt ± SEM, n = 7, GI
50 (konsentrasjon på hvor forbindelsen inhiberer 50% av kontrollcellevekst)), noe som tyder på en ensartet
in vitro
vekstinhibering blant tumorlinjer. Til slutt, i en representativ SC-1-sensitive tumorcellelinjer (HCT-116), var det ingen forskjell i fordelingen av SC-1 behandlede cellepopulasjon på tvers av cellesyklus sammenlignet med kontroll behandlede celler (figur S4).
for å utforske mangelen på en tumorigen effekt for SC-1 behandlede HCT-15 celler, var den begrensende fortynning tumorigenisitet analysen gjentatt med tilsetning av Matrigel til de injiserte celler (10, 100, 1000 og 10000 celler per injeksjon). Et protein bærer slik som Matrigel kan gi forankring, et substrat for angiogenese, og vekstfaktorer. I dette tilfelle, som vist tidligere [7], så få som 10 celler var nødvendig for å danne svulster (tar sats to av fem mus) når HCT-15 kontrollceller ble ko-injisert med Matrigel. For SC-1 behandlede celler ko-injisert med Matrigel, 5 av 5 mus hadde tumordannelse over hele 99 dagers observasjonsperioden på 10 celle inokulum (figur 1). På den gjenværende celle inokula (100, 1000 og 10000 celler pr injeksjon med Matrigel), tumorer dannet i alle mus, uavhengig av eksperimentell behandling.
begrensende fortynning tumorgenisitet Analysen ble utført med samtidig injeksjon av Matrigel. A. Kontroll behandlet HCT-15 svulst linje. B. SC-en behandles HCT-15 svulst linje. Tumorvekt for hver mus er vist. Svulstdannelse ble økt i SC-1 behandlede celler når 10 celler /mus ble injisert (SC-1 behandlet: 5 av 5 svulster dannes, Kontroll behandlet: 2 av 5 svulster dannes). Ved høyere celle inokula, alle mus dannet tumorer uavhengig av behandling. Hver linje i begge grafene representerer en vekst på en svulst per mus (A. A-E, B. F-J).
Kloning Effektivitet ble økt etter SC-1 Behandling av Colon tumorlinjer
Fordi forbedret klonogene kapasitet i bløt agar har vært knyttet til CSC avledet fra pasientens CNS og prostata tumorer [9], [13], var det av interesse å vurdere om SC-1 behandlede kolon tumorlinjer ble påvirket på samme måte. De tre tumorlinjer med de største SC-1-induserte tumordannelse (COLO-205, HCT-116, og HT29) hadde signifikant økning i kloningseffektivitet (figur 2A, n = 3, paret Students t test, p = 0,001 (COLO 205, HCT-116) og p = 0,01 (HT29)) som gjorde HCC-2998 og KM12 tumorlinjer. Det er bemerkelsesverdig at alle tumorlinjer hadde øket kloningseffektivitet etter SC-1 behandling dersom analysen ble utført under anvendelse av Matrigel i stedet for bløt agar (data ikke vist). Således blir SC-1 funnet å forbedre kolonidannelse
in vitro
.
colon tumorlinjer ble behandlet i fem dager med 0,1 uM SC-1, høstet og deretter analysert for deres evne til å danner kolonier i soft agar, å endre uttrykk for antatte CSC overflatemarkører, og for å danne kuler. A. kloningseffektiviteten av kolon tumorlinjer ble bestemt etter behandling med SC-1. I 5/7 tumorlinjer, SC-1-behandlede celler hadde statistisk signifikant økning i kumulativt kolonidannende enhet (CFU) masse sammenlignet med kontroll behandlede celler (*** p 0,001, ** p 0,1 * p 0,05, n = 3). I ett tilfelle (# p 0,05), SC-1 behandling redusert kloning effektivitet. B. CD133 positive subpopulasjonen var øket 2,5 ganger i SC-1 behandlede HT29 kolon tumor linje (p = 0,03, n = 3). De CD44 + CD24- undergruppe ble øket etter SC-1 behandling i HCT-116 colon tumor linje (* p 0,05, n = 3). De CD44 + subpopulasjonen ble øket betydelig etter SC-1-behandlinger (* P 0,05, n = 3) i SW-620 colon tumor linje. C. Tre tumorlinjer (COLO 205, HCT-116, HT-29) som er utformet ikke-tilfestede kuler i nærvær av 0,1 uM SC-1 dyrket i standard medium inneholdende 5% FBS. Disse observasjonene var også tydelig på dag 5 i kultur. Alle bildene ble utarbeidet på 400 × forstørrelse.
Uttrykk for Antatte CSC Markers ble økt i Colon Tumor Lines følgende SC-1 Behandling
Monoklonale antistoffer angivelse overflateantigener på nylig isolerte tumorprøver har blitt brukt som verktøy for å isolere CSC. For eksempel, O’Brien et al. [6] og Ricci-Vitiani et al. [14] renset CSC fra kolorektal tumorer via glykosylert CD133 epitop. Andre CSC markører inkluderer CD44 (enten i nærvær eller fravær av CD24), CD326, CD166 og [5], [9], [15] – [18]. Således ble ekspresjonen av disse markørene undersøkt etter fem dager med SC-1-behandling.
En statistisk signifikant økning i antallet av celler som uttrykker CD133 glykosylerte epitopen ble funnet med HT29-tumor linjen etter SC-1 behandlingen (figur 2B, n = 3, sammenkoblet to-halet Student t test, p = 0,003, middelverdi ± sem, kontroll behandlet: 11,6 ± 3,7% positiv, SC-1-behandlede: 27,6 ± 3,6% positiv). I SW-620-tumorlinjen ble CD44 subpopulasjon øket etter behandling med SC-1 (figur 2B, n = 3, paret Students t test, p = 0,03, gjennomsnitt ± sem, kontroll behandlet: 39,6 ± 8,5% positiv, SC -1 behandlet: 74,1 ± 13,4% positive). Ingen økt ekspresjon av de formodede CSC markørene var tydelig for COLO 205 tumorlinje (en SC-1-sensitive tumor linje). Ingen endringer ble observert i CD326 og CD166 overflate uttrykk for hvilken som helst av tumorlinjer. Dermed endring i uttrykket av visse CSC overflatemarkører skjedde etter SC-en behandling i kolon tumorlinjer varierte med svulsten linje.
Spheres dannes etter SC-1 Behandling
Sphere formasjonen er en CSC karakteristikk, enten avledet fra pasientens tumor [18] eller bevarte tumorlinjer i hjernen, brystet, eller hud dyrket under serumfrie forhold [8]. SC-1-behandlede kolon tumorlinjer ble kontrollert for sfære formasjon anvendelse av celletettheter tidligere publiserte [19], [20] og i nærvær av serum. Fordi serum er tenkt å inneholde differensierende agenter [21], kan denne analysen vurderes strengere enn andre [22]. I HCT-116 og HT29-tumorlinjer, ensartede tilfestede kuler med godt definerte grenser som dannes i 24 timer (figur 2C) til tross for tilstedeværelsen av serum. I tillegg forekom sfære formasjon i en brøkdel av den dyrkede COLO 205 tumorcellelinjer (figur 2C). Disse samme forandringer i morfologi var også til stede på dag 5 etter behandling (data ikke vist). I de gjenværende tumorlinjer, ble sfære dannelse funnet ved konsentrasjoner høyere enn de som ble testet her (data ikke vist). Kulen-analysen ble gjentatt under anvendelse av serumfrie betingelser og tilsvarende resultater ble oppnådd (fig S5).
SC-1 Behandling Redusert Phospho-ERK1 /2 og Økt OCT4 Protein ekspresjonsnivåer
En tidligere rapporten [12] viste at SC-1 hemmet fosfor-ERK1 /2 protein nivåer etter 30 minutter av eksponering i murine embryonale stamceller fører til vedlikehold av selvfornyelse
in vitro
uten lymfocytt hemmende faktor eller feeder-celler. For å bestemme om SC-en nådde samme mål i de behandlede kolon tumorlinjer ble endringer i mengde av fosfo-ERK 1/2 (p-ERK) og total ERK1 /2-protein undersøkt ved immunoblotting ved tidspunkter som ligner de tidligere studert (Figur 3A). I HT29 behandlede tumor linje, fosfor-ERK 1/2 protein nivåer (i forhold til summen ERK1 /2 protein nivåer) ble redusert i 5 min (67 ± 0,06% av kontrollverdien), nådde en bunn på 1 time (46 ± 0,06 % av kontroll), og forble nedsatt under resten av tidsforløpet (4 timer, 68 ± 0,10% av kontrollverdien). Således er det sannsynlig SC-1 blir nådd sin beslektet molekylære mål på HT29-tumorlinjen.
kolon tumorlinjer ble behandlet med SC-1 (0,1 uM), høstet, lysert og undersøkt for proteinene ifølge interesse etter elektroforese i SDS-PAGE-geler på angitte tidspunkter. A. I SC-1 behandlede HT29-tumor linje, fosfo-ERK1 /2 /samlede ERK1 /2-proteinnivåer ble redusert til 67 ± 0,06% av kontrollverdien etter 5 min, 56 ± 0,06% av kontrollverdien på 30 min, og 46 ± 0,06% av kontrollverdi på 1 time (n = 3, p 0,05). B. Økt OCT4 protein ekspresjon på grunn av SC-1 var avhengig av tumorcellelinjer. Representative eksperimentene er vist for figur S4A-B (n = 2).
Økte nivåer i OCT4 protein uttrykk i SC-1 som ble behandlet kolon tumorlinjer ville være i samsvar med identifisering av SC-1 i en celle-basert skjerm som detekteres opprettholdelse av en OCT4-mediert GFP signal i mus embryonale stamceller vokser uten eksogene faktorer eller feeder-celler [12]. OCT4 er en transkripsjonsfaktor viktig for embryoutvikling og regulerer pluripotency [23]. Derfor, ble forandringer i OCT4 proteinnivåer etter eksponering for SC-1 evaluert. I to av de syv kolon tumorlinjer (HCC-2998 og HT29), ble OCT4 proteinekspresjon øket med SC-1-behandling (figur 3B). For de resterende tumorlinjer, OCT4 protein uttrykk var uendret eller redusert. Den variable effekten av SC-1 på OCT4 protein uttrykk korrelerte ikke med tumordannelse. Derfor er det lite sannsynlig OCT4 spiller en viktig rolle i de observerte SC-1 effekter.
SC-1 hemmet RSK2
In Vitro Hotell og en RSK2 inhibitor Økt Colony Forming
en bioinformatiske pathway analyse [24], [25] av gener som korrelert med NCI60 GI
50 fingeravtrykk for SC-1 foreslått en rolle for RSK2 og dens regulerende aktivitet i mTOR veien. RSK2 (90 kD ribosomal S6-kinase), en kinase med både N- og C-terminale funksjonelle domener, fosforylerer flere mål og blir fosforylert av ERK1 /2, en annen SC-1-målet. Som et nedstrøms effektor, RSK2 signalene mange cellulære atferd inkludert celle overlevelse, vekst, spredning og migrasjon [26]. Det er også bemerkelsesverdig at en kongener av SC-1 har blitt co-krystallisert med Bcr-ABL1 kinase [27], som tyder på at SC-1 kan ha andre molekylære mål. Vi undersøkte hvorvidt SC-1 kunne inhibere
in vitro
kinaseaktivitet av RSK2 og fant en EF
50 2,5 ± 1,8 uM (figur 4A, EC
50, konsentrasjon ved hvilken det sammensatte inhiberer 50% av kontrollaktiviteten, n = 5). Potensiell inhiberende aktivitet av SC-1 på et tilfeldig utvalg av andre proteinkinaser (Aurora-kinase B, CHK1, og CHK2) ble også evaluert i den samme analysen, og ingen virkning ble funnet (Figur 4A). For å avgjøre om aktiviteten til relaterte (til RSK2) protein kinaser i AGC kinase familien ble hemmet av SC-1, ble ytterligere studier gjennomført (Tabell 3). Ingen hemmende virkning på kinase-aktivitet ble funnet for akt1, PKA og PKC ved eller under den maksimale konsentrasjonen testet (10 uM); imidlertid, SC-1 var hemmende for p70S6K (1,4 uM IC
50). Fordi SC-1 inhiberte disse utvalgte kinaser i mikromolområde og kinaseanalyse er atskilt fra den ene rapportering av data i figur 4A, ble den positive EC
50 verdi for Abl1 kinase rapportert i tabell 3 i tillegg. Disse funnene var i samsvar med forutsigelser rapportert av Okram et al. [27].
COLO 205 tumorcellelinjen ble behandlet med SL0101 (1,25 mm) og SC-1 (0,1 mm) i 24 timer før soft agar kloning, lysat forberedelse, og immunoblotting. A. SC-1 hemmet RSK2 N-terminal domain
in vitro
kinaseaktivitet med en EC
50 på 2,5 ± 1,8 uM (gjennomsnitt ± SD, n = 5), men ikke i andre som analyser for Aurora kinase B, CHK1 eller CHK2 kinaser. B. Redusert RSK2 proteinnivåer (33%) ble funnet i 5 døgn etter SC-1-behandling i COLO 205 tumorlinje (n = 2). C. Behandling (24 timer) av COLO 205 tumor linje med SL0101, en kaempferol glykosid RSK2 inhibitor, økt kolonidannelse (≥60 um) i bløt agar (n = 2, representative forsøk vist).
Siden SC-1 hemmet RSK2 kinase aktivitet, må vi først bestemt om RSK2 protein nivåer ble endret. Etter 5 dager med eksponering til 0,1 uM SC-1, ble RSK2 protein nivåer signifikant redusert 33% i COLO 205 tumorlinje (p = 0,007, n = 3, figur 4B).
Hvis RSK2 spiller en rolle i celle signalisering viktig for CSC fenotype, ville det være forventet at forbedret kolonidannelse ville finne sted etter behandling med en kjent RSK2 inhibitor. For dette formål, ble COLO 205 tumorcellelinjer behandlet med SL0101, en kaempferol glykosid med ingen aktivitet mot MEK, Raf, eller PKC [28], i 24 timer før kloning i myk agar og evaluert med hensyn på kolonidannelse 7 dager senere. Statistisk signifikant økning i kolonidannelse ble funnet ved 1,25 uM behandling og på alle platekledning tettheter (figur 4C, n = 3, sammenkoblet to-halet Student t test, p = 0,05). For SC-1 behandlede celler på dette forkortet eksponeringen (24 timer (Figur 4C) vs. 5 dager (figur 2A)), ble økt kolonidannelse finnes bare på det høyeste plating tettheten.
Diskusjoner
Bulk bestander av kolon kreft linjer fra NCI60 Panel ble utsatt for et lite molekyl som overfører selvfornyelse egenskaper og undersøkt for egenskaper i samsvar med CSC fenotype. Forbehandling med SC-en økt tumorigenicity ved lav cellepodestoffer i HT29 og HCT-15 tumorlinjer. Kloning i myk agar ble økt i de fleste kreft linjer. Andelen av celler som uttrykker CD44 og CD133, antatte CSC-overflateantigener, ble øket. Sfære formasjon som reaksjon på SC-1-behandling ble også observert i henhold til serum innehold og serum-frie betingelser. For å bekrefte at SC-1 ble endre sin beslektet molekylære mål, protein ekspresjon av fosfo-ERK1 /2 ble målt og funnet å avta etter 5 min og opp til 4 timer etter eksponering. Ekspresjon av OCT4, en transkripsjonsfaktor som opprettholder pluripotency i normale embryonale stamceller, ble øket i noen (2/7) av tumorlinjer etter SC-1-behandling. SC-1 hemmet RSK2
in vitro
kinase aktivitet. Et resultat i tråd med dette funnet, en annen RSK2 hemmer styrke clonogenicity av et kolon svulst linje, innblandet dette proteinet som kandidat molekylære mål å formidle CSC fenotype.
Funnene i denne proof of concept studie som spør om en liten molekyl kan modifisere og /eller indusere karakteristika er konsistente med CSC fenotype i kolon tumorlinjer støtter muligheten for å bruke et lite molekyl for å etablere en
in vitro
modell av CSC biologi. HT29-tumorlinjen ble vist å være den mest SC-1-sensitive siden tumorer ble funnet med så få 100 SC-1-behandlede celler, ble clonogenicity øket, kuler dannet under betingelser som vanligvis begrenser slik morfologi og under betingelser som var ettergivende, og ekspresjon av CD133 og OCT4 ble økt. Dermed er det flere muligheter for å forske CSC biologi foreslått. Først kan SC-1 behandlede kolon svulsten linje subpopulasjoner uttrykker antatte CSC antigener bli renset, så reexamined for egenskaper i samsvar med CSC fenotype å forbedre
in vitro
modell. Det vil også være av interesse å finne ut om SC-en kan opprettholde en antatt HT29 CSC undergruppe i langsiktig kultur, overvinne den fenotypiske likevekt beskrevet for ustabil stammen lignende undergruppe identifisert i SUM159 brystsvulst linjen [11]. Alternativt kan stammen lignende celler som finnes i SUM159 brysttumorcellelinjer bli utsatt for SC-1 for å bestemme om en undergruppe går tilbake til sin blandet likevekt av stammelignende og ikke-stilk-lignende celler eller opprettholdes som stilk-aktig. Og til slutt, som opprinnelig foreslått, svulst biopsi avledet CSC kan behandles med SC-en for å finne ut om sin fenotype opprettholdes.
Klar identifikasjon av en undergruppe eller subpopulasjoner påvirket av SC-1 kunne ikke fastslås her fordi bulk bestander av tumorlinjer ble behandlet. For å øke sannsynligheten for å demonstrere en SC-en effekt, ble heterogene tumorlinjer utnyttet. Således er det mulig at enten SC-1 opprettholdes CSC karakteristikker hatt kontakt i colon tumorlinjer eller biokjemisk etablert de funksjonelle målte parametrene
de novo
. Hvis det siste er tilfelle, resultatene støtter ideen om at CSC fenotype er av plast [29].
Det er viktig å merke seg at en SC-en effekt var ikke konsekvent på tvers av de sju kolon tumorlinjer (tabell 4 ). For eksempel ble samlet tumorgenisitet av SC-1-behandlede tumorceller betydelig økt ved 10000 celle inokulum men i hvilken grad dette skjedde var avhengig av tumorcellelinjer og betingelsene for tumorigenisitet analysen. HT29-behandlede tumor linje ble ansett som den mest SC-1-sensitive cellelinjen fordi bare 100 celler var nødvendig for å danne svulster mens, under de samme begrensende forhold (fravær av et protein støtte), HCT-15 tumorceller var ikke i stand til å danne svulster, selv i kontroll forhold og 10000 cellepodestoff. Tilsetting av Matrigel til både kontroll og behandlet HCT-15 tumorlinjen forbedres tumorigenicity og demonstrert en SC-en effekt på 10 cell podestoff. Enten Matrigel var rett og slett en fellemekanisme, en tilførsel av vekstfaktorer, eller en passende matrise for angiogenese er ikke klar på dette tidspunkt, og venter på videre studier. Videre er det kritiske behov for Matrigel for HCT-15 tumorlinjen vokse
in vivo
antyder at reseptorene som integriner som binder ekstracellulære matrisekomponenter og signalcelleoverlevelse kan være avgjørende for å studere CSC biologi. Det er bemerkelsesverdig at integrin-reseptorer er mulige CSC overflatemarkører [30], [31]; SC-1 kan moduler disse reseptorene.
Det er viktig, men ikke eksisterer en konsistent definisjon av CSC overflatemarkører [32], [33]. Antatte CSC overflatemarkører ble evaluert etter SC-en eksponering i tykktarm tumorlinjer og eventuell endret uttrykk var ikke universell, i samsvar med tidligere studier. Men CD133, en bemerkelsesverdig og felles kolon CSC markør i biopsiprøver, ble økt ca. 2 ganger i behandlet HT29 tumor linje. Videre HT29-tumor linje var den mest SC-1-sensitive linje med hensyn til tumorigenisitet. Derfor kan SC-en utsatt HT29 tumorlinjen være en egnet modell for CSC som uttrykker CD133. Men for å oppsummere, er det fortsatt mulig at mekanistisk, SC-1-virkning på CSC egenskaper generelt, og overflatemarkør effekt, spesielt, kan avhenge av den underliggende genetiske og epigenetisk heterogenitet og ikke alle tumorlinjer utsettes for SC-1 vil bli nyttig
in vitro
modeller. Til sammen dataene i denne rapporten støtter forestillingen om at stilk-lignende egenskaper er ikke bare heterogene mellom tumortyper, men også mellom svulster som oppstår fra samme organ som indikerer at det er stor plastisitet i generering av CSC videre.
SC-en eksponering indusert ikke-klebende sfære formasjon og i nesten alle celler i HT29 og HCT-116 tumorlinjer på 0,1 mikrometer dose testet. Denne analysen ble utført på en annen måte fra tidligere rapporter [19], [20] ved anvendelse av bovint fosterserum og vevs kulturbeholdere som letter cellene skulle vedhefte og kan ansees å være mer stringent ettersom serum kan indusere differensiering [21]. Andre studier, der serum og tilhenger overflater ble fjernet, bekreftet dette funnet. Samlet utgjør disse funnene tyder på at SC-1 kan være å fremme en av de nødvendige prosesser for metastaser, løsrivelse fra den primære svulsten. Enten teser fremgangsmåten er i samsvar med definisjonen av en kreft stamcelle er ikke klart for tiden, men antyder en rolle for SC-1 i EMT overgangen [34].
Det er sannsynlig at SC-1 er nå i minst en av sine rapporterte molekylære mål (ERK1 /2) [12], siden så tidlig som 5 min etter eksponering, forholdet av fosfo-ERK1 /2 til total ERK1 /2-proteinnivåer ble redusert i det HT29-tumorlinjen. Videre er den lipofile natur av SC-1 (målt ved log P) antydet at det er i stand til å krysse cellemembranen. Mens MAPK signal forventes å fremme vekst og dens hemming ville være antitumorigenic [35], dynamikken i ERK1 /2-hemming og andre kjente og ukjente mål for SC-1 kan fremme funksjonelle egenskaper vi studerte.
virknings~~POS=TRUNC mekanismen~~POS=HEADCOMP av SC-1 er ukjent på denne tiden og vi satt i gang studier utnytte de offentlig tilgjengelige data, genuttrykk profiler i NCI60 kreft narkotika Screen [24], [25] for å undersøke dette. Spesielt er en bioinformatikk sti analyse av gener som korrelerte med SC-1 NCI60 GI
50 midlere kurve som foreslått en rolle for den mTOR-reaksjonsveien i å modulere observert vekstinhibitoriske effekter (
in vitro
) med RSK2 inkludert i mTOR-reaksjonsveien [26]. I to separate
in vitro
kinase hemming analyser, RSK2 ble hemmet av SC-1. Videre, når den COLO 205 tumorlinjen ble utsatt for en kjent RSK2 inhibitor (SL0101 ved lav konsentrasjon), økt klonogene aktivitet ble observert; dermed antyde RSK2 kanskje, minst, spille en rolle i å fremme clonogenicity. Men
in vitro
EF
50 på 2,5 mikrometer konsentrasjon på over SC-1 (0,1 mm) brukes i alle studier som er presentert her. Denne motsetningen kan forklares med en langsom katabolsk rate på SC-1 eller transport parametere som konsentrerer SC-1 intracellulært til nivåer som nærmer seg den målte EC
50.
