Abstract
Lungekreft er en av de ledende maligniteter over hele verden, men reguleringsmekanisme for sin vekst og metastasering er fortsatt dårlig forstått. Vi har undersøkt den mulige ekspresjon av immunoglobulin G (IgG) gener i squamous celle-karsinomer og adenokarsinomer i lunge og beslektede cancercellelinjer. Rikelig mRNA av IgG og viktige enzymer for IgG-syntese, ble rekombinasjon aktiverings gener 1, 2 (RAG1, 2) og aktiverings-indusert cytidin deaminase (AID) detektert i kreftcellene, men ikke i tilstøtende normalt lungevev eller normal lunge epitelcellelinje . De omfang av IgG uttrykk i 86 lunge kreft ble funnet å assosiere med klinisk stadium, patologisk karakter og lymfeknutemetastase. Vi fant at knockdown av IgG med siRNA resulterte i reduksjon av cellulær proliferasjon, migrasjon og tilhørighet for dyrkede lungekreftceller. Metastaseassosierte gen 1 (MTA1) syntes å være co-uttrykkes med IgG i lungekreftceller. Statistisk analyse viste at hastigheten for IgG-ekspresjon ble signifikant korrelert med den i MTA1 og til lymfeknutemetastaser. Hemming av MTA1 genuttrykk med siRNA førte også til nedgang av cellular migrasjon og vedlegg for dyrkede lungekreftceller. Disse bevisene antydet at hemming av kreft migrasjon og vedlegg indusert av IgG nedregulering kan oppnås gjennom MTA1 regulatoriske veien. Våre funn tyder på at lungekreft-produserte IgG er sannsynlig å spille en viktig rolle i kreft vekst og metastasering med betydelige kliniske implikasjoner
Citation. Jiang C, Huang T, Wang Y, Huang G, Wan X, Gu J (2014) immunoglobulin G uttrykk på lungekreft og dens virkning på metastasering. PLoS ONE 9 (5): e97359. doi: 10,1371 /journal.pone.0097359
Redaktør: Oliver Schildgen, Kliniken der Stadt Köln gGmbH, Tyskland
mottatt: 19 desember 2013; Godkjent: 17 april 2014; Publisert: May 22, 2014
Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd (30971150 til JG, 81001199 til ZC) fra Natural Science Foundation of China National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de ledende ondartede svulster over hele verden med en svært høy dødelighet [1], [2]. Metastase er den viktigste årsaken til død og opp til dags dato er det ingen effektiv behandling for metastatisk lungekreft. Lungekreft kan deles inn i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC) basert på deres patologiske egenskaper og kliniske oppførsel [3]. NSCLC står for 84% av lungekrefttilfellene, hvorav de fleste er plateepitelkarsinom (LSCC) og adenokarsinom (LAC) [4]. LSCC og LAC ble valgt som objektene i denne studien.
Nylig, akkumulerte bevis har vist at humane tumorceller, inkludert kreft i bryst, lunge, prostata, tykktarm, spiserør, skjoldbruskkjertel og placenta trophablast samt sarkomer kan syntetisere immunoglobulin G (IgG) [5] – [19]. De essensielle enzymer inkludert rekombinasjon aktiverings gener 1, 2 (RAG1, 2) og aktivisering-indusert cytidindeaminase (AID) for å syntetisere IgG i B-lymfocytter og plasmaceller ble også funnet i kreftceller [20] – [22]. CA215, et immunglobulin superfamilien proteinet opprinnelig isolert fra ovariekreft ble antatt å være IgG av kreft opprinnelse [23] – [25]. Blokkering av kreft IgG med antisens RNA eller IgG-antistoff trykkes kreftcellevekst og øke apoptose [5], [26] – [28]. Ved å påvise IgG-ekspresjon i 142 spiserøret kreft og 80 bløtvevssvulster, og komparativ analyse av IgG uttrykk med patologiske parametre, ble kreft IgG funnet å korrelere med tumor karakter og proliferative markører som PCNA og ki-67 i kreft i bryst, spiserør og mykt vev [8], [11], [29]. Disse resultatene tyder på at kreft IgG kan spille en rolle i å regulere veksten av kreft. Imidlertid har effekten av IgG i lungekreft og mulig mekanisme som styrer sine handlinger ikke undersøkt.
metastaser er en kompleks prosess som involverer ulike proteiner som fungerer på løsne kreftceller fra primære områder, infiltrere i kar og lymfesystemet , forankring til endothelia, dyrkelse rundt matrise, extravasating, indusere angiogenese, unngå anti-tumor immunitet, og vokser med metastaser. Metastase-assosierte gen 1 (MTA1) er en integrert del av den nucleosome ombygging og deacetylering (Nurd) -komplekset av histon [30], [31]. MTA1 regulerer transkripsjon av metastaserelaterte gener ved å endre målet kromatin acetylering status samt kofaktor tilgjengelighet til målet DNA. Høy MTA1 uttrykket har blitt funnet å være nært knyttet til invasjon og lymfatiske metastaser i ulike karsinom [32] -. [34]
I denne studien undersøkte vi fordelingen mønster av IgG, og forholdet mellom sitt uttrykk og patologiske parametre i 86 LSCC og LAC. Vi undersøkte ytterligere mulige virkninger av kreft produsert IgG på cellulær festing og migrering ved hjelp av teknikken med siRNA innblanding i et vedlegg assay, en transwell-analyse, og et sårheling assay med to lungecancercellelinjer, så vel som en normal lunge epitelial cellelinje. Vi har også studert forholdet mellom IgG genekspresjon og et antall av metastatiske relaterte gener. Vi fant at kreft IgG kan spille en nøkkelrolle i lungekreft metastase gjennom å regulere metastatisk genet MTA1.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og godkjent av etisk komité Shantou University Medical College. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter eller deres familier for å bruke prøvene til forskning.
Cellelinjer
Menneskelig lunge plateepitelkarsinom cellelinje SK-MES-1, lunge adenokarsinom cellelinje A549, normal lunge epitelcellelinje linje Beas2B, og Burkitt lymfom cellelinjen Raji ble anskaffet fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i DMEM med 10% FBS. Alle cellelinjene ble dyrket i fuktig atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C.
vevsprøver
Åtti-seks formalin feste parafin innebygd lungekreft eksemplarer inkludert tilstøtende normal lunge vev ble hentet fra Avdeling for patologi, Shantou University Medical College tilknyttet Tumor Hospital og Institutt for patologi, Xiangyang Central Hospital, Hubei-provinsen 2006-2011 med fullstendig klinisk informasjon aldre, kjønn, histologisk type patologisk karakter, klinisk stadium og lymfeknute metastasering. To praktiserer patologer re-undersøkt hematoxylin og eosin (H E) glir å bekrefte diagnosen uavhengig. For immunhistokjemi (IHC) og in situ hybridisering (ISH), ble prøvene kuttet i 3 mikrometer tykke seriesnitt. Fire nye kirurgiske prøver (to LSCCs og to Lacs med tilstøtende normalt vev) ble hentet fra Institutt for Hjerte kirurgi, Shantou University Medical College tilknyttet Tumor Hospital og bevart ved -80 ° C før utpakking RNA fra celler isolert med laser guidet mikrodisseksjon (LMD) .
Immunohistochemistry
IHC ble utført som beskrevet tidligere [35]. Kort fortalt ble 3,5 mikrometer seksjoner deparaffinized i xylen, hydrert i avtagende konsentrasjoner av etanol og deretter skylles i rennende vann fra springen. Glassene ble inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Deretter ble platene inkubert med et sekundært antistoff (PV9000; Zymed Laboratory, South San Francisco) og visualisert med 3-amino-9-etyl-karbazol (AEC, Golden Bridge International). De primære antistoffer ble oppført i tabell S1. Obduseres sunne mandel vev ble brukt som positive kontroller for Igγ, Igκ og Igλ immunostainings. PBS i stedet for primære antistoffer ble brukt som en negativ kontroll. For å sikre spesifisiteten av farging, ble et antistoff pre-absorpsjon test utført i hvilket det primære antistoff mot Igγ ble pre-inkubert med rent humant IgG ved det molare forhold av 01:01, 01:05 og 01:10. Den blandede løsning ble inkubert ved 4 ° C over natten, og deretter brukes i stedet for det primære antistoff.
Igγ og MTA1 uttrykk anledninger
Skårer for Igγ immunfarging ble utført som tidligere beskrevet med mindre endring [8]. Prosent og intensitet av positive celler ble kjøpt opp ved å telle tumorceller fra 10 tilfeldig utvalgte synsfelt etter 400 × forstørrelse. Scoring av 0-3 for prosentandelen av positive celler var: 0 = mindre enn 5%; 1 = 5-25%; 2 = 25-50%; og 3 = 50%. Intensiteten av IHC-farging ble poeng: 0, 1, 2, 3, som representerer fravær av signal, svakt signal (lyserød), moderat signal (rød) og sterkt signal (mørk rød), respektivt. Det endelige resultatet for hvert tilfelle ble bestemt ved å legge de to score sammen og det samlede resultatet ble tildelt negativ (-) når summen var 0 eller 1, svakt positiv (+) når summen var 2 eller 3, moderat positive (++ ) når summen var fire eller fem, og sterkt positiv (+++) når summen var 6. for å studere sammenhengen mellom Igγ og MTA1, prøver av lungekreft ble delt inn i 2 grupper i henhold til resultatet av Igγ farging. Saker med score til 0-3 ble ansett som «svake uttrykk» og 4-6 som «sterkt uttrykk»
Skårer for MTA1 farging ble beregnet ved hjelp av en merking index (LI) som følger:. LI = 100 x (p /t)% ( «p» er antall MTA1-positive cancerceller og «t» er det totale antallet kreftceller). Omtrent 3000 celler under × 400 forstørrelse ble telt (10 tilfeldig utvalgte felt på hver side).
In situ hybridisering
De prober ble utviklet for å oppdage humant immunglobulin G1 tung kjede konstant region (IGHG1) . PCR-primere for IGHG1 var som følger: forstand, 5′-ACGGCGTGGAGGTGCATAATG-3 «; antisense, 5»-CGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTT-3 «. Fremgangsmåten for å syntetisere de spesifikke prober er blitt rapportert tidligere [6]. Kort sagt, ble en sprukket milten forårsaket av traumer anvendt for å separere lymfocyttene. PCR-produktet ble subklonet inn pGEM-T vektor (Tiangen Biotech, Beijing, Kina). Deretter endonukleasen
Nco
I eller
Sal
I ble brukt til å linearisere nye plasmidet, og T7 eller Sp6 RNA-polymerase ble brukt for å generere antisense eller forstand sonde med det nye plasmidet som en mal.
ISH ble utført som tidligere beskrevet [8]. Kort sagt, deparaffinized, rehydratiserte vev objektglass ble behandlet med 0,1 M HCl i 10 minutter, oppvarmet til 100 ° C i citrat-buffer (0,01 M, pH 6,0) i 15 minutter og fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og deretter dehydrert ved 90 % etanol. Inntil fullstendig tørt, ble objektglass inkubert med 20 ul hybridisering blanding inneholdende 18 ul fortynningsmiddel og 2 ul følelse eller antisense-sonde ved 50 ° C i 18~20 timer. Etter vasking med 5 x SSC, 2 x SSC pluss 50% formamid og 2 x SSC to ganger i 15 minutter ved 37 ° C, ble objektglass blokkert med hesteserum ved romtemperatur i 1 time, og inkubert med anti-digoxigemin-Ap Fab-fragmenter (1:500, Roche Diagnostics, Rotkreuz, Sveits) ved romtemperatur i 1 time. Lysbilder ble farget ved hjelp av NBT-BCIP (Promega, Madison, USA). For dyrkede celler vokser på lysbilder, alle prosedyrer var lik vev lysbilder unntatt deparaffin, rehydrering og oppvarming henting. Andre lysbilder ble inkubert med sanse sonder som negative kontroller.
immunfluorescens
A549, SK-MES-1 og Beas2B fikk lov til å vokse på lysbilder. Immunofluorescens ble utført i henhold til en protokoll som tidligere beskrevet [11]. De primære antistoffene som anvendes i denne analysen er beskrevet i tabell S1. Etter vasking i PBS ble objektglass inkubert med FITC-konjugert geite-anti-kanin /geite-anti-mus IgG (Zhongshan Golden Bridge, Beijing, Kina) ved romtemperatur i 30 min. DAPI ble benyttet til å counterstain kjerner. Skinnene ble undersøkt og fotografert med en fluorescens mikroskop (Zeiss AxioImager Z1, Zeiss GmbH, Göttingen, Tyskland).
laserstyrt mikrodisseksjon, RNA ekstraksjon og revers transkripsjon
Fersk frosne vevsprøver ble seksjonert 10 mikrometer, montert på en polyetylen naftalat (PEN) -membrane lysbilde (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og deretter umiddelbart løst i 75% etanol i 1 min. Målceller i seksjonene ble microdissected og samlet inn til hetten av en Eppendorf rør med laser makt ved hjelp av Leica mikrodisseksjon Systems 6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Total RNA ble ekstrahert fra isolerte celler med en RNeasy mikro Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Target cDNA ble syntetisert med et hevet III første-strand syntese kit (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner.
TRIZOL (Invitrogen), ble kloroform, isopropanol og etanol brukes til å trekke ut RNA fra vevsprøver i henhold til en protokoll som levert av Invitrogen. RNase Free DNase (Invitrogen) ble anvendt for å fjerne mulig genomisk DNA-forurensning. Target cDNA ble generert med første cDNA systhesis kit (Toyobo vitenskapelig, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner.
Polymerase kjedereaksjon (PCR)
Som beskrevet tidligere, IGHG1, RAG1, RAG2, og AID ble forsterket med nestet PCR [8]. Primerne (Sangon Biotech, Shanghai, Kina) som brukes i denne analysen er oppført i Tabell S2. PCR-produktene ble undersøkt med 2% agarosegel-elektroforese. Vann i stedet for cDNA ble anvendt som PCR-malene som negative kontroller for disse gener hvis primere over to eksoner. For RAG1, RAG2 og Igκ, som primere som befinner seg i en ekson, ble RNA behandlet med DNase anvendt som en negativ kontroll. Raji-cellelinjen ble anvendt som en positiv kontroll. Husholdningsgenet GAPDH ble brukt til å normalisere de relative uttrykk nivåer.
DNA-sekvense
PCR prodocts for V m, Vκ og Vλ ble ekstrahert med agarosegel DNA Extraction Kit (Takara Biotech, Dalian, Kina) og deretter klonet inn i en pGEM-T vektor (Tiangen Biotech, Beijing, Kina). Etter transfektert inn Kompetent
E. coli
TOP10, nye kloner ble dannet som ble forsterket med bakterier avl. Deretter ble nye kloner renset med Universal DNA Purification Kit (Tiangen Biotech) og undersøkt med 2% agarosegel-elektroforese. De nye kloner ble brukt i DNA-sekvensering, som ble utført av BGI-Shenzhen, Kina. Sekvensene av de nye kloner ble sammenlignet med kjente sekvenser i GenBank nettsted (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Real-Time PCR og kvantitativ analyse
Ved hjelp av en ABI PRISM 7500 instrument, ble real-time PCR utført med SYBR Premiks Ex Taq II (Takara Bio, Inc., Dalian, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. For å oppdage nedstrømsgener muligens reguleres av IgG, ble vanlig metastatisk gener MTA1, CD44, E-cadherin, MMP9, MMP2 og Intergrin β1 undersøkt følgende siRNA forstyrrelser (se «RNA interferens»). Primere som brukes for real-time PCR er oppført i tabell S3. Amplifikasjon av β-aktin ble benyttet for normalisering. De relative uttrykk for hvert gen i de testede celletyper ble bestemt med metoden til 2
-ΔΔCt [36].
Western blot
Western blot ble utført som tidligere beskrevet [11 ]. Protein alikvoter 150 ug ble kjørt på 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Hele Molekyl IgG var i ikke-reduserende geler og andre proteiner var på reduserende geler. De primære antistoffene som anvendes i denne analysen er beskrevet i tabell S1. For å oppdage nedstrømsgener muligens reguleres av IgG, ble vanlig metastatisk gener MTA1, CD44, E-cadherin, MMP9, MMP2 og Intergrin β1 undersøkt følgende siRNA innblanding av IgG-gener. Pure humant IgG ble brukt som en positiv kontroll og husholdningsgenet β-actin ble brukt til å normalisere de relative uttrykk nivåer.
RNA interferens
Den kultiverte A549, SK-MES-1 og Beas2B celler ble delt i tre grupper (siRNA-IGHG1 eller siRNA-MTA1, siRNA-kryptert og det ubehandlede). Egge sirnas ble brukt som en negativ kontroll. Alle sirnas ble anskaffet fra Shanghai GenePharma Inc. IGHG1 siRNA-sekvensene var i sense: 5′- CCAAGGACACCCUCAUGAUTT-3 «og antisense: 5′-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3′; MTA1 siRNA-sekvensene var forstand 5»-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCTT-3 «og 5′-antisense GCUUUAACUUGCUCUCAGCTT-3′; egge siRNA-sekvensene var sense: 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «og antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3». For siRNA transfeksjon, ble X-tremeGENE reagens (Roche Diagnostics) brukes. Forholdet mellom transfeksjon reagens for å siRNA ble 10 ul: 2 ug per 3 x 10
5 celler. Transfeksjon prosedyren ble utført i henhold til produsentens anvisninger. Effektiviteten av siRNA interferens ble undersøkt med Real-time PCR 48 timer senere og med Western blot 72 timer senere.
MTS analysen
Om en × 10
4 kreftceller (A549 eller SK-MES-1) ble podet og dyrket på en 96-brønners plate i 24 timer. Cellene ble delt inn i følgende grupper: behandlede gruppene (siRNA-kryptert og siRNA-IGHG1), ubehandlet gruppe og blank gruppe (komplett medium uten kreftcelle). RNA-interferens fremgangsmåte ble utført og dyrket i en 48-timers periode. MTS (Jianchen Biosciences, Nanjing, Kina, 20 ul) ble tilsatt til hver brønn, og etter inkubasjon i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i 1 time, ble OD-verdien for hver brønn avlest ved 450 nm bølgelengde ultrafiolett. Forsøkene ble utført in triplo. Den celleproliferasjon ble beregnet som følger:
Vedlegg analysen
Detaljer om feste analyser ble beskrevet tidligere med mindre modifikasjoner [37]. Kort fortalt ble det dyrket A549, SK-MES-1 og Beas2B celler transfektert med siRNA. To dager senere, 1 × 10
4 celler per brønn ble sådd på Matrigel-belagte 96-brønners plater (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Etter 2 timer ble platene vasket for å fjerne ikke-klebende celler. Hver brønn ble inkubert med 20 ul MTS reagenser i 2 timer ved 37 ° C og den optiske tetthet ble påvist ved 450 nm bølgelengde ultrafiolett. Kontroller med egge sirnas ble utført med den samme protokollen beskrevet ovenfor. Cellen seeding tetthet er en empirisk verdi. Målet er å etablere 30% -50% celle samløpet etter celle tilslutning til kultur plate til rette for vekst. Når dette er etablert, seeding tetthet var identisk for alle grupper for å sikre rettferdig sammenligning.
Transwell assay
Smeltet metrigel ble blandet med precolled DMEM ved en endelig konsentrasjon på 0,8 ug /mL og deretter belagt på forkamrene av Transwell inserts (Millipore, Bille, MA) på 100 ul /brønn til å koagulere ved 37 ° C. Etter 48 timer av siRNA transfeksjon, omtrent 1 x 10
5 trypsinert celler ble sådd inn i det øvre kammer ved hjelp av serumfritt DMEM. Igjen, celletettheten såing var identisk for alle grupper. Transwell innskudd ble satt inn i 24-brønners platebrønner hvor 200 ul DMEM pluss 10% FBS ble plassert. Platen ble satt fortsatt ved 37 ° C i 24 timer. Analyser ble deretter stoppet ved å fjerne ikke-invaderende celler i det øvre kammer med vattpinner. Celler i den nedre side av innlegget ble farget med hematoksylin. Celler i fem visuelle felt under 400 × forstørrelse per innsats ble talt opp og fotografert.
Sårtilheling analysen
Den kultiverte A549, SK-MES-1 og Beas2B celler seeded i 12-brønners plater ( 1 x 10
5-celler /brønn) ble transfektert med siRNA som beskrevet ovenfor. Når cellene nådde 90% konfluens, sletting cellemonolaget med en steril 10 ul pipettespiss ble anvendt for å skape en sårområdet. Deretter ble platene vasket med PBS for å fjerne frigjorte celler, og celler ble dyrket med FBS-fritt DMEM. Deretter ble platen satt fortsatt ved 37 ° C i 48 timer. Såret området ble overvåket med en invertert mikroskop og fotografert.
Statistisk analyse
Korrelasjon mellom Igγ uttrykk i lunge kreft og ulike kliniske patologiske parametere ble utført med Pearson chi-kvadrat test.
Student t test ble brukt til å sammenligne data innhentet med de tre gruppene, dvs. siRNA-IGHG1, siRNA-kryptert og ubehandlet i analyser av MTS, transwell, vedlegg, real-time PCR og Western blot. Sammenhenger mellom Igγand MTA1 uttrykk og mellom MTA1 uttrykk og kliniske patologiske parametre ble evaluert med Student t-test. Signifikansnivået ble satt til
p
. 0,05
Resultater
Igγ, Igκ og Igλ uttrykk i LSCC og LAC
De fleste lungekrefttilfellene (mer enn 85%) undersøkt uttrykte Igγ og Igκ, mens et lite antall ( 15%) også uttrykkes Igλ samtidig. Igγ, Igκ og Igλ ble uttrykt i de samme cellene som demonstrert med påfølgende avsnittene. Positive flekker signaler ble lokalisert til cytoplasmaet og på de cellulære membranene. Flertallet av positive cancerceller ble fordelt i de perifere områder av kreft rede i LSCC eller med en diskontinuerlig flekket mønster i de rørformede strukturer av LAC (figur 1, A-F). Mange IgG postive kreftceller hadde atypiske kjerner og kjernefysisk kondens. Obduseres mandlene inneholdt Igγ, Igκ og Igλ immunoreaktivitetene i B-lymfocytter (figur 1, G-I). Vi utnyttet CD20 som en markør for B-lymfocytter og pan CK som en markør for celler av epitelial opprinnelse. Med seriesnitt, vi har oppdaget to typer celler som uttrykker Igγ. En er store epiteloide celler med positiv pan CK, og den andre er små runde celler med positiv CD20. Basert på morfologi og cellemarkører, identifiserte vi at de førstnevnte er kreftceller, og de sistnevnte er infiltrerende B-lymfocytter (Figur 1, J-O). Normalt lungevev i tilknytning til de kreft reirene inneholdt ingen positiv IgG immunoreaktivitet (figur 1, P-R).
A-C, Igγ (A), Igκ (B) og Igλ (C) immunostainings er positiv i cytoplasma og cellemembran av LSCC på seriesnitt. Merk: IgG-positive cancerceller er fordelt på omkretsen av tumormassen. D-F, blir positive signaler for Igγ (D), Igκ (E) og Igλ (F) vist i cytoplasma og cellemembran av en LAC. G-I, Igγ (G), Igκ (H) og Igλ (I) uttrykkene blir påvist i lymfocyttene hos mandel vev som en positiv kontroll. J-L, Igγ (J), pan CK (K) og CD20 (L) er uttrykt i LSCC på seriesnitt. M-O, Igγ (M), er pan CK (N) og CD20 (O) uttrykt i seriesnitt av LAC. Igγ (P), er Igκ (Q) og Igλ (R) ikke uttrykkes i normale epitelceller i tilknytning til tumormasse på seriesnitt. Svart pilspisser peker til den samme kreftcelle på seriesnitt. Svarte pilene peker til positive lymfocytter. Med AEC fargelegging, de positive immunostainings med AEC er rød i fargen. Merk: IgG er positiv i både kreftceller og infiltrerende lymfocytter med den sistnevnte sterkere enn den førstnevnte. Skala:. 20 um
I de antistoff pre-absorpsjons-tester, økende konsentrasjoner av rent humant IgG-antigen førte til å redusere intensiteten av farging (figur 2, A-F). Infiltrerende B lymphoctyes i mesenchyma omgir kreft reir eller de rørformede strukturer uttrykt IgG sterkere enn den til kreftceller. For ytterligere å skille kreftceller fra lymfocytter, undersøkte vi uttrykk for CD16, CD32, CD64 og FcRN i LSCC og LAC. Noen kreftceller ble funnet å uttrykke disse reseptorene (Figur 3, A-H), og de eneste celler som uttrykker dem var lymfocytter (Figur 3, I-L).
A-C, til mus anti-human Igγ monoklonalt antistoff: rent humant IgG = 1:01, 1:05 og 1:10 i LSCC seksjoner. D-F, tilsvarende gradient-forhold på Igγ: rent humant IgG i LAC seksjoner. Med økningen av antigenkonsentrasjon (rent humant IgG), ble den positive IgG-signalet svekkes. Bar: 20 mikrometer
CD16 (Fcy reseptor III) er vist i LSCC (A) og LAC (E) vev.. CD32 (Fcy reseptor II) vises i LSCC (B) og LAC (F) vev. CD64 (Fcy-reseptor I) er vist i LSCC (C) og (G) LAC vev. FcRn (neonatal Fcy-reseptor) er vist i LSCC (D) og LAC (H) vev. I disse delene blir positive signaler bare uttrykt i cytoplasma og membranen av lymfocytter, mens ingen positive signaler er funnet i kreftceller. CD16 (I), CD32 (J), CD64 (K) og FcRN (L) er uttrykt i biopsied menneskelig mandel vev som positive kontroller. Bar:. 20 mikrometer
Nesten alle kreftcellene var positive for IGHG1 mRNA. I etterfølgende avsnitt, ble proteinet av Igγ og mRNA fra IGHG1 lokalisert til cytoplasmaet av de samme kreftceller og infiltrerende B-lymfocytter (figur 4, A, B, D og E). Positive signaler av IgG-mRNA ble også funnet i B-lymfocyttene hos humane mandel vev (Figur 4, G og H). Ingen positive signal ble observert i lymfocytter og kreft når den forstand probe ble anvendt (figur 4, C, F og I). Normal lungevev ved siden av kreft reir uttrykte ikke IgG protein og mRNA av IGHG1 (figur 4, J-L).
colocalization av IgG mRNA og protein i LSCC og LAC vevsprøver demonstrert med ISH og IHC . A-C, Igγ farging (A, rød) og mRNA-signaler (B, lilla, med antisense probe) er positiv på seriesnitt av en LSCC. C er en negativ kontroll med forstand sonde. D-F, Igγ farging (D, rød) og mRNA-signaler (E, lilla, med antisense probe) er positiv på seriesnitt av en LAC. F er negativ med sans sonde. G-I, blir Mandel vev anvendt som en positiv kontroll. G er for Igγ med IHC viser positive lymfocytter. H er for antisense probe med ISH viser positive lymfocytter. Jeg er med sans sonde i ISH viser ingen positive signal. J-L, Igγ protein (J) og mRNA (K, antisens probe) blir ikke uttrykt i normale epitelceller i tilknytning til tumormassen. L er den forstand sonden. Svarte pilspisser peker på de samme kreftcellene i seriesnitt. Svarte pilene peker på positive lymfocytter.
Med fersk kirurgisk lungekreft vev, vi utførte LMD å fange kreftceller og normal lunge epitelceller i tilknytning til kreft reir bare uten lymfocytter (Figur 5, A) for å oppdage mRNA transkripsjoner av IgG inkludert IGHG1, κ konstant (CK), λ konstant (Cn), γ variabel (V m), κ variabel (Vκ), λ variabel (Vλ), sterile bakterie linje transkripsjoner (Iγ-Cγ) og viktige enzymer inkludert RAG1, RAG2 og AID for immunoglobulin syntese og klasse veksling. Positive signaler til disse genene ble funnet i LSCC og LAC kreftceller i stedet for normal lunge epitelceller (figur 5, B). Fire tilfeller av lungekreft viste svært høy homologi til de publiserte sekvenser av V m, Vκ, og Vλ bare med få genmutasjoner. Ved sekvenssammenstilling, fant vi også at V (D) J omorganisering skjedde da den tunge kjede eller lette kjeder ble syntetisert, men presentert en monoton mønster (figur 6).
En er de representative bilder av LMD i LSCC, LAC og normal lunge ved siden av tumormasse. B, band representert som IgG syntese forbundet gener ble påvist i LSCC, LAC og normal lunge med LMD kombinert med RT-PCR. Ingen CD19 ble oppdaget, og dermed unntatt mulig B-lymfocytter forurensning. Raji-cellelinjen ble brukt som en positiv kontroll. Vann ble anvendt som en negativ kontroll i stedet for primerne. RNA behandlet med DNase (forkortet som R) ble anvendt som en mal for å utelukke mulig falsk positivitet i 1R-6R. NL er forkortelsen for normal lunge.
En er for sekvenser av V m, B er for Vκ, og C er for Vλ.
Påvisning av IgG og viktige enzymer for IgG-syntese i A549, SK-MES-1 og Beas2B cellelinjer
LSCC-cellelinjen (SK-MES-1) og LAC cellelinje (A549) ble funnet å uttrykke Igγ, Igκ og Igλ med immunfluorescens (figur 7, A-F). Den positive signal ble observert i cytoplasma og på cellemembranen. Som en positiv kontroll ble Igγ, Igκ og Igλ også påvist i cytoplasma av Raji-celler (figur 7, G-I). Normal lunge epitelcellelinje (Beas2B) uttrykte ikke Igγ, Igκ og Igλ (figur 7, J-L). Rikelig IGHG1 mRNA ble påvist i A549 og SK-MES-1 (figur 7, M og O), så vel som Raji-celler (figur 7, Q). Ingen positive signal ble observert når forstand probe ble anvendt (figur 7, N, P og R). IGHG1 mRNA ble ikke funnet i Beas2B (figur 7, S og T).
A-C, Igγ (A), Igκ (B) og Igλ (C) er uttrykt i A549 celler med immunfluorescens. D-F, Igγ (D), Igκ (E) og Igλ (F) er uttrykt i SK-MES-1 celler. G-I, Igγ (G), Igκ (H) og Igλ (I) er i Raji-celler som positiv kontroll. J-L, Igγ (J), Igκ (K) og Igλ (L) blir ikke uttrykt i Beas2B celler. Positive signaler (purpur) for IGHG1 antisense-sonde er sett i cytoplasma av A549 (M), SK-MES-1 (O) og Raji (Q) celler. N, P og R viser negative resultater (følelse probe) i A549, SK-MES-1 og Raji celler. Ingen positive signalene blir funnet i Beas2B-celler (S, antisens probe, og T, den forstand probe). Å markere cellene uten lilla signal, metyl grønn var bruk for counterstain kjernene. Skala barer: 20 mikrometer
mRNA av IgG og essensielle enzymer for IgG syntese ble alle uttrykt i A549 og SK-MES-1 i stedet for Beas2B (figur 8, A).. Hele molekylet av IgG så vel som forskjellige fragmenter, dvs. Igγ, Igκ og Igλ var detekterbare i A549 og SK-MES-1-celler (figur 8, B) med tilsvarende molekylvekt i likhet med IgG fra B-lymfocytter. Tilstedeværelsen av RAG1, RAG2 og AID i A549 og SK-MES-1 ble også bekreftet med Western blot (Figur 8, C). I motsetning til kreftcellene, har Beas2B ikke uttrykker IgG-komponenter eller de enzymer for IgG-syntese (Figur 8, B og C).
A, bandene representert som IgG syntese forbundet gener ble påvist med RT-PCR i A549 og SK-MES-1, mens ikke i Beas2B. B viser at IgG hele molekylet, Igγ, Igκ og Igλ oppdages i A549, SK-MES-1, mens den ikke er i Beas2B med Western blot. Humant rent IgG ble anvendt som molekylvektstandard for å sammenligne med det fra lungekreftceller. Raji-cellelinjen var en positiv kontroll. C viser at RAG1, RAG2 og AID er uttrykt i lunge kreftceller, mens ikke i Beas2B. Raji cellelinje ble servert som en positiv kontroll.
IgG og MTA1 genekspresjon ble hemmet av siRNA forstyrrelser for IGHG1
uttrykk for Igγ både mRNA (Figur 9, A) og proteinnivåer (figur 9, C og D) var spesifikt nedregulert ved siRNA-IGHG1 i A549 og SK-MES-1cell linjer. Sammen med IgG, ble MTA1 uttrykk markert redusert på mRNA (Figur 9, B) og proteinnivåer (figur 9, C og D) i de to cellelinjene.
