Abstract
Anti-tumor CD8
+ T-celler er en viktig faktor for total overlevelse hos pasienter etter kirurgisk reseksjon for solide maligniteter. Ved hjelp av en musemodell for kreft vaksinasjon (adenovirus som uttrykker melanom-tumorassosiert antigen (TAA) -dopachrome tautomerase (AdDCT) og reseksjon som resulterer i større kirurgisk spenning (abdominal nefrektomi), viser vi at kirurgiske spennings resulterer i en reduksjon i antall CD8
+ T-celle som produserer cytokiner (IFNy, TNFa, granzyme B) i respons til TAA. Denne virkning er sekundær i forhold til både redusert spredning og nedsatt T-cellefunksjonen etter antigen-binding. i en profylaktisk modell, kirurgisk spenning fullstendig opphever tumor beskyttelse gitt av vaksinering i umiddelbar postoperativ periode. i en klinisk relevant kirurgisk reseksjon modell, hadde vaksinert mus gjennomgår en positiv margin reseksjon med kirurgisk stresset redusert overlevelse sammenlignet med mus med positiv margin reseksjon alene. preoperativ immunterapi med IFNα strekker overlevelse i kirurgisk stressede mus betydelig . Viktigere, myeloid avledede suppressor celle (MDSC) befolkningen tall og funksjonssvikt av TAA spesifikke CD8
+ T-celle ble endret på kirurgisk stresset mus. Våre observasjoner tyder på at kreften progresjon kan resultere fra kirurgi-indusert undertrykkelse av tumor-spesifikke CD8
+ T-celler. Preoperative immunterapi med sikte på å målrette prometastatic virkningene av kreftkirurgi vil redusere tilbakefall og bedre overlevelse hos kreftkirurgi
Citation:. Ananth AA, Tai LH, Lansdell C, Alkayyal AA, Baxter KE, Angka L, et al . (2016) Kirurgisk Stress opphever allerede eksisterende Protective T cellemediert anti-tumor immunitet fører til Postoperativ kreft tilbakefall. PLoS ONE 11 (5): e0155947. doi: 10,1371 /journal.pone.0155947
Redaktør: Hiroyoshi Nishikawa, Utforsk Oncology Research Clinical Trial Center, National Cancer Center, JAPAN
mottatt: 09.10.2015; Godkjent: 06.05.2016; Publisert: May 19, 2016
Copyright: © 2016 Ananth et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Terry Fox Research Institute, New Investigator Award (RCA); Canadian Institutes of Health Research Fellowship (LHT); Canadian Cancer Society Research Institute, innovasjon og nyskaping i Impact Grant (RCA)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betydningen av immunovervåking for å kontrollere utvekst av ondartede celler har vært kjent i flere tiår. Prinsippet om at naturlig forekommende T-celler med antitumor potensial eksisterer i human kreft har ført til nye feltet av kreft immunterapi. Tumorer seg selv, derimot, er i stand til å kapre immunsystem til å undertrykke immun kontroll, å skape et gunstig miljø, ikke bare for den primære, men også for metastatisk utvekst. Den sistnevnte prosessen har blitt kalt «systemisk oppfordring» [1]. Forstå dette immunsuppressive svulst miljø og snu den med målrettede midler har vist seg å være en svært vellykket behandlingsstrategi [2].
Kirurgisk reseksjon er bærebjelken i behandling for kurativ hensikt med heltrukne maligniteter. Selv med fullstendig reseksjon, mange pasienter utvikler lokalt tilbakefall eller metastaser og til slutt dø av sykdommen [3-6]. Akkumulerende bevis viser en sammenheng mellom tilstedeværelsen av CD8
+ effektor T-celler og forbedret prognose og overlevelse i en rekke faste maligniteter, inkludert bryst, eggstokk, kolorektal, nyrecellekarsinom, og malignt melanom [7-9].
Denne forening antyder at tilstedeværelsen av en sterk anti-tumor immun reaksjon, i særdeleshet anti-tumor CD8
+ effektor-T-celler, kan forebygge eller eliminere minimal restsykdom eller mikrometastaser etter fullstendig kirurgisk fjerning av den primære tumoren.
gruppe, og andre har vist at den umiddelbare postoperative periode er en entydig mottagelig tid for utvikling av kreft tilbakefall metastaser [3, 4, 10]. Det finnes en rekke mekanismer foreslått for å forklare denne effekt herunder spredning av tumorceller i sirkulasjon [11], lokal og systemisk frigjøring av pro-angiogene og mitogene mediatorer (epidermal vekstfaktor og vaskulær endotelial vekstfaktor) [3, 10, 12 ] og dyp inhibering av celle-formidlet immunitet [3, 10]. Vi har tidligere implisert kirurgi-indusert undertrykkelse av naturlige dreperceller (NK-celler) i utviklingen av postoperative metastaser [3, 4] i en validert dyremodell av kirurgisk stress og metastaser [13].
Mens tidligere studier har rapporterte en reduksjon i CD8
+ T-celler og nedsatt cytokinsekresjon som respons til ikke-spesifikk stimulering [14-17], har ingen utforsket arten av virkningene av kirurgisk stress på antigen-spesifikke CD8
+ -T-celleresponser heller ikke har de vist oppheving av en pre-eksisterende beskyttende anti-tumor CD8
+ T-cellerespons. I dette manuskriptet, utforsker vi effekten av kirurgisk stresset på en beskyttende CD8
+ T-celler mediert anti-tumor immunitet. For å oppnå dette bruker vi en viral-vektorbaserte svulst vaksine kalt AdDCT. Dette er en replikasjons-inkompetente E1 /E3-slettet human type 5 adenovirus (Ad) som uttrykker full-lengde human Dopachrome Tautomerase (hDCT) genet [18] som et tumorassosiert antigen (TAA). Det har tidligere vært vist at profylaktisk vaksinering AdDCT kan gi beskyttelse mot subkutant (sc) implantert melanom i en CD8
+ T-celle-avhengig måte [18-21]. Vi gir preklinisk
in vivo
resultater som klart indikerer at en større operasjon i betydelig grad kan svekke en allerede eksisterende verne T-celle immunrespons etter kreft vaksinasjon og gi ny bruk av preoperativ immunterapi for å reversere denne effekten.
Materialer og metoder
mus
C57BL /6, BALB /c, og CD1-nakne mus ble kjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor). Dyrene ble plassert i patogenfrie forhold og alle studier utført var i samsvar med institusjonens retningslinjer på Animal Care Veterinary Service anlegget ved University of Ottawa (Ontario). Den kanadiske Council on Animal Care og Animal Care komité University of Ottawa godkjent denne studien.
Generering av kirurgisk stresset
Rutinemessig perioperativ omsorg (inkludert anestesi og smertebehandling) og kirurgisk stresset var utført som tidligere beskrevet [3, 13]. I korte trekk ble mus underkastet 2,5% isofluorane (Baxter Corp.) for induksjon og opprettholdelse av anestesi. Kirurgisk stresset ble indusert i mus ved en abdominal laparotomi (3 cm midtlinjesnitt) og venstre nefrektomi (Nx). Alle dyr som gjennomgår kirurgiske prosedyrer vil motta pre og postoperative buprenorfin injeksjoner (0,05 mg /kg) administrert SC. Preoperativt blir mus injisert SC 1 time før kirurgi. Postoperativt blir mus injisert SC hver 8. time i 2 dager. Kroppsvekt og andre deler av dyret velvære registreres daglig etter operasjonen (S1 tabell). Blod dataene er ikke samlet inn. Musene ble avlivet ved intraperitoneal (ip) injeksjon av Pentobarbital Natrium (65mg /kg).
Cellelinjer
B16F10LacZ melanoma cellelinjen ble hentet fra Dr. K. Graham (London Health Sciences, Ontario , opprinnelig fra American Type Culture Collection) og holdt i fullstendig DMEM. Celler ble resuspendert i DMEM uten serum for intravenøs (iv) injeksjon gjennom den laterale halevenen. Tumorceller i 95% levedyktighet ble injisert i et 0,1 ml volum /mus
Vaksinering av mus
bedøvet mus ble vaksinert med 1×10
6 plakkdannende enheter (PFU) av. AdDCT (rekonstituert i 100 ul PBS) eller PBS alene ved intramuskulær (IM) injeksjon i hvert lår (50 ul per lår).
Profylaktisk vaksinasjon tumormodeller
Mus ble vaksinert med AdDCT eller PBS på dag 0. På dag 7, ble mus injisert med tumorceller enten SC eller iV foregående kirurgi. Sc melanom svulster ble etablert ved å injisere 3×10
5 B16F10lacZ celler i serumfritt medium på høyre bakben flanke; tumorstørrelse ble målt to ganger i uken, og svulstvolum ble beregnet ved hjelp av formelen 1/2 (L x W
2). Musene ble fast bestemt på å ha nådd endepunktet når tumorvolum nådd 1600mm
3. Systemiske formidlingsmodeller ble sådd på 1×10
6 B16F10lacZ celler gjennom halevenen iv administrasjon. Tumorbærende lungene ble farget med X-gal for å visualisere svulstmikrometastaser som beskrevet tidligere [3].
terapeutisk vaksinasjon tumormodell
Mus ble injisert sc med 1×10
5 B16F10lacZ celler i serum-frie medier på den høyre, bakre flanke på dag 0. på dag 7 ble musene behandlet med AdDCT eller PBS ved den angitte dose (pfu). På dag 14 ble sc svulster resected med en 2×2 mm positiv margin, med halv motta ytterligere kirurgisk stress i form av mage laparotomi og venstre nephrectomy. Tumorstørrelse ble målt to ganger i uken, og svulstvolum ble beregnet ved hjelp av formelen 1/2 (L x W
2). Musene ble fast bestemt på å ha nådd endepunktet når tumorvolum nådd 1600mm
3. For preoperativ IFNα behandling (R BD Pharmingen, 1 ug /ml tilsatt etter 1,5 timers inkubasjon). Etter 3,5 timers inkubering ble cellene merket med BrdU (BD Pharmingen) og inkubert i en ytterligere time. Etter 6 timers inkubasjon ble celler behandlet med anti-CD16 /CD32 og celleoverflateantigener ble merket med PerCP-CD3 og PE-CD8a. Etter produsentens anvisninger, ble cellene behandlet gjennom en rekke permeabilizations og fikseringer og farget for intracellulær FITC-BrdU.
MDSC-T-celle undertrykkelse analysen
T-celler ble isolert fra milten av mus som mottatt AdDCT vaksinasjon 7 dager før innhøsting. MDSCs ble isolert fra milten av kontroll og kirurgisk stresset mus (18 timer etter kirurgi). T-celler ble positivt valgt for å bruke CD90.2 mikroperler (Miltenyi Biotec) og MDSC ble positivt valgt for bruk av myelogen-Avledet lyddemper Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec), begge etter produsentens protokoller. Celler ble resuspendert til 1 x 10
6 celler /50ul cRPMI og cocultured ved forskjellige MDSC: T-forhold (0,25: 1, 0,5: 1, 1: 1). CD3 /CD28 Dynabeads (Life Technologies) ble tilsatt til kulturen i et 1: 1 bead-til-celleforhold i tillegg til 30 U /ml av muse-rekombinant interleukin-2 i henhold til produsentens anbefaling. Celler ble deretter dyrket i 4 dager i en CO
2 inkubator ved 37 ° C. Etter 4 dager ble cellene overført til en V-bunn 96-brønns plate for re- stimulering med DCT-peptid ved anvendelse av protokollen som er oppført ovenfor for intracellulær farging.
Statistisk analyse
Enveis analyse av varians (ANOVA) og den Bonferonni post hoc test ble utført for alle opplysninger. En P-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistisk signifikans av Kaplan-Meier overlevelseskurver ble bestemt ved bruk av log-rank tester.
Resultater
Operasjon stresset svekker antitumor immunitet som resulterer i lunge metastaser og subkutan svulst utvekst
For å finne ut effekten av kirurgisk stress på TAA-spesifikke T-celler, har vi utviklet en AdDCT vaksinering kirurgi modell. Ved hjelp av vårt etablerte B16F10lacZ melanom lungemetastasekirurgi modell [3, 13], vi administreres neoadjuvant AdDCT fulgt 7 dager senere med tumorinokulasjon ved iv injeksjon og større operasjon med en laparotomi og nefrektomi (fig 1a). Vaksinasjon med 1×10
6 pfu av AdDCT dratt et 3-gangers reduksjon i metastaser i forhold til PBS-behandlede kontrollmus. Men vaksinert mus utsatt for større kirurgi viste en fem-ganger økning i metastaser i forhold til vaksinasjon alene (fig 1b). Dette tyder på at kirurgi demper antitumor immunitet ved AdDCT vaksinasjon.
(a) B6 mus ble administrert med neoadjuvant AdDCT på 1 × 10
7 pfu. På dag 7 ble musene utfordret iv med 3×10
5 av B16F10lacZ celler for å etablere syngene lunge-melanommetastaser, og så gjennomgikk abdominal laparatomy og nefrektomi (Nx) eller uten kirurgi. (B) Lunger hentet på dag 10 (3 dager etter tumorcelle inokulering) fra PBS, Nx, AdDCT, AdDCT + Nx og kvantifisert ved X-Gal farging. N = 5 /gruppe. (C) B6 mus ble vaksinert med AdDCT, deretter utfordret på dag 7 med fm 1×10
6 B16F10lacZ celler, deretter gjennomgikk kirurgi eller ingen kirurgi. (D) Tumor volum av behandlet B16F10lacZ fm-tumorbærende mus ble overvåket daglig. (E) Overlevelse av behandlet B16F10lacZ sc tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier-kurver. Prosent av levende mus er indikert. N = 7-8 /gruppe, (* P 0,05, *** P 0,001).
Det er tidligere blitt vist at intravenøs injisert melanomceller er mer utsatt for NK-celleformidlet lysis i forhold til fm melanom, i stor grad på grunn av forskjeller i svulstens mikromiljø og immuncelle proporsjoner [22, 23]. For å utelukke en meklerrolle for NK-celler, utførte vi svulsten utfordringen ved hjelp av en sc injeksjon av B16F10lacZ tumorceller i hind flanke (fig 1c). I AdDCT-vaksinerte mus som ikke ble utsatt for kirurgisk stress, 100% forkastet en påfølgende tumor utfordring, mens alle de mus som gjennomgikk en stor operasjon ved tidspunktet for tumor duell utviklet flanke tumorer med en hastighet lik kontroll un-vaksinerte mus (fig 1d og 1e). I tillegg observerte vi demping av pre-eksisterende anti-tumor immunitet ved kirurgisk stress i en CT26 kolorektal kreft modell (S1 figur), noe som tyder på at kirurgi-indusert dysfunksjon av tumor-spesifikk immunitet er ikke eksklusivt for våre melanom modell. Tatt sammen tyder disse resultater på at kirurgisk stress i AdDCT-vaksinerte mus opphever en beskyttende anti-tumor immunrespons.
Kirurgi indusert opphevelse av beskyttelsen som AdDCT vaksinasjon er avhengig av CD3
+ T-celle-
for å demonstrere en meklerrolle for det adaptive immunsystemet i kirurgi-indusert svekkelse av beskyttende AdDCT vaksinering, vi gjentok sc tumor utfordringen modellen i CD-en naken mus som er mangelfull i T- og B-celler, men beholde NK celle funksjonen [24] (figur 2a). I nakne mus, gjorde AdDCT vaksinering ikke beskytte mus danner en svulst utfordring og kirurgisk stresset førte ikke til noen signifikante forskjeller i overlevelse i AdDCT-vaksinert mus (fig 2b). Dette tyder på at det adaptive immunsystem er viktig for den beskyttende effekten av AdDCT vaksinering og de negative effektene av kirurgisk stresset på svulst utvekst i vår modell. Å etablere T-celler som mellommann for både svulst beskyttelse etter AdDCT vaksinering og for mottakelighet for tumorvekst etter større kirurgi, vi adoptiv overført 1.0×10
7 rensede milt CD3
+ T-celler fra AdDCT-vaksinerte mus og fra kirurgisk stresset AdDCT-vaksinerte mus til naive mottaker mus. 1 dag etter T-celle overføring, ble mottaker mus utfordret med fm B16F10lacZ tumorer (figur 2c). Overlevelse ble overvåket over tid. Musene som mottok T-celler fra vaksinerte donorer var 90% beskyttet fra B16 tumor utfordring, mens de som fikk det samme antall av T-celler fra kirurgisk stresset vaksinerte donorer alle utviklede progressive flanke tumorer (figur 2d). Ved å overføre kirurgisk stresset T-celler og gjenskape effekten av kirurgi på beskyttende vaksinering, vi etablert at den skadelige effekten av kirurgi på AdDCT vaksinasjon er T-celle mediert.
(a) CD-1 nakne mus ble vaksinert med en × 10
7 pfu AdDCT. På dag 7 ble musene utfordret med sc B16F10lacZ tumorer og deretter gjennomgikk kirurgi eller uten kirurgi. (B) Overlevelse av behandlede B16F10lacZ tumorbærende CD-1 nakne mus, er vist i Kaplan-Meier-kurver. Prosent av levende mus er indikert. N = 7-8 /gruppe. (C) B6 mus ble vaksinert med 1×10
7 pfu AdDCT og på dag 7, mus operert eller ingen kirurgi. På dag 8, ble milt CD3
+ T-celler isolert og overført til naive mottaker B6 mus. På dag 9 ble mottaker mus utfordret med fm B16F10lacZ svulster. (D) Overlevelse av behandlede B16F10lacZ tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier botemidler. Prosent av levende mus er indikert. N = 7-8 /gruppe.
Kirurgiske stresset resulterer i en reduksjon i CD8
+ T-celle cytokin produksjon i respons til TAA
Siden kirurgisk spenning resulterte i demping av T-celle mediert clearance av tumorceller
in vivo
, vi spurte om AdDCT indusert T-celle cytokin produksjon i respons til TAA (DCT) påvirkes av kirurgi. Ved hjelp av den samme modellen av neoadjuvant AdDCT vaksinasjon fulgt av tumorinokulasjon og større kirurgiske stresset 7 dager senere, evaluert vi cytokinutskillelse i DCT spesifikke CD8
+ T-celler isolert fra milten 18 timer etter operasjonen. Vi har observert en signifikant reduksjon i andelene av CD8
+ T-celler som utskiller IFNy (figur 3a og 3b), TNFa (fig 3c) og granzyme B (figur 3d) som reaksjon på DCT peptid stimulering, og en reduksjon i antallet CD8
+ T-celler som utskiller IFNy som respons til ikke-spesifikk stimulering med PMA og Ionomycin (S2 fig). Videre, utførte vi en IFNy ELISPOT-analyse for å bekrefte vår flowcytometri resultater og funnet en tilsvarende dempning i antall DCT-spesifikke CD8
+ T-celler som produserer IFNy etter større kirurgiske inngrep (fig 3e og 3f). Disse dataene tyder på at kirurgiske spennings resulterer i en reduksjon i antallet av TAA-spesifikke CD8
+ T-celler som utskiller cytokiner ved DCT peptid stimulering.
B6 mus mottok neoadjuvant vaksinering med 1 x 10
7 pfu AdDCT. Ved dag 7 ble musene utfordret iv med 3×10
5 av B16F10lacZ celler for å etablere syngene lunge-melanommetastaser, og så gjennomgikk kirurgi eller uten kirurgi. På dag 8, ble musene avlivet og gjennomgikk milt immunceller vurdering. Prosentandelen av DCT-spesifikk (a) IFNy
+, (c) TNFa
+, (d) granzyme B
+ CD8
+ T-celler som reagerer på DCT
180-188 peptid eksponering . (B) Representant flowcytometri dot plots av DCT-spesifikke IFNy
+ /CD8
+ T-celler reagerer på DCT
180-188 peptid eksponering. (E) Kvantifisering av SFU i IFNy ELISPOT-analyse. (F) Tilsvarende representative bilder av IFNy ELISPOT analysen av CD8
+ T-reagere på DCT
180-188 peptid eksponering. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001)
Kirurgisk stresset T-celler vise redusert cytokinutskillelse, spredning og tumorinfiltrasjon i respons til TAA
Tidligere rapporter har vist en global reduksjon i CD8
+ T celler etter operasjonen [10, 14]. Ved hjelp av vår modell av AdDCT vaksinasjon etterfulgt av en større operasjon 7 dager senere, vi viste også en reduksjon i globale antall CD8
+ T-celler isolert fra milten 18 timer etter operasjonen (fig 4a). Denne reduksjonen var ikke sekundær til økt celledød, målt ved AnnexinV og 7AAD farging (figur 4b), men var forbundet med en reduksjon i T-celleproliferasjon, målt med BrdU-inkorporering følgende DCT-peptid stimulering (figur 4c). Vi neste søkt å bestemme hvorvidt redusert antall CD8
+ T-celler som utskiller cytokin som reaksjon på DCT var sekundært til en reduksjon i andelen av DCT-spesifikke CD8
+ T-celler (det vil si T-celler som er i stand til å binde DCT ) eller en funksjonell svekkelse av cytokinutskillelse følgende DCT-stimulering. Ved anvendelse av en MHC klasse I DCT-spesifikke tetramer, demonstrerte vi ingen reduksjon i andelen av DCT-spesifikke CD8
+ -T-celler etter kirurgisk stress hos vaksinerte mus (figur 4d og 4e). For å bekrefte at DCT-spesifikke CD8
+ T-celler ble funksjonelt svekket etter kirurgi, vi belagt likt antall DCT tetramer-bindende CD8
+ -T-celler i en ELISPOT følgende DCT peptid stimulering og det observert en signifikant reduksjon i IFNy sekresjon (fig 4f). I tillegg har vi vurdert de kinetikk IFNy uttrykk i DCT spesifikke CD8
+ T celler på ulike tidspunkter etter vaksinasjon og kirurgi og observerte en frisk periode på T-celle funksjonalitet mellom postoperativ dag (POD) 7 og POD 28 ( S3a og S3b fig). Den observerte utvinning av T-celle funksjon hos POD 28 korrelerer også med en antitumor immunrespons som kirurgi gjenvinnes mus var i stand til å avvise en B16lacZ sc tumor utfordringen med lik effekt som ingen kirurgi kontroller (S3c Fig). Til slutt vurderte vi om CD8
+ T celle migrasjon inn i svulsten ble rammet av kirurgisk stress. For å løse dette, vaksinert vi mus med AdDCT fulgt 7 dager senere ved sc injeksjon av tumorceller blandet med en matrigel plugg og en større operasjon. Matrigel plugger ble vurdert for infiltrerende lymfocytter 3 dager etter implantasjon. Våre data viser at CD8
+ T-celler ble redusert til det halve i svulster kirurgisk stresset mus, noe som indikerer at operasjonen påvirker tumor immun infiltrasjon (figur 4g). Tatt sammen tyder disse resultater på at større kirurgi fører til en global reduksjon i CD8
+ T-celler som ikke er sekundært til økt celledød, men er assosiert med hemming av proliferasjon. Andelen av DCT-spesifikke T-celler ikke er redusert i forhold til den globale nummer, men de resterende DCT-spesifikke T-celler er dysfunksjonell i deres evne til å utskille IFNy som respons på tumorantigenet. Endelig er CD8
+ T-celle infiltrasjon av svulster også svekket etter kirurgisk stress.
B6 mus fikk neoadjuvant vaksinasjon med 1 × 10
7 pfu AdDCT. Ved dag 7 ble musene utfordret iv med 3×10
5 av B16F10lacZ celler for å etablere syngene lunge-melanommetastaser, og så gjennomgikk kirurgi eller uten kirurgi. På dag 8, ble musene avlivet og gjennomgikk milt immunceller vurdering. (A) Totalt antall CD8
+ T-celler, (b) totalt antall Annexin V
– /7-AAD
– /CD8
+ T (live), Annexin V
+ /7-AAD
– /CD8
+ T (tidlig apoptose), Annexin V
+ /7-AAD
+ /CD8
+ T (sent apoptose) celler, (c ) prosentandel av BrdU
+ /CD8
+ T celler, (d) prosentvis og (e) representant prikkplott av DCT-tetramer
+ /CD8
+ T-celler reagerer på DCT
180-188 peptid eksponering, (f) kvantifisering av SFU fra DCT-tetramer
+ /CD8
+ T-celler reagerer på DCT
180-188 peptid eksponering i IFNy ELISPOT analysen. (G) Totalt antall CD8
+ /CD3
+ T celler per mg av svulst fra B6 mus utfordret med fm B16F10lacZ svulster blandet med matrigel på dag 7. På dag 10, Matrigel plugger ble fjernet og vurderes for immun celleinfiltrasjon ved strømningscytometri. N = 4-6 /gruppe. (* P 0,05, *** P 0,001).
Kirurgi svekker vaksine funksjon i en terapeutisk B16 modell av minimal restsykdom (MRD) og kan delvis reddet med perioperativ IFNα
Gitt begrensningene for et forebyggende modell av kreft vaksinasjon, har vi utviklet en klinisk relevant terapeutisk B16 melanom modell av minimal restsykdom (MRD) (figur 5a). I denne modellen, alle musene hadde flanke svulster implantert på dag 0, etterfulgt av AdDCT vaksinering på dag 7, reseksjon av deres primære tumor med en 2 mm positiv margin på dag 14 for å simulere MRD i humane kreftkirurgipasienter, etterfulgt av ytterligere kirurgisk stress. I likhet med den forebyggende modellen, observerte vi at AdDCT-vaksinerte mus som fikk reseksjon alene levde betydelig lengre enn AdDCT-vaksinerte mus med ekstra kirurgisk belastning (fig 5b). Gitt de undertrykkende virkninger av kirurgi på pre-eksisterende DCT-spesifikke CD8
+ T-celleimmunitet, vi administreres preoperative cytokin immunterapi i form av IFNα behandling for å redde T-cellefunksjonen og forbedre overlevelse (figur 5c). Vi observerte at median overlevelse av AdDCT vaksinert mus som gjennomgikk reseksjon og nephrectomy var 17 dager, mens median overlevelse ble utvidet til 27 dager i perioperative IFNα behandlet mus (Fig 5d). Deretter vi direkte undersøkt om IFNα behandling i sammenheng med AdDCT vaksinasjons funksjoner for å forbedre DCT-spesifikke T-celle responser. Interessant, preoperative IFNα terapi derimot ikke signifikant cytokinutskillelse (IFNy og TNFa) fra DCT spesifikke CD8
+ T-celler (S4 fig). Samlet utgjør disse resultatene viser at vi kan kombinere immunterapi med en større operasjon for å forlenge overlevelsen i den postoperative perioden. Imidlertid kan andre effektor-celler (slik som NK-celler) spiller en rolle i tillegg til DCT-spesifikke CD8
+ T-celler i å mediere de gunstige effektene av IFNα.
(a) B6 mus ble injisert sc med 1×10
6 B16F10lacZ celler. Ved dag 7 ble musene vaksinert med AdDCT. På dag 14, ble tumorer resekterte (Res) med en 2 mm margin +/- kirurgisk spenning (Res + Nx). (B) Overlevelse av behandlede B16F10lacZ tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier-kurver. N = 7-8 /gruppe. c) Preoperativ behandling på dag 10 med en høy dose (10 000 IE /mus) og på dager 11 til 13 med 3 lave doser (1000 IU /mus) av rekombinant mIFNα i MRD vaksinasjon modell. Overlevelse av behandlede B16F10lacZ tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier-kurver. N = 5-6 /gruppe.
Kirurgi-indusert utvidelse av granulocytic MDSC svekker T-celle cytokinutskillelse
Til slutt undersøkte vi mekanismene for T-celle undertrykkelse i tumorbærende mus mottak vaksinasjon og gjennomgår kirurgisk stress. Myeloide Avledet lyddemper celler (MDSC) representerer en befolkning på umodne myeloide celler som utvider seg dramatisk i løpet av tumorprogresjon og svekker adaptiv immunitet [25]. Hos mus er det to populasjoner av MDSC definert av deres relative ekspresjon av GR1 og funksjonell status [26, 27]. Nærmere bestemt ble det observert en betydelig økning i andelen av milt granulocytisk MDSC (gMDSC) i kirurgisk understreket og vaksinerte mus (figur 6a), men ikke monocytisk MDSC (mMDSC) (figur 6b) sammenlignet med de vaksinerte kontroller uten kirurgi. I kontrast, gjorde vi ikke observere eventuelle forskjeller i milt T regulatoriske (treg) populasjoner følgende vaksine og kirurgi (Fig 6c). For å analysere muligheten for kirurgi-avledet gMDSC å undertrykke vaksine-aktiverte T-cellefunksjon, ble milt gMDSC isolert fra kontroll og kirurgisk stresset mus og cocultured med T-celler fra Ad-DCT-vaksinerte mus. I nærvær av kirurgi-avledede gMDSC, produksjon av IFNy (figur 6d) og TNFa (figur 6e) av CD8
+ DCT-spesifikke T-celler ble hemmet signifikant respons på DCT peptid. I tillegg vurderte vi om preoperativ IFNα behandling kan reversere opphopning av gMDSCs i milten av mus etter vaksinering og kirurgi (S5 fig). Ved nærmere undersøkelse fant vi at preoperativ IFNα terapi ikke reduseres utvidelsen av gMDSC i mus sammenlignet med vaksinerte mus som gjennomgår kirurgi. Vi viser videre at gMDSC celleoverflaten uttrykk for aktivering /modning markører CD80 /CD86 er ikke endret ved preoperativ IFNα som tyder på at IFNα behandlingen ikke direkte påvirke gMDSC sammensetning og funksjon i milten.
B6 mus ble utfordret med B16F10lacZ tumorer, fikk AdDCT vaksinasjon (dag 7), og deretter ble operert som beskrevet ovenfor. På dag 8, ble musene avlivet og gjennomgikk milten MDSC ble isolert for telling og funksjonelle analyser. Prosent av (a) granulocystisk MDSC, (b) monocytic MDSC og (c) T regulatoriske celler. Andel DCT-spesifikke (d) IFNy
+ og (e) TNFa
+ CD8
+ T celler fra kontroll eller vaksinerte mus reagerer på DCT
180-188 peptid eksponering følgende 4 dager i kultur med kontroll eller kirurgisk stresset MDSC. N = 4-6 /gruppe. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).
Diskusjoner
Kirurgisk reseksjon er bærebjelken i terapi for mest solide maligniteter, men til tross for komplett reseksjon, mange pasienter havnen MRD og til slutt dø av en gjentakelse [28]. Kreftvaksiner er best egnet til å utrydde MRD [22, 23, 29], noe som gir en sterk begrunnelse for å kombinere kirurgi og immunterapi i kreft kliniske studier. Imidlertid må en logisk utviklet klinisk studie av kreft vaksinering ta hensyn til virkningen av kirurgisk stress på TAA-spesifikke T-celle-responser og de mekanismer som er ansvarlig det.
I den foreliggende undersøkelse har vi demonstrert at de forbigående, men
