Abstract
microRNAs (mirnas) har blitt anerkjent som en betydelig involvert i prostatakreft (PCA). Siden androgen reseptor (AR) spiller en sentral rolle ved PCA karsinogenese og progresjon, er det viktig å systematisk belyse årsakssammenheng mellom AR og mirnas, med fokus på de molekylære mekanismer som mirnas megle AR signaliserer. I denne studien utførte vi en rekke tidskurs mikromatriser å observere de dynamiske genom-wide uttrykk for mRNA og mirnas parallelt i hormonfølsom prostatakreft LNCaP celler stimulert av androgen. Derfor innførte vi Response Score å identifisere AR mål mirnas, samt Modulation Score å identifisere miRNA mål mRNA. Basert på teoretisk identifisering og eksperimentell validering, ble nye mekanismer adressering celleviabilitet ved PCA raknet for 3 mirnas nylig anerkjent som AR mål. (1) MIR-19a er direkte oppregulert av AR, og undertrykker SUZ12, RAB13, SC4MOL, PSAP og ABCA1 hhv. (2) MIR-27a er direkte oppregulert av AR, og undertrykker ABCA1 og PDS5B. (3) MIR-133b er direkte oppregulert av AR, og undertrykker CDC2L5, PTPRK, RB1CC1, og CPNE3 hhv. Videre fant vi MIR-133b er viktig å PCa celle overlevelse. Vår studie gir visse hint om mirnas medierte AR signale til celle levedyktighet ved å påvirke kritiske stier, særlig ved å bryte gjennom androgen vekst begrensning effekt på normal prostata vev
Citation. Mo W, Zhang J, Li X, Meng D Gao Y, Yang S, et al. (2013) Identifisering av Novel AR-målrettet microRNAs medier Androgen Signale gjennom Kritiske Pathways å regulere celleviabilitet i prostatakreft. PLoS ONE 8 (2): e56592. doi: 10,1371 /journal.pone.0056592
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 07.09.2012; Godkjent: 11 januar 2013; Publisert: 22 februar 2013
Copyright: © 2013 Mo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av to tilskudd 31071142 og 31171246 fra Natural Science Foundation National Kina, og ved Shanghai Key Laboratory of Intelligent Information Processing of China (No. IIPL-2010-002). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er 20~24 nt endogene protein nonencoding RNA, og har dukket opp som en stor klasse av regulatoriske molekyler involvert i pattedyr embryoutvikling og patogenesen [1]. Nylig har et økende antall studier påpekt at mirnas spille sterke roller i prostatakreft (PCA) initiering, progresjon og metastase [1], [2], [3]. Prostata er avhengig av androgener for vekst og utvikling, i mellomtiden sin normale vev er kontrollert av visse vekst restriksjonsmekanismer for å avverge androgen-indusert overvekst, er det viktig å finne ut hvordan den androgen reseptor (AR) formidler disse handlingene og bryter gjennom vekst begrensning for guiding PCa kreftutvikling. Dermed forsøkte vi å systematisk identifisere mirnas som bro trasé fra AR stimulering til mobilnettet fenotypiske effekt ved PCA.
I dag, flere rapporter identifiserte mirnas i AR signale i prostatakreft [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. MIR-21 var direkte oppregulert ved AR i androgen-responsive PCA celler [6], på grunn av AR bindende for den definerte promoter. J. Ribas et al. videre funnet inhibering av MIR-21 kan redusere androgen-indusert PCa celleproliferasjon, og MIR-21 var tilstrekkelig for androgen-avhengige tumorer for å overvinne kastrering-indusert veksthemming [6]. MIR-125b var direkte stimulert av AR, og fremmet androgen-uavhengig PCa vekst ved å undertrykke uttrykket av Bak1 som regulerte apoptotisk signalering ved PCA [7]. J. Ribas et al. [6] utført microarray analyse for miRNA uttrykk i to androgen-avhengige PCA cellelinjer LNCaP og LAPC-4 for å finne AR-regulerte målet miRNAs. Men det kan ikke klart skille mellom direkte og indirekte mål for AR siden miRNA uttrykket profilen ble oppnådd ved 72 timer etter androgen stimulering. Nylig, K. Takayama et al. har utført et genom-wide screening av AR målgener ved å integrere CAGE og chip-chip-analyse for å identifisere AR bindingssteder (ARBSs) i det menneskelige genom i LNCaP celler [4]. De bestemte genom-wide ARBSs i 100 kb nærheten av miRNA gener. Basert på kromosomet binding, K. Takayama et al. gitt nyttig informasjon for å belyse miRNA-mediert AR signalnettverk. Men under de spesielle biologiske forhold, ikke alle målene identifisert av Chip-chip analyse er de virkelige målene for AR; blant alle AR-målrettet mirnas, de kritiske mirnas bidrar til AR-signalering, kan det ikke bli funnet ut kun gjennom kromosom-bindende analyse.
På den annen side, for å studere hvordan miRNA medierer AR-signalering, er det nødvendig å identifisere miRNA satsings mRNA. Seed-sekvens-baserte spådommer om miRNA mål, for eksempel TargetScanS, Miranda og miRDB databaser, gir nødvendige informative hint; anvendelsen av disse prediksjon database i den spesifikke kontekst kan identifisere miRNA faktiske mål. I de fleste tilfeller for dyr, selv om mirnas og målet mRNA ikke er helt grunn matchet, kan mirnas likevel forårsake target mRNA degradering via eksonukleaser eller P-body [8]. Nemlig, kan uttrykket endring av mål-mRNA i hovedsak reflektere miRNA regulering. Derfor er det ideelt å samtidig observere uttrykk for både mirnas og mRNA i en tidsserie måte for å effektivt identifisere miRNA regulering på målet i en vev-spesifikk kontekst. Nylig, V. Jayaswal et al. [9] har gitt en dynamisk data samtidig observere miRNA og mRNA uttrykk i en myelomcellelinje U266. Basert på søke miRNA-mRNA tids kurs data, de beregnede odds statistikk [9] for hver miRNA-mRNA par hentet fra sekvens-basert prediksjon. Videre kan miRNA uttrykket endring ikke nødvendigvis gir en umiddelbar endring i mål mRNA uttrykk [9], burde dette tidsforsinkelse effekt som skal vurderes når man skal avgjøre miRNA regulering. I V. Jayaswal et al. Metode [9], ble betydningen av odds statistikk ikke vurdert av falske funnrate som er standard for vurdering av betydning, og tidsetterslep med ulike intervaller for å representere miRNA er forsinket effekt ble behandlet likt som ikke er i linje med den faktiske forhold. Derfor er en forbedret algoritme for nøyaktig å identifisere miRNA mål i en bestemt kontekst i utgangspunktet krevde.
I prinsippet er de kritiske mirnas som spiller sterke roller i å mediere AR baner i androgen-avhengige PCA-celler vil være betydelig oppregulert etter androgen stimulering, og nok holde de høye uttrykk for en forholdsvis lang tid. I denne studien, utførte vi en tidsserie microarray for samtidig å observere på genom miRNA og mRNA uttrykk i henhold til dihydrotestosteron (DHT, en typisk androgen) stimulering i LNCaP-celler som er androgen-avhengige. For å avgjøre mirnas roller i AR signalering, introduserte vi Response Score å identifisere AR mål mirnas, samt Modulation Score å identifisere miRNA mål mRNA. Etter biologisk eksperimentell validering, er flere interessante mekanismer for mirnas «medier i AR signale nylig avslørt, som i betydelig grad bidrar til PCa celle overlevelse og patogenese, og studien avslørte også noen mulig mekanisme for å bryte gjennom androgen vekst begrensning.
materialer og metoder
Cell Culture and androgen behandling
i hormonsensitiv human prostatacancer LNCaP-cellelinjen ble oppnådd fra ATCC og opprettholdt i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin (100 enheter /ml) -streptomycin (100 g /ml) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator celle. LNCaP-celler ble dyrket i fenolrødt-fri RPMI 1640 (GIBCO /BRL) supplert med 10% trekull-dekstran-strippet FBS i 3 dager før androgen behandling, deretter ble indusert med DHT ved konsentrasjon på 10 nM. Genomet bredt dynamisk respons til DHT ble analysert ved ti tidspunkter – 0 h, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 h og 48 h, der «0 h» representerer staten før androgen action. I denne studien blir de 10 tidspunktene nummerert som
k
= 0, 1, 2, … 9. For hvert tidspunkt, total-RNA ble ekstrahert og renset ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
Genome-wide Expression Profil av Illumina BeadArray
Total RNA ved hvert tidspunkt ble hybridisert til Illumina Sentrix Menneskelig WG-6_V2 uttrykk BeadChip arrays (for mRNA) og MicroRNAExpression Profiling paneler (for miRNA) separat. Den rå microarray data ble lastet opp til Gene Expression Omnibus offentlig register (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;. Genuttrykk Omnibus serie ingen GSE21245).
Data Pre-behandling
Vi normalisert microarray data ved hjelp quantile metode, og behandlet de uekte data. For et gen, evaluerer «Detection
P
verdi «ektheten av påviste signal data. Hvis «Detection
P
value» 0,01, er signalet anses som autentisk; ellers er uekte. Vi foreslo et kriterium for endring av uekte data. I hvert microarray, er minimumsverdien av autentisk signal satt som terskel, og betegnes som Min
au. For en uekte signaldata,
en
er den opprinnelige verdien, og den endrede verdien = max {a, Min
au}. Gener med mer enn 5 uekte signaler ble ekskludert. Etterpå ble hele data ansett som troverdig.
Identifikasjon av AR søker primære mål
1) Androgen-responsive gener.
For genet
g
representerer sin avskrift vektor, der
N
er antall tidspunkter ekskludert 0 h, og
N
= 9 i denne studien. (
k
= 0, 1, 2, …,
N
) betegner avskrift verdi på tidspunktet
k
, og fungerer som kontroll for DHT stimuli. For genet ved hvert tidspunkt, «Diffscore» representerer differensialuttrykk betydning sammenlignet med 0 timer. Vi anser som nedregulert, og som oppregulert, tilsvarende. betegner et mRNA er diskretisert ekspresjonsvektor, dvs. (
k
= 1, 2, …,
N
) = 1, -1 eller 0 på grunn av oppreguleringen, nedregulering eller undifferentiation ved
k
; og betegner et miRNA er diskretisert ekspresjonsvektor. Hvis et gen er betydelig forskjellig uttrykt på et tidspunkt sammenlignet med 0 h, er det definert som «androgen-responsive genet» i denne studien.
2) Tid discriminator for tidlig- og sen-respons.
for å systematisk identifisere AR direkte regulert mål, utvikler vi en strategi for å oppdage «tid discriminator» som i hovedsak skiller tidlig og sen respons etapper. Ved hvert tidspunkt, at antallet av differensielt uttrykte gener (i forhold til 0-h) ble tellet. Vi tegner en kurve av forskjellig uttrykt miRNA gen antall langs tid kurset. Etter hvert som antall differensielt uttrykte gener på et sent stadium er definitivt mye større enn det på et tidlig stadium på grunn av kaskadeforsterkningsvirkning [10], definerer vi den tid diskriminatoren som det tidspunkt da den andre utbrudd av differensial-genet nummer vises dvs. fra, differensial uttrykk er på et sent stadium.
3) Response score for å måle genets androgen-respons.
det er generelt ansett som den direkte målet for AR bør ha et tidlig uttrykk respons på androgen behandling; Videre gener med tidlig og durative androgen-respons er sannsynligvis ikke bare å være direkte regulert av AR, men også spille viktige roller i AR signalering. Følgelig, for å identifisere mirnas som er både tidlige og sene respondere, dvs. med tidlig og durative androgen-respons, foreslår vi en statistikk Response Score (RS) for å måle et gen uttrykk respons på androgen stimuli: (1) hvor
I Eq. (1), er den komponent av diskretiserte ekspresjonsvektor av genet, er den første ikke-null element i den sekvensielle settet;
I
(
x
=
y
) er lik 1 hvis tilstanden er fornøyd og 0, ellers; Int (
x
) tar integrert del av
x
å være dens verdi. Det første leddet i ligning. (1) er den kumulative effekten av androgen-respons fant frem av vekten faktor
N
+ 1-
k
, dvs. differensial uttrykk skjedde på et tidligere tidspunkt har større bidrag til rollen . Det andre leddet i ligning. (1) er straffen for hyppig endring av differensial retning, siden gener med oscillerende retningsendring er mindre viktig i signalledning. Reflekteres av, blir det straffet tyngre for retning endring skjedde på et tidlig stadium, og straffet svakere for et sent stadium, siden tidlig respons er viktigere for AR primære regulering. Basert på RS definisjon, gener med større RS verdier er mer tilbøyelig til å være direkte regulert av AR, og er mer tilbøyelig til å spille viktige roller i gjennomføringen AR cellulære effekter. I denne studien er de beste 10% gener sortert etter RS teoretisk identifisert som AR kandidat primære mål.
Identifisering av mål Betydelig modulert av miRNA
1) OR-statistikken.
Hvis du vil vise mirnas «globale modulasjon på mRNA, observerer vi uttrykket profiler over tid selvfølgelig, og fokusere på om det er en endring i uttrykk snarere enn retning av endring. Let.where
M
er totalt antall miRNAs, er antall sekvensbaserte spådd mål for miRNA
i
, og betegner uttrykket differensiering på tidspunktet
k
for miRNA
i
og henholdsvis mRNA
j
. Den merkelige forholdet (OR) =
annonsen Twitter /
bc
. Hvis OR 1, er mirnas betraktes som globalt modulerende uttrykk for predikerte målet mRNA
2) Modulation score for en sekvens-basert spådd miRNA-mRNA par
For en spådd miRNA.. -mRNA par hvis medlemmer er både androgen-responsive, er det nødvendig å bestemme hvorvidt mRNA er betydelig modulert av miRNA i den spesifikke sammenheng. Pearson koeffisient reflekterer foreningen i en kontinuerlig måte er vanlig å måle uttrykk korrelasjon av miRNA og mRNA [11], mens mRNA forskjells uttrykk som gjenspeiler miRNA er diskret modulasjon effekt på hvert tidspunkt bør også vurderes. I tillegg kan en endring i miRNA uttrykk ikke gi en umiddelbar uttrykk endring i mål-mRNA, bør den «etterslep» -effekt betraktes. Derfor foreslår vi en statistikk – Modulation Score (MS) – for å måle miRNA regulering sekvensen baserte spådd target mRNA. For en anslått miRNA-mRNA par, (2) der for
j
= 1, 2, …,
N
, og for
k
= 2, 3, …
N
.
I Eq. (2),
r
er Pearson korrelasjonskoeffisient beregnes ved ekspresjonsdata av miRNA og mRNA, (
k
= 1, 2, 3, …,
N
) representerer
N
tidspunkter, og,,, …, i denne studien. Eq. (2) synes ligner Fisher
r
-to-
z
transformasjon, som er normalfordelt [12]; Imens Eq. (2) er avansert med vekt faktor
E
beskriver miRNA og mRNA er diskret differensial uttrykk korrespondanse. tiltak differensial uttrykk korrespondanse uten tidsforsinkelse; mens utfyller modulasjon med forsinket effekt på grunn av forskjellig tidsetterslep. Betydningen av MS er vurdert av nominell
p
verdi og justert
q
verdi (Supplement). I denne studien
q
= 0,2 er satt som grense for signifikans identifisering, dvs. hvis
q
0,2, mRNA er identifisert som direkte mål betydelig modulert av miRNA i spesifikke kontekst.
Kvantitativ real-time RT-PCR for miRNA og mRNA
kvantifisering av miRNA ble utført ved hjelp Bulge-LoopTM miRNA qPCR (Ribo). Liten kjernefysiske RNA U6 var endogen kontroll. For mRNA kvantifisering, ble cDNA syntetisert fra total RNA ved hjelp PrimerScript ™ RT reagenssett (Takara). RT-PCR ble utført ved hjelp SYBR premier Ex Taq ™ kit (Takara) på 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Grunning er angitt i tabell S5 av Arkiv S1. Alle prøveverdier ble normalisert til GAPDH. De 2
– ΔΔCt metoden ble brukt som relativ kvantifisering mål på differensial uttrykk
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
chip analysene ble utført som beskrevet i ref.. [1. 3]. I korthet ble celler etter ønsket behandling ble fiksert med 1% formaldehyd ved 37 ° C i 7 minutter, deretter ble cellene høstet i SDS lyseringsbuffer [50 mM Tris.Cl, pH 8,1, 10 mM EDTA, 1% SDS] og sonikert til skjær kromatin (200~500 bp). For hver brikke, den løselige fraksjon fra 2 x 10
6 celler ble oppsamlet og inkubert med 4 ug kanin anti-AR-antistoff (PG-21, Upstate) eller tak normalt kaninserum (IgG) ved 4 ° C over natten. Immunkomplekser ble tatt med 20 ul av protein A /G plus-agarose perler (Santa Cruz). Etter omfattende vasking ble de bundne DNA-fragmentene eluert og renset. Primerne for qPCR-analyse av DNA-fragmenter inneholdende ARE var oppført i Tabell S3 og S4 av Tabell File S1, særlig KLK3 (PSA) enhancer fungerer som den positive kontrollen, mens XBP-1 promoter som fungerer som den negative kontroll. Hver brikke analysen ble biologisk gjentatt tre ganger.
miRNA Transfeksjon
For effektiv over-uttrykk for miRNA, etterligner miRNA forløper molekyler og negativ kontroll (Ambion) ble transfektert inn LNCaP celler ved hjelp av Neon ™ transfeksjon systemet (Invitrogen) i en konsentrasjon på 30 nM. For transfeksjon i henhold sult situasjon, ble LNCaP celler satt inn hormon strippet medium for 3 dager før transfeksjon.
Cell Proliferation /levedyktighet analysen
For å teste miRNA bidrag til PCa celleproliferasjon, LNCaP celler etter transient transfeksjon ble sådd på 24-brønners plate i en konsentrasjon på 15.000 celler /brønn. Etter 1, 2, 3 og 4 dager etter transfeksjon, 80 ul av MTT (5 mg /ml stock) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 3 timer. Behandlede celler ble lysised av DMSO og absorbansen ved 450 nm ble målt. Hver transfeksjon ved hver dag ble gjentatt 3 ganger.
Western blotting
Western blot ble utført som beskrevet tidligere [14] ved anvendelse av antistoffer mot AR (Millipore), PSAP (Santa Cruz) og aktin ( Sigma). For kjerneprotein ekstraksjon, ble LNCaP-celler lysised med buffer A (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Cellekjernene ble oppsamlet ved sentrifugering og lysised med buffer C (20 mM HEPES pH 7,9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Nuclear lysat ble samlet av sentrifuge og kvantifisert.
Luciferase Assay
En reporter plasmid som inneholder antatte miRNA bindingssete i 3′-UTR av target mRNA ble klonet fra pGL3-arrangøren Luciferase vektor. Primere som brukes er gitt i tabell S6 av Arkiv S1. Plasmidet ble verifisert ved DNA-sekvensering. For luciferase-assay ble LNCaP-celler (7,5 x 10
4 per brønn) podet inn i 24-brønners plater og dyrket i 2 dager. Cellene ble deretter kotransfektert med miRNA, pGL3-promoter Luciferase vektor og PRL-TK Renilla luciferase plasmid (Promega) ved hjelp av X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche). Luciferase-aktivitet ble målt ved 48 timer etter transfeksjon med dobbel luciferase reporter assay kit (Promega).
Resultatene
strategien for konstruksjon av miRNA-mediert AR signaleringsnett i denne studien er vist i figur . 1. Den trinnvise Resultatene er presentert som følger.
Dette er omrisset av hele fremgangsmåten for å analysere mikroarray data for å konstruere AR nettverk i denne studien. Detaljert fremgangsmåte er gitt i metodikk og resultat seksjoner.
Screening Androgen-responsive mirnas
For å identifisere AR-målrettet mirnas av en gevinst-of-funksjon tilnærming, vi utførte tids- Selvfølgelig microarray for samtidig å observere miRNA og mRNA uttrykk i androgen-avhengige LNCaP-celler i henhold til DHT stimulering i en tidsserie fra 0 timer, 20 min, 40 min, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 16 timer, 24 timer og 48 timer, henholdsvis. The «0 h» fungerer som kontroll representerer mobil status før DHT stimulering. LNCaP-celler ble dyrket i et hormon-utarmet medium i 72 timer før DHT stimulering. Etter pre-prosess med de opprinnelige dataene, var det 16,172 mRNA og 241 mirnas forble. Vi først screenet disse dataene til å finne «androgen-responsive genet «(« ARG «): Hvis et gen har betydelig uttrykk endring på et tidspunkt i forhold til 0 timer blir det kalt» androgen-responsive «. Den differensielle ekspresjonen sammenlignet med 0-t blir målt ved «DiffScore», som representerer den betydningen av dette uttrykket. Følgelig ble 5,203 mRNA og 137 mirnas androgen-responsive. Det skal bemerkes at, som androgen-responsive ikke betyr blir direkte regulert av AR; i stedet, kan noen gener reguleres ved visse mediatorer i AR veier. Vårt viktigste mål er å plukke ut de mirnas direkte regulert av AR, som spiller viktige roller i formidling AR-nettverk ved å modulere målet mRNA.
Blant de 137 androgen-responsive mirnas, 22 mirnas ble godt dokumentert ved PCA [11 ], [15], [16] [17]. Deri, MIR-101, MIR-145, MIR-34a, MIR-182, MIR-375, MIR-181a, MIR-92b og MIR-125a blir oppregulert ved DHT stimulering. Disse mirnas ble rapportert som sterkt overuttrykt i PCa [11], [17], [18], [19]. MIR-16, MIR-126 *, MIR-23b, MIR-100, MIR-222, MIR-133a-1, MIR-499 og MIR-340 er nedregulert, som er i tråd med tidligere rapporter [11], [15], [16].
De androgen-responsive mRNA funnet i denne undersøkelsen er svært konsistente med tidligere rapporter. Vi har tidligere etablert en bestemt database kalt ARGDB database [20], som fokuserte på AR regulert gener ved å integrere litteratur opp til år 2009. For de 5,203 androgen-responsive mRNA funnet i denne studien, 80% traff androgen-responsive gener i ARGDB database . Den samsvar innebærer riktigheten av vår eksperimentelle ytelse for å observere genom dynamiske uttrykk i LNCaP celle henhold DHT stimulering. Interessant, ble enkelte gener involvert i miRNA behandling oppregulert av androgener (figur S1 i File S1). For eksempel
dicer
, en RNA-bindende protein som behandler pre-miRNA i moden miRNA, er oppregulert. Dette er konsistent med det som tidligere er rapportert oppregulering i PCa [21].
DGCR8
, en partner av kjernefysisk RNase III drosha, som kløyver stammen-løkker pri-miRNA inn i flankerer frie pre-miRNA, er også betydelig oppregulert.
Identifisere Tid Diskriminerende for tidlig – og sen respons
Gene uttrykk respons til androgen stimulering kan skje når som helst punkt etter DHT behandling; dermed avhengig bare på androgen responsive kan ikke gi mer refleksjon på å bestemme hvilke responsive genet er kritisk. Vi spekulerer i at gener med sterk ekspresjon forandring som skjer på et tidligere stadium, kan spille en mer sentral rolle ved formidling av AR signalisering, og kan ha bedre sjanse til å være den direkte mål for AR. Derfor, for å identifisere de kritiske mirnas som er trolig AR mål, vi klassifisert miRNA respons i tidlige og sene stadier i denne studien ved å bestemme en tid discriminator
τ
, som markerer begynnelsen på slutten respons. Antallet forskjellig uttrykt mirnas spenner over tidsforløpet ble plottet. Som vist på fig. 2A,
τ
= 6, svarende til tidspunktet 8 timer er identifisert, noe som betyr at for mirnas «uttrykk responser på androgen, [20 min, 8 t) er et tidlig stadium, mens [8 timer, 48 h] er sent stadium.
figur 2A. Tidsforløpet profilen til forskjellig uttrykt miRNA nummer. Den stiplede linjen viser til tid diskriminator for å skjelne tidlige og sene stadier respons. Figur 2B. Expression profilen til mirnas «tidlig- og sen-respons til DHT stimuli. Differensial uttrykk i forhold til 0-h er representert ved. skiller miRNA respons i tidlige og sene stadier. mirnas er gruppert i 4 grupper: tidlig oppregulert (1), sent oppregulert (2), tidlig nedregulert (3) og downregulated sent (4). Figur 2C. Venn-diagram for antall distribusjon av tidlige responsive miRNAs og sent responsive miRNAs. Den røde delen betegner androgen-resonsive mirnas med respons skjedde utelukkende på et tidlig stadium, betegner den blå delen mirnas med responsen utelukkende på sent stadium, og den lilla delen betegner mirnas med respons både på tidlige og sene stadier. Figur 2D. Forut ER berikelse i tidlige og sene responsive miRNA gener. Ares er i ± 10 kb sekvenser som flankerer 5»-start stedet for pre-miRNAs.
For å vurdere påliteligheten av tiden discriminator
τ
undersøkte vi mirnas «differensial uttrykk profil og analysert ER berikelse forskjell mellom tidlige og sene responsive miRNAs. Profilen til androgen-responsive mirnas «differensial ekspresjon observeres ved å anvende som en ikke-konservativ kriterium for å illustrere dette uttrykket. På fig. 2B, tiden discriminator «8 h» klart skiller tidligfase og sent-respons etapper. Følgelig, gruppert vi mirnas i 4 grupper: tidlig oppregulert, sent oppregulert, tidlig nedregulert og sen nedregulert (Fig 2B som en demonstrasjon.). Noen androgen responsive mirnas har differensial uttrykk både i de tidlige og sene stadier, og andre bare har differensial uttrykk enten ved tidlig eller sent stadium alene. Fig. 2C viste fordelingen av tidlige responsive 83 mirnas (11 mirnas i rødt utelukkende har tidlig respons), slutten responsive 126 mirnas (54 mirnas i blå utelukkende har sen respons), samt 72 mirnas er krysset (i lilla). Figuren er i form av Venn-diagram [22]. Vi deretter analysert ER enrichments for tidlig og sen responsive miRNAs. Det er naturlig å forvente at gener direkte regulert av AR (f.eks de tidlig-responsive gener) vil ha høyere ER berikelse. Oppstrøms 10 kb og nedstrøms 10 kb av 5′-start stedet for pre-miRNA ble undersøkt for å søke AR-bindingsseter (ARBSs). Genomatix database [23] ble brukt til å påvise Ares, herunder antatt og validert androgen reseptor (AR) og glukokortikoid reseptor (GR) responsive elementer, som vist i tabell S1 av Arkiv S1. Antatte ER antall av androgen-responsive mirnas er illustrert i fig. 2D. Det er åpenbart at ER enrichments for tidlig-responsive mirnas er betydelig større enn sen-responsive de (
p
0,01, Suppl.1), som underbygger rasjonalitet tid discriminator
τ
.
identifisere Kandidat mirnas at AR Primært mål
For å identifisere mirnas som sannsynligvis direkte regulert av AR, så vel som å spille en viktig rolle som formidler AR nettverk, vi foreslått og beregnet en ny statistikk , Response score (RS) for hver androgen-responsive miRNA. Figur 3A viser RS fordelingen av androgen-responsive miRNAs. mirnas med RS verdier i de 10% er teoretisk identifisert som AR primære mål. RS terskelen for miRNA er 22, derfor 15 mirnas (8 trykt og 7 indusert) ble teoretisk identifisert som kandidat.
figur 3A. RS distribusjon av androgen-responsive miRNAs. miRNA tall i henhold til forskjellige RS verdier er presentert, betegner den stiplede linjen terskelen for å identifisere AR kandidat primære målet miRNAs. Figur 3B. RT-PCR-analyse for identifisert AR kandidat målet miRNAs. Brett endring av DHT-behandlede LNCaP celler enn kontrollprøvene ble presentert med betydning vurdering (i denne studien *: p 0,05; **: p 0,01; ***: p 0,001). Ganger endring i kontrollprøvene ble ansett som en for alle RT-PCR-analyser i denne studien. Dette tallet er RT-PCR-analyse av mirnas på 40 min av DHT stimulering. Figur 3C. Prinsippskisse av MIR-133b, MIR-19a, og MIR-27a-er plassering i de 5 «og 3» regioner. De horisontale piler indikerer den omtrent ER steder. Figur 3D. ChIP analysen av AR-bindende for kandidat målene for miR133b, miR19a, miR27a. «IgG» fungerer som negativ kontroll for ChIP analysen.
Slik velger mirnas med romanen biologisk betydning for følgende dyptgående undersøkelse, brukte vi GenMAPP å analysere påvirket trasé for hver kandidat, avhengig av veien berikelse for de antatte målet mRNA som også var androgen-responsive. I denne studien ble mirnas «spådd mål levert av miRDB database [24], hvis genom-wide miRNA mål prediksjon ble utført med en nyutviklet bioinformatikk verktøy, MirTarget2 [25]. MirTarget2 algoritme basert på støtte vektor maskiner (SVMer) og microarray trening datasett, det viste høyere selektivitet ved å identifisere downregulated gener sammenlignet med andre algoritmer. Når du utfører GenMAPP, ble trasé med z≥1.96 anses som vesentlig. Blant de identifiserte kandidat AR primære målet mirnas, MIR-19a, MIR-27a og MIR-133B, ble funnet med betydelige pathway enrichments i kritiske cellulære prosesser (Tabell S2 i File S1). Disse 3 mirnas vedvarende betydelig oppregulering over hele tidsforløpet ifølge microarray data, og vi validert sine uttrykk data med RT-PCR-analyse. Vi valgte microarray prøven ved 40 min for miRNA RT-PCR-analyse siden 3 mirnas viste uttrykk endring så tidlig som 40 min i microarray eksperiment. RT-PCR-produktet var overensstemmende med mikroarray data (Fig. 3B). I det følgende studerte vi mekanismene for MIR-19a, MIR-27a og MIR-133b i formidling AR signale til PCa kreftutvikling.
Bekrefter AR er Bindingen til MIR-19a, MIR-27a og MIR-133b
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) analyser ble utført for å bekrefte AR-binding til de predikerte Ares av de valgte 3 miRNAs. Vi brukte Genomatix databasen [23] for å oppdage Ares i oppstrøms og nedstrøms 15 kb av pre-miRNA er 5′-start stedet. Ares med «kjerne Likhet = 1» ble valgt for ChIP analyse validering, som representerer den høyeste kampen mellom target DNA-sekvensen og Åres konserverte baser. Ares oppdaget i oppstrøms og nedstrøms områder av MIR-19a, MIR-27a og MIR-133b, henholdsvis, ble illustrert i fig. 3C. Basert på chip analyseresultatene, fant vi at behandling av 10 nM DHT i LNCaP celler for 4 timer, resulterte i en betydelig AR-binding til kromatin av spådd Ares i MIR-19a, MIR-27a og MIR-133b, sammenlignet med kontrollene (fig. 3D). QPCR-analyse av KLK3 promoter (tjener som positiv kontroll for AR-binding), og XBP-1-promoteren (tjener som den negative kontroll for AR-binding) ble vist i figur S2 i File S1. Fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
