Abstract
Bakgrunn
Highly sensitive og spesifikke urinbaserte tester for å påvise enten primære eller residiverende blærekreft har vist seg unnvikende til dags dato. Vår stadig økende kunnskap om genomisk avvik i blærekreft bør muliggjøre utvikling av slike tester basert på urin DNA.
Metoder
DNA ble ekstrahert fra urin celle pellets og PCR brukt til å forsterke regionene av
TERT
arrangøren og koding regioner av
FGFR3
,
PIK3CA
,
TP53
,
HRAS
,
KDM6A Hotell og
RXRA
som ofte mutert i blærekreft. PCR-produktene ble strekkodet, samlet og paret-end 2 x 250 bp sekvensering utført på en Illumina MiSeq. Urin DNA ble analysert fra 20 ikke-kreft kontroller, 120 primærblærekreftpasienter (41 PTA, 40 PT1, 39 pT2 +) og 91 pasienter med blærekreft etter TURBT (89 kreft-fri).
Resultater
til tross for de små mengder av DNA ekstrahert fra noen urin cellepelleter, 96% av prøvene ga bety lese dybder 500. Analyse bare tidligere rapportert punktmutasjoner,
TERT
mutasjoner ble funnet hos 55% av pasienter med blærekreft (uavhengig av scenen),
FGFR3
mutasjoner i 30% av pasienter med blærekreft,
PIK3CA
i 14% og
TP53
mutasjoner i 12% av pasienter med blærekreft. Samlet er disse tidligere rapporterte blære kreft mutasjoner ble påvist i 86 av 122 pasienter med blærekreft (70% sensitivitet) og i bare 3 av 109 pasienter uten påvisbare blærekreft (97% spesifisitet).
Konklusjon
Denne enkle, kostnadseffektiv tilnærming kunne brukes til ikke-invasiv overvåking av pasienter med ikke-muskel-invasiv blærekreft som bærer disse mutasjonene. Fremgangsmåten har en lav DNA-inngang krav og kan påvise lave nivåer av mutant-DNA i et stort overskudd av normal DNA. Disse genene representerer en minimal biomarkør panel som ekstra markører kan legges for å utvikle en svært følsom diagnostisk test for blærekreft
Citation. Ward DG, Baxter L, Gordon NS, Ott S, Savage RS, Beggs AD , et al. (2016) Multiplex PCR og Next Generation Sequencing for ikke-invasiv påvisning av blærekreft. PLoS ONE 11 (2): e0149756. doi: 10,1371 /journal.pone.0149756
Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), SPANIA
mottatt: 21 september 2015; Godkjent: 04.02.2016; Publisert: 22 februar 2016
Copyright: © 2016 Ward et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Andelen av mutant leser ble brukt som input for alle grafer, sensitivitet, spesifisitet, etc., og disse blir presentert for hvert locus i hver prøve i S2 Tabell
Finansiering:. Dette prosjektet ble finansiert av en Wellcome Trust følge on-fond tilskudd administrert av University of Birmingham. BCPP er finansiert av Cancer Research UK, University of Birmingham og Birmingham og The Black Country og West Midlands Nord- og Sør Omfattende Lokal forskningsnettverk, og sponset av University of Birmingham. Den BCPP biospecimen Samlingen er støttet av midler fra Birmingham ECMC. DGW er finansiert av en filantropisk donasjon til University of Birmingham i støtte av blærekreft forskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : NGS, neste generasjons sekvensering; UBC, urothelial blærekreft; NMIBC, ikke-muskel invasiv blærekreft; MIBC, muskel-invasiv blærekreft
Innledning
Fleksibel cystoskopi, kombinert med urin cytologi, er gullstandarden tilnærming for å oppdage svulster i blæren. Langsiktig overvåking for tilbakefall etter behandling er både belastende for pasienter og dyrt for helsepersonell. Det har lenge vært å håpe at en test basert på molekyler slippes ut i urinen ved kreftceller kan redusere avhengigheten av cystoskopi, men oppdaterte tilstrekkelig sensitive og spesifikke tester har ikke blitt utviklet og tatt i bruk av klinikere [1].
Eksisterende urin biomarkører for blærekreft som NMP22 og BTA mangler følsomhet for lav grad av sykdom og kan være falskt forhøyet på grunn av ikke-maligne tilstander og hematuri [1]. Stor innsats har blitt brukt på å oppdage urin biomarkører for ikke-invasiv påvisning av blærekreft med særlig suksess oppnås måle tumorspesifikke nukleinsyre varianter [2,3,4]. Siste genomisk og transcriptomic forsøk har vist at lav grad NMIBC og CIS /HG-NMIBC /MIBC har forskjellige mutasjoner og genuttrykk profiler og at selv innenfor finnes NMIBC betydelig heterogenitet (anmeldt i [5]). Dermed virker det sannsynlig at et panel av biomarkører som fanger mangfoldet av UBC vil være nødvendig å pålitelig oppdage sykdommen.
Urinprøver basert på DNA viser betydelige løftet for ikke-invasiv påvisning av UBC. I teorien, hvis tumor-DNA er tilstede, kan bli forsterket ved PCR og kreft-spesifikke forandringer detektert. To av de hyppigst muterte gener i blærekreft med pek-mutasjon hotspots er
FGFR3 product: [6] og
TERT product: [7,8,9,10]. Begge har vært vurdert som biomarkører for påvisning av blærekreft i urin DNA i separate studier [7,11,12], men de har ikke blitt kombinert i et NGS-baserte analysen.
TERT
promoter er mutert hos omtrent 65% av blæren svulster uavhengig av stadium og grad [13] og representerer den beste enkelt biomarkør for blærekreft med en fersk rapport fra 62% sensitivitet på 90% spesifisitet for påvisning av primær blære svulster [7].
Vi har nå utviklet en analyse som bruker høy-gjennomløp dyp-sekvensering av de regionene i seks UBC forbundet gener som inneholder mutasjon hotspots og analysert urin DNA fra 232 pasienter til å vurdere det evne til å non-invasiv oppdage UBC. Teoretisk skal dyp sekvensering pålitelig oppdage selv meget lave nivåer av tumor-DNA i et stort overskudd av ikke-tumor-DNA. Videre er denne teknologien modnes til et punkt der det blir en rutine prosedyren fra kliniske genetiske testlaboratorier.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle prøver ble oppnådd etter skriftlig informert samtykke og godkjennelse av de aktuelle britiske nasjonale forskningsetiske gjennomgang boards (nasjonale forskningsetiske service referanser angitt nedenfor); signert samtykkeerklæringer ble holdt innenfor enkelte pasientfiler, med samtykke dokumentert i de aktuelle studie databaser.
UBC og ikke-UBC pasienter ble samlet inn som en del av blærekreft Prognose Programme, BCPP (NRES Committee East Midlands- Derby: 06 /MRE04 /65), som innlemmet potensielle biospecimen samling for biomarkør forskning
En annen urin (NRES Committee North West-Haydock. 15 /NW /0079) ble foretatt fra pasienter som gjennomgår overvåkings følgende TURBT for NMIBC
pasienter
Urin ble samlet inn fra tre grupper av pasienter. «non-UBC», «UBC «og» post-UBC». UBC og ikke-UBC pasienter ble samlet inn som en del av West Midlands «blærekreft Prognose program, 2005-11 (BCPP, beskrevet i detalj her: [14]). I korthet, ble midtstrøms urin (20-50 ml), oppsamlet ved tidspunktet for diagnose fra pasienter med cystoscopic funn indikerer primær blærekreft; urin ble sentrifugert og pelleten og supernatanten lagres ved -80 ° C. Etter prøvetaking, hver pasient gjennomgikk TURBT og endelig diagnose ved histopatologisk undersøkelse av resected vev. Siden primær blære
carcinoma in situ plakater (CIS) er en sjelden lesjon i BCPP kohorten og andre steder [15], pasienter med primær CIS ble ekskludert som vi ikke har tilstrekkelig antall til å kunne trekke gyldige konklusjoner. Noen pasienter rekruttert til BCPP og som ga urinprøver ble senere diagnostisert med ikke-maligne urologiske tilstander, og er inkludert i studien som «ikke-UBC «pasienter.
Separat, en annen potensiell urin samlingen ble gjennomført i West Midlands i løpet av 2012 fra en uavhengig gruppe av 91 pasienter som gjennomgår overvåkings følgende TURBT for NMIBC, og benytte samme urin protokollen. Med unntak av 2 pasienter, alle pasientene var sykdomsfri på dato for urin samling ( «post-UBC-gruppen). De 2 pasienter med tilbakevendende sykdom ble tilsatt til UBC-gruppen. Påfølgende cystoskopi data var tilgjengelig for 38 av de 89 «post-UBC» pasienter, og viste ingen ytterligere tilbakefall på et gjennomsnitt på 8 måneder. DNA ble ekstrahert fra urin pellet ved hjelp av urin DNA-isolasjonssett for eksfolierte celler og bakterier (NorgenBiotek.com) og eluert i 100 ul avionisert vann.
PCR og barcoding
En enkelt multipleks PCR-amplifikasjon ble brukt til å forsterke 16 amplikonene i
TERT
arrangøren og koding regioner av
FGFR3
,
PIK3CA
,
TP53
,
HRAS
,
RXRA Hotell og
KDM6A plakater (primer sekvenser i S1 tabell). PCR-metoden ble tilpasset fra Allory
et al product: [7] som
TERT
promoter regionen er vanskelig å forsterke og innledende forsøk ved hjelp av flere andre polymeraser mislyktes. PCR-amplifikasjoner besto av 9 ul DNA, 10 ul KAPA2G Robust DNA Polymerase (KapaBiosystems) og 1 pl av primere (0,2 pM slutt for hver primer). PCR programmet var: 95 ° C i 3 minutter, 35 x 95 ° C i 15s, 60 ° C i 15s, 72 ° C i 15 s etterfulgt av 3 min ved 72 ° C (primersekvenser er anordnet i tilleggsinformasjon, S1 Tabell ). PCR-produktene ble fortynnet 1/100 med avionisert vann og 10 bp strekkoder lagt til av en annen 15 syklus PCR bruker KAPA2G Robust DNA Polymerase og enkelt retning tilgang array-strekkoder for Illumina sequencere (Fluidigm).
Sekvensering og dataanalyse
De strekkode PCR produktene ble blandet og rengjøres med AMPure perler. De sammenslåtte amplikonene ble deretter blandet 7: 3 med pHix (Illumina), denaturert og gruppert på 18:00 på en Miseq 500 syklus flow-celle og sekvensert (250 sykluser frem, 10 sykluser strekkode, 250 sykluser omvendt). Raw sporingsfiler ble behandlet med cutadapt (versjon 1.8.1, Python 2.6.6) i paret slutt modus for å fjerne adapter sekvenser, og å filtrere ut parene med en sekvens 100 nt å ekskludere korte lese gjenstander. Lokale justeringer av lyder til hg19 genomet ble utført ved hjelp bowtie2 (versjon 2.2.4) i paret slutt modus. SAM justerings filene ble konvertert til BAM-filer, sortert og indeksert ved hjelp samtools (versjon 0.1.19). BAM filene ble behandlet med bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount), minimum basen kvalitetskrav satt til 0
